南瓜葉黃素基因緊密連鎖的InDel分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

摘要：本研究旨在開發(fā)與中國(guó)南瓜（Cucurbita moschata Duch.）葉黃素含量的數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait locus，QTL）緊密連鎖且實(shí)用性強(qiáng)的分子標(biāo)記，以加速南瓜的育種進(jìn)程。前期在F2代群體中定位到與葉黃素含量緊密連鎖的主效QTL位點(diǎn)qlut11-a，在其兩側(cè)翼分子標(biāo)記R1_38695和R2_55819之間開發(fā)了8對(duì)InDel分子標(biāo)記。通過對(duì)F2代群體及部分高代（F8代）重組自交系株系進(jìn)行基因型和葉黃素表型分析，明確了InDel分子標(biāo)記G005310和G005670可有效篩選高葉黃素含量和低葉黃素含量材料，并在近等基因系構(gòu)建中證實(shí)了其能用于創(chuàng)制高葉黃素含量的南瓜種質(zhì)，BC5F1果實(shí)中的最高葉黃素含量約是低葉黃素含量親本果實(shí)含量的2.8倍，且占高葉黃素含量親本果實(shí)的96%。本研究結(jié)果為加速南瓜高葉黃素含量種質(zhì)育種進(jìn)程提供了更實(shí)用的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：南瓜；葉黃素；QTL定位；HPLC測(cè)定；InDel分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S642.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）02-0348-11

Development and application of closely linked InDel molecular markers of lutein gene in Cucurbita moschata Duch.

XU Ying-chao1，ZHANG Si-cheng1，2，XUE Shu-dan1，LIU Jia-li1，ZHU Ji-tong1，MENG Qi-tao1，LIN Hui-jing1，NIE Cheng-rong2，ZHONG Yu-juan1

（1.Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables， Guangzhou 510640， China;2.School of Horticulture， Foshan University of Science and Technology， Foshan 528231， China）

Abstract：To accelerate the breeding progress of Cucurbita moschata Duch. （C. moschata）， the study aimed to develop molecular markers which are tightly linked with quantitative trait locus （QTL） of lutein content in C. moschata and are highly practicable. Eight pairs of insertion-deletion （InDel） molecular markers were developed between the two flanking molecular markers R1_38695 and R2_58819， based on the previous localization of the primary QTL locus qlut11-a which was tightly linked to lutein content in F2 population. Genotype analysis and phenotypic analysis of lutein content for the F2 population and recombinant inbreed lines （RILs） in part of the high generation （F8） revealed that， InDel molecular markers G005310 and G005670 could be used to effectively screen materials with high and low lutein contents. Furthermore， the two InDel molecular markers were proved to be able to culture pumpkin germplasms with high lutein content in the construction of near isogenic line （NIL）. The highest lutein content in BC5. F1 fruit was about 2.8 times as high as the lutein content in parent fruit with low lutein content， and the lutein content in BC5F1 fruit accounted for about 96% of the lutein content in parent fruit with high lutein content. The research results can provide more practical molecular markers for accelerating breeding process of pumpkin germplasms with high lutein content.

Key words：pumpkin;lutein;QTL localization;HPLC determination;InDel molecular marker

南瓜是葫蘆科南瓜屬的重要菜糧兼用作物。中國(guó)南瓜（Cucurbita moschata）、印度南瓜（Cucurbita maxima）、美洲南瓜（Cucurbita pepo）[1]是中國(guó)主要的南瓜栽培品種。其中，中國(guó)南瓜是中國(guó)種植面積最大的南瓜栽培種，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。類胡蘿卜素是一類天然色素，不僅影響果實(shí)的外觀顏色，還影響果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。自然界中存在著600多種類胡蘿卜素[2]，主要包括葉黃素、新黃素、巖藻黃素、紫黃素[3]。紫黃素、葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素是中國(guó)南瓜果實(shí)中主要的類胡蘿卜素。β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素賦予果實(shí)橙色，葉黃素賦予果實(shí)黃色。類胡蘿卜素在植物生長(zhǎng)過程中，能削弱光氧化損傷、促進(jìn)葉綠體膜形成、調(diào)控代謝及促進(jìn)傳粉[4-6]。類胡蘿卜素是植物激素（脫落酸和獨(dú)腳金內(nèi)酯）的合成前體，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控[7]。動(dòng)物自身不能合成類胡蘿卜素，需要從外界攝取，但它在動(dòng)物體內(nèi)具有多種功能，它是維生素A的合成前體，在抗氧化、抗癌和免疫方面發(fā)揮重要作用。葉黃素在一定程度上具有預(yù)防心血管硬化、冠心病和腫瘤等疾病的功效[8]，對(duì)老年視力下降等也有一定程度的改善作用[9]。葉黃素是瓜果和蔬菜的重要品質(zhì)成分，也是人體所需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，選育高葉黃素含量的果蔬具有重要意義。

目前，簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）、插入缺失 （Insertion deletion，InDel）、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Kompetitive allele specific PCR，KASP）、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是常見的分子標(biāo)記。其中，InDel分子標(biāo)記具有密集、穩(wěn)定、可重復(fù)且成本低廉的特點(diǎn)[10]，無論在動(dòng)物還是植物基因組中都密集分布且范圍較廣[11]，被廣泛用于基因定位[12]、高密度遺傳圖譜構(gòu)建[13]、雜交種子純度鑒定[14-15]、植物遺傳多樣性分析[16]等。InDel分子標(biāo)記在辣椒[17]、菜心[18]、菜豆[19]、黃瓜[20-21]、西瓜[22-23]、南瓜[24]等果蔬中被廣泛應(yīng)用。在美洲南瓜中，Zhu等[25]開發(fā)了7個(gè)InDel和2個(gè)SNP分子標(biāo)記對(duì)其莖稈深綠基因進(jìn)行精細(xì)定位。邱悅菡[26]在對(duì)中國(guó)南瓜芋香味相關(guān)代謝物解析過程中，找到1個(gè)與芋香味相關(guān)的InDel分子標(biāo)記。Abbas等[27]開發(fā)了2個(gè)與開花節(jié)位相關(guān)的InDel分子標(biāo)記（InDel2507和InDel6146），可有效預(yù)測(cè)中國(guó)南瓜雌花節(jié)位數(shù)。王曼曼等[28]開發(fā)了6個(gè)KASP分子標(biāo)記、9個(gè)InDel分子標(biāo)記和112個(gè)SNP分子標(biāo)記，對(duì)中國(guó)南瓜中蔗糖葡萄糖比值性狀的定位區(qū)間進(jìn)行加密，篩選與蔗糖葡萄糖比值相關(guān)的候選基因。Harel-Beja等[29]利用甜瓜重組近等基因系群體，構(gòu)建甜瓜果實(shí)性狀的高密度遺傳圖譜，開發(fā)了與糖及類胡蘿卜素含量相關(guān)的InDel分子標(biāo)記。Liu等[30]通過對(duì)白色西瓜與黃色西瓜的雜交后代進(jìn)行混池測(cè)序分析（Bulk segregant analysis，BSA），定位到與葉黃素相關(guān)的位點(diǎn)，并圍繞該位點(diǎn)開發(fā)了InDel分子標(biāo)記，可有效區(qū)分高葉黃素含量和低葉黃素含量的西瓜種質(zhì)。綜上，在其他葫蘆科作物中已有關(guān)于類胡蘿卜素含量的InDel分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用研究，但目前在中國(guó)南瓜中開發(fā)的InDel分子標(biāo)記，主要與芋香味、開花節(jié)位和蔗糖葡萄糖比值相關(guān)，還未見與葉黃素含量相關(guān)的分子標(biāo)記的開發(fā)研究和報(bào)道。

本研究基于前期在中國(guó)南瓜F2代群體中對(duì)葉黃素?cái)?shù)量性狀座位（QTL）的定位結(jié)果[31]，結(jié)合中國(guó)南瓜基因組信息及親本CMO-1（高葉黃素含量）和CMO-97（低葉黃素含量）的深度重測(cè)序數(shù)據(jù)，擬開發(fā)與葉黃素QTL緊密連鎖的InDel位點(diǎn)InDel-5310和InDel-5670，其對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記分別為G005310和G005670，并在F2代群體、36個(gè)高代（F8代）重組自交系群體及近等基因系群體創(chuàng)制中驗(yàn)證該分子標(biāo)記的有效性和應(yīng)用性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所使用的南瓜品種均為中國(guó)南瓜：CMO-1（P1）為高葉黃素含量的多代自交系，CMO-97（P2）為低葉黃素含量的多代自交系，以這2個(gè)葉黃素含量極端株系為父母本通過雜交構(gòu)建F1代株系，用F1代株系自交獲得200個(gè)F2代單株與36個(gè)中國(guó)南瓜高代自交系材料（F8代），分別以CMO-1和CMO-97作為供體親本和輪回親本的近等基因系，以上試驗(yàn)材料均在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)基地種植。

1.2葉黃素含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[32]的方法測(cè)定南瓜果肉的葉黃素含量。具體操作如下：

（1）高效液相色譜（High performance liquid chromatography， HPLC）系統(tǒng)：儀器型號(hào)為Waters e2696HPLC（Waters， USA）；分析色譜柱型號(hào)為Waters Spherisorb 5 μm ODS2 4.6 mm×250.0 mm；流動(dòng)相為100%的A液[乙腈∶0.1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）∶甲醇=84∶14∶2， 體積比]，保持15 min，然后在線性梯度下以1.2 ml/min的流速逐漸轉(zhuǎn)換至100%的B液（甲醇∶醋酸乙酯=68∶32， 體積比），保持10 min。

（2）將授粉50 d的南瓜果實(shí)去皮去瓤，將果肉切片后放入冷凍干燥機(jī)中干燥后研磨成粉。取20 mg樣品粉末，加入適量丙酮，渦旋混勻15 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min；使用0.45 μm濾膜過濾離心后的上清液，用HPLC檢測(cè)其中類胡蘿卜素的含量。

（3）以進(jìn)樣葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度作為X軸，HPLC峰面積作為Y軸，繪制葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程。

（4）通過葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)果肉中葉黃素的含量進(jìn)行定量計(jì)算。

1.3試驗(yàn)材料DNA提取

南瓜P1、P2、F1代、200個(gè)F2代、36個(gè)高代（F8代）自交系材料及高代回交重組自交系群體（Advanced generation backcross populations）BC5F1材料的單株幼嫩葉片的DNA用改良十六烷基三甲基溴化銨法（Hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）提取，DNA的濃度和純度通過超微量分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，將DNA濃度調(diào)至相同，并保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4InDel位點(diǎn)篩選和引物設(shè)計(jì)

以葉黃素在F2代群體QTL位點(diǎn)qlut11-a的兩側(cè)翼分子標(biāo)記為InDel分子標(biāo)記開發(fā)區(qū)間，結(jié)合兩親本全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)（http：//cucurbitgenomics.org/v2/）及中國(guó)南瓜基因組序列信息，對(duì)區(qū)間內(nèi)基因的InDel突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，在區(qū)間內(nèi)基因起始密碼子上游2 000 bp查找在親本中含有5～25 bp差異的變異位點(diǎn)，提取突變位點(diǎn)上下游各150 bp的序列，并使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物長(zhǎng)度設(shè)定為17～24 bp，G+C含量為40%～60％，解鏈溫度（Tm）為52～60 ℃。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5基因型檢測(cè)及分析

1.5.1試劑配制

1.5.1.18%聚丙烯酰胺凝膠50 ml注膠液[77.14 g丙烯酰胺，2.66 g N，N-二叉雙丙烯酰胺，用100 ml 10×緩沖液（Tris borate EDTA buffered solution，TBE）溶解，用雙蒸水（ddH2O）定容至1 L]、500 μl 10%過硫酸銨及20 μl 四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-Tetramethylethylenediamin，TEMED）。

1.5.1.20.1%染色液與顯色液0.5 g AgNO3，用500 ml ddH2O溶解成0.1%染色液；10 g NaOH，0.2 g Na2CO3，用500 ml ddH2O溶解成顯色液。

1.5.2PCR擴(kuò)增及電泳

1.5.2.1PCR擴(kuò)增體系（10.0 μl）正反向引物各0.5 μl，DNA模板0.3 μl，2×Taq PCR StarMix 5.0 μl，ddH2O 3.7 μl。

1.5.2.2PCR擴(kuò)增步驟94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5.2.3電泳配制8%聚丙烯酰胺凝膠，160 V電壓，運(yùn)行2 h。電泳后先用0.1%染色液染色，再用顯色液顯色，最后于燈箱上拍照保存。

1.5.3帶型數(shù)據(jù)分析根據(jù)母本（CMO-1，P1）、父本（CMO-97，P2）和F1代的PCR擴(kuò)增后電泳的條帶分布來確定引物特異性，以父本、母本、F1代的條帶為參考標(biāo)準(zhǔn)，與P1相同的帶型記為“AA”，與P2相同的帶型記為“BB”，同時(shí)具有P1和P2的帶型記為“AB”。

2結(jié)果與分析

2.1南瓜親本、F1代及F2代果實(shí)葉黃素含量的測(cè)定分析

對(duì)母本CMO-1（P1）、父本CMO-97（P2）及F1代果實(shí)的果肉進(jìn)行顏色觀察，發(fā)現(xiàn)P1果肉顏色偏向黃色、P2果肉顏色偏向橙色、F1代果實(shí)果肉的顏色介于P1和P2之間（圖1a）。對(duì)南瓜果肉總類胡蘿卜素含量進(jìn)行測(cè)定，比較兩親本P1、P2及F1代果肉的葉黃素含量差異，P1果肉葉黃素含量峰值在三者中最高，P2果肉實(shí)際葉黃素含量在三者中最低，而F1代果肉葉黃素含量峰值高于P2且接近P1（圖1b）。

為了明確南瓜果肉葉黃素含量的性狀屬于數(shù)量性狀還是質(zhì)量性狀，以兩親本及F1代的葉黃素含量數(shù)據(jù)為參考，對(duì)HPLC測(cè)定的南瓜F2代群體葉黃素含量數(shù)據(jù)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。由圖2可知，在較低葉黃素含量范圍內(nèi)有17個(gè)單株表型與父本相同，在高葉黃素含量范圍內(nèi)具有母本和F1代2種表型，其中大部分群體葉黃素含量處于父本和母本之間，極少數(shù)單株的葉黃素含量表現(xiàn)出高于母本或者低于父本的超親現(xiàn)象。條形圖的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，葉黃素含量呈現(xiàn)連續(xù)的數(shù)量變異，頻率分布為單峰，符合正態(tài)分布。

2.2InDel位點(diǎn)檢測(cè)與引物設(shè)計(jì)

在前期的F2代群體中發(fā)現(xiàn)，中國(guó)南瓜葉黃素含量相關(guān)的數(shù)量性狀基因座位點(diǎn)qlut11-a位于17號(hào)染色體，該位點(diǎn)最高表型貢獻(xiàn)率為20.20%～22.00%（R1_18324的貢獻(xiàn)率為22.00%），最大似然對(duì)數(shù)比（Logarithm of odds，LOD）為6.84，區(qū)間距離為68.53～74.14 Mb[31]，以分子標(biāo)記R2_55819和R1_38695之間作為開發(fā)區(qū)間。在父母本中檢測(cè)該區(qū)間內(nèi)所有基因啟動(dòng)子區(qū)域有5～25 bp片段的插入或缺失的差異位點(diǎn)，作為InDel位點(diǎn)。最終通過比對(duì)分析共篩選到8個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)在父母本中有5～25 bp片段的插入或缺失，即8個(gè)InDel 位點(diǎn)（表1）。在這8個(gè)InDel突變位點(diǎn)兩端各取約150 bp堿基序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，開發(fā)InDel分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的引物（表2）。

2.3InDel標(biāo)記對(duì)應(yīng)引物的特異性和多態(tài)性分析

使用在突變位點(diǎn)兩端開發(fā)的8對(duì)引物，分別以P1（CMO-1）、P2（CMO-97）和F1代為擴(kuò)增模板，進(jìn)行RCR擴(kuò)增及電泳檢驗(yàn)，分析引物的有效性和多態(tài)性。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，G005310、G005350、G005380、G005490、G005670、G005770和G005790分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的引物在母本、父本和F1代中均能有效地?cái)U(kuò)增出多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為87.5%。其中分子標(biāo)記G005310和G005670對(duì)應(yīng)引物的多態(tài)性和清晰度最好。為了分析InDel分子標(biāo)記G005310和G005670是否可用于篩選高葉黃素含量和低葉黃素含量的材料，在200個(gè)F2代群體株系和36個(gè)高代（F8代）自交系材料中進(jìn)行基因型檢驗(yàn)，結(jié)合葉黃素含量表型分析這2個(gè)分子標(biāo)記的有效性。

2.4F2代群體中的InDel分子標(biāo)記的基因型和表型鑒定

在200個(gè)F2代群體中分別用InDel分子標(biāo)記G005310和G005670對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。部分F2代群體、P1、P2和F1代中2個(gè)分子標(biāo)記的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4a和圖4b所示。F2代群體中有CMO-1（P1）、CMO-97（P2）、F1代對(duì)應(yīng)的3種帶型，其中P1的帶型（AA）對(duì)應(yīng)果肉中葉黃素含量較高；P2的帶型（BB）對(duì)應(yīng)果肉中葉黃素含量較低；F1代的帶型表示果肉中葉黃素含量偏向P1的高葉黃素含量（AB），在F2代群體中InDel分子標(biāo)記G005310和G005670對(duì)應(yīng)的引物檢測(cè)的基因帶型結(jié)果一致（圖4a、4b）。對(duì)F2代群體的基因型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，P1帶型（AA）多分布在高葉黃素含量的區(qū)域，在低葉黃素含量區(qū)域分布較少；P2帶型（BB）多分布在低葉黃素含量的區(qū)域，在高葉黃素含量區(qū)域分布較少；而F1代帶型（AB）更多偏向于親本P1帶型所分布區(qū)域（圖4c）。P1帶型（AA）的占比隨葉黃素含量的升高先增加后減少，P2帶型（BB）的占比整體上隨葉黃素含量的降低而增加。綜上，InDel分子標(biāo)記G005310和G005670在較大概率上可有效篩選F2代群體中高葉黃素含量和低葉黃素含量的株系，且這2對(duì)引物在對(duì)F2代群體葉黃素含量鑒定方面表現(xiàn)出連鎖性。

為明確2個(gè)InDel分子標(biāo)記G005310和G005670在解釋F2代群體中葉黃素含量表型方面的準(zhǔn)確度，在F2代群體中隨機(jī)挑選29個(gè)株系，進(jìn)行基因型和葉黃素含量表型的統(tǒng)計(jì)。對(duì)比F2代群體29個(gè)株系中2對(duì)引物鑒定的基因型結(jié)果（表3）與HPLC測(cè)定的葉黃素含量（表4）后發(fā)現(xiàn)，用這2對(duì)引物鑒定的29個(gè)單株基因型與HPLC測(cè)定數(shù)據(jù)的表型基本一致。在檢測(cè)的29株F2代群體株系中，除了編號(hào)為154的株系，其余株系的基因型為BB時(shí)，葉黃素的含量與P2相近，基因型為AA或者AB時(shí)，葉黃素的含量明顯高于P2，說明InDel分子標(biāo)記G005310和G005670在部分F2代群體中，鑒定高葉黃素含量和低葉黃素含量材料的準(zhǔn)確度約為96.6%。綜上所述，根據(jù)InDel位點(diǎn)InDel-5310和InDel-5670設(shè)計(jì)的引物具有高度多態(tài)性，并與葉黃素表型具有良好的基因型匹配性，可用于篩選高葉黃素含量和低葉黃素含量的材料。

2.5InDel標(biāo)記在南瓜高代（F8代）自交系材料中的表型和基因型的鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證InDel分子標(biāo)記可篩選高葉黃素含量和低葉黃素含量的材料，用InDel標(biāo)記G005310和G005670對(duì)應(yīng)的引物對(duì)36個(gè)南瓜高代（F8代）自交系材料進(jìn)行葉黃素基因型的鑒定。圖5a和圖5b分別為InDel分子標(biāo)記G005310和G005670對(duì)應(yīng)引物在P1、P2、F1代和36個(gè)南瓜高代（F8代）自交系材料的鑒定帶型。在鑒定的36個(gè)南瓜高代（F8代）自交系材料中InDel分子標(biāo)記G005310和G005670表現(xiàn)出相同的基因帶型（圖5）。對(duì)這2對(duì)分子標(biāo)記鑒定的基因型結(jié)果與HPLC測(cè)定的葉黃素含量表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除編號(hào)為N24的株系，其余南瓜高代（F8代）自交系材料的基因型為AA時(shí)，葉黃素含量與高葉黃素含量親本（P1）接近，當(dāng)基因型為BB時(shí)，葉黃素含量與低葉黃素含量親本（P2）接近（表5），說明InDel分子標(biāo)記G005310和G005670在36個(gè)南瓜高代自交系中，鑒定高葉黃素含量和低葉黃素含量材料的準(zhǔn)確度約為97.2%。以上試驗(yàn)結(jié)果說明，本研究利用InDel分子標(biāo)記G005310和G005670開發(fā)的引物多態(tài)性強(qiáng)、連鎖度高、葉黃素含量表型解釋度高，可有效區(qū)分高葉黃素含量和低葉黃素含量的材料。

2.6InDel標(biāo)記在南瓜葉黃素含量相關(guān)的近等基因系群體中創(chuàng)制高葉黃素含量材料的應(yīng)用

針對(duì)InDel位點(diǎn)InDel-5310和InDel-5670開發(fā)的分子標(biāo)記可用于以高葉黃素含量材料CMO-1（P1）和低葉黃素含量材料CMO-97（P2）作為供體親本和輪回親本近等基因系的構(gòu)建。InDel分子標(biāo)記G005310和G005670均可將BC5F1群體分成2種基因型，一種是與低葉黃素含量親本材料CMO-97（P2）相同的基因型BB，一種是同時(shí)有高葉黃素含量親本材料CMO-1（P1）和低葉黃素含量親本材料CMO-97（P2）的基因型AB。后續(xù)將以這2個(gè)分子標(biāo)記均鑒定到基因型為AB的材料進(jìn)行輪回親本（CMO-97背景）鑒定。選擇同時(shí)滿足輪回親本背景及高葉黃素含量前景的4株材料，繼續(xù)進(jìn)行BC5F2的群體構(gòu)建。分別收取供體親本CMO-1（P1）、輪回親本CMO-97（P2）及近等基因系BC5F1的果實(shí)進(jìn)行葉黃素含量測(cè)定，如表6所示，BC5F1的4個(gè)果實(shí)的葉黃素含量均高于低葉黃素含量親本CMO-97（P2），值得注意的是，BC5F1中最高葉黃素含量的果實(shí)葉黃素含量約是低葉黃素含量親本（CMO-97）果實(shí)葉黃素含量的2.8倍，且BC5F1葉黃素含量最高的果實(shí)葉黃素含量約占高葉黃素含量親本果實(shí)葉黃素含量的96%，接近高葉黃素含量親本果實(shí)的葉黃素含量。說明本研究開發(fā)的與葉黃素含量相關(guān)的InDel分子標(biāo)記G005310和G005670能夠成功篩選及創(chuàng)制高葉黃素含量的南瓜種質(zhì)。

3討論

本研究對(duì)以中國(guó)南瓜葉黃素極端含量株系CMO-1和CMO-97為親本構(gòu)建的F2代群體進(jìn)行了葉黃素含量的QTL定位[31]，利用中國(guó)南瓜基因組序列信息與兩親本的深度重測(cè)序數(shù)據(jù)，在最高表型解釋概率位點(diǎn)的兩側(cè)翼分子標(biāo)記R2_55819和R1_38695之間，在兩親本中共找到8個(gè)堿基數(shù)目相差5～25 bp的InDel突變位點(diǎn)，選取該位點(diǎn)兩端各150 bp設(shè)計(jì)引物，在設(shè)計(jì)的8對(duì)引物中，有7對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰的多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為87.5%，高于孟霖等[33]報(bào)道的23.5%，這主要由于開發(fā)的InDel標(biāo)記總數(shù)少，選擇的突變位點(diǎn)位于最高解釋概率位點(diǎn)的兩側(cè)翼，與葉黃素含量緊密連鎖，因此得到較高的多態(tài)性結(jié)果。李斯更等[34]在黃瓜中開發(fā)了InDel分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定和遺傳育種分析。張圣平等[35]基于黃瓜果實(shí)的苦味與不苦2個(gè)親本品種的重測(cè)序數(shù)據(jù)，開發(fā)了1對(duì)InDel分子標(biāo)記，該標(biāo)記與苦味基因Bt連鎖，可應(yīng)用于黃瓜材料的苦味檢測(cè)，檢測(cè)正確率為94.8%。本研究開發(fā)與南瓜果肉葉黃素含量緊密相關(guān)的InDel位點(diǎn)InDel-5310和InDel-5670，鑒定F2代群體高葉黃素含量和低葉黃素含量材料的準(zhǔn)確度約為96.6%，鑒定多代（F8代）重組自交系高葉黃素含量和低葉黃素含量的正確率均為97.2%。

InDel分子標(biāo)記除了用于鑒定不同種質(zhì)資源外，還可以進(jìn)行種質(zhì)資源創(chuàng)制。周艷朝等[36]以醋栗番茄LA2093為供體親本，栽培番茄Jina為受體親本，結(jié)合InDel分子標(biāo)記，構(gòu)建了與開花相關(guān)的BC3F1群體材料。鄧?yán)诘萚37]在玉米中利用InDel分子標(biāo)記（ZmMATE1、ZmMATE2、MateF2和ALMT93496）進(jìn)行耐鋁主效基因選擇及鑒定，篩選出穩(wěn)定耐鋁的玉米種質(zhì)。程朝平等[38]將在dep1外顯子上設(shè)計(jì)的InDel分子標(biāo)記用于在回交群體（BC1F1和BC2F1）中篩選dep1基因的純合株系，創(chuàng)制了直立型密穗水稻。郭廣君等[39]開發(fā)了3個(gè)與辣椒抗黃瓜花葉病毒抗性基因qCmr2.1緊密連鎖的分子標(biāo)記，創(chuàng)制了抗黃瓜花葉病毒的種質(zhì)資源。本研究利用InDel位點(diǎn)InDel-5310和InDel-5670開發(fā)的分子標(biāo)記G005310和G005670篩選經(jīng)過多代回交的葉黃素含量最高的材料，BC5F1果實(shí)中最高的葉黃素含量約是低葉黃素含量親本（CMO-97）果實(shí)的2.8倍，且BC5F1葉黃素含量最高的果實(shí)中的葉黃素含量約占高葉黃素含量親本果實(shí)的96%，十分接近。以上結(jié)果表明，本研究開發(fā)的InDel分子標(biāo)記G005310和G005670可應(yīng)用于創(chuàng)制高葉黃素含量的南瓜種質(zhì)資源。

近年來，國(guó)內(nèi)外在瓜類中通過正向遺傳分析獲得了少數(shù)類胡蘿卜素合成途徑的酶基因和與貯藏相關(guān)的基因。在黃瓜果肉中，β-胡蘿卜素受類胡蘿卜素羥化酶基因CsaBCH1控制[40]。在甜瓜中，利用重組自交系（Recombinant inbred lines，RIL）獲得白果肉的主效QTL位點(diǎn)及其候選基因CmPPR1[41-42]。在玉米中，通過類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的InDel功能標(biāo)記，驗(yàn)證了番茄紅素合成相關(guān)基因在類胡蘿卜素合成途徑中的重要作用[43]。周莉[44]在橘色甜瓜果肉和白綠色甜瓜果肉β-胡蘿卜素含量測(cè)定和類胡蘿卜素裂解相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因（CmCCD1）在橘色果肉甜瓜中的表達(dá)高于白綠色果肉甜瓜，此外，趙軍林等[45]發(fā)現(xiàn)PDS和LCY-b也參與甜瓜的類胡蘿卜素代謝調(diào)控。葫蘆和野生西瓜中PSY和β-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）參與類胡蘿卜素裂解通路，最終促進(jìn)嫁接果實(shí)中番茄紅素的積累[46]。Luo等[47]通過測(cè)定與類胡蘿卜素裂解通路相關(guān)的基因在印度南瓜不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)葉黃素和β-胡蘿卜素含量與LCY-e和β-胡蘿卜素水解酶基因（CHYb）表達(dá)密切相關(guān)。本研究前期通過高葉黃素含量親本CMO-1與低葉黃素含量親本CMO-97雜交構(gòu)建F2代群體，在F2代群體中對(duì)葉黃素含量進(jìn)行QTL分析，在17號(hào)染色體上定位到與葉黃素含量緊密相關(guān)的QTL位點(diǎn)qlut11-a，對(duì)該位點(diǎn)開發(fā)的InDel分子標(biāo)記G005310和G005670可有效區(qū)分高葉黃素含量和低葉黃素含量的南瓜材料，在本研究的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建近等基因系群體，對(duì)葉黃素含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位，并挖掘相關(guān)基因，將成為未來研究的一個(gè)重點(diǎn)方向。

綜上，本研究基于前期F2代群體中葉黃素含量QTL定位結(jié)果，對(duì)定位區(qū)間開展進(jìn)一步的研究。具體來說，我們開發(fā)了分子標(biāo)記來進(jìn)一步明確QTL定位區(qū)間，并驗(yàn)證了這個(gè)區(qū)間的有效性。首先，根據(jù)南瓜基因組序列及親本深度重測(cè)序信息，在最高解釋概率位點(diǎn)的兩側(cè)翼分子標(biāo)記R1_38695和R2_55819之間開發(fā)了8對(duì)InDel引物，在P1、P2和F1代中對(duì)8對(duì)InDel引物進(jìn)行了特異性及多態(tài)性分析，明確了InDel分子標(biāo)記G005310和G005670對(duì)應(yīng)引物的多態(tài)性和清晰度最好。然后，用這2個(gè)分子標(biāo)記對(duì)F2代群體株系及部分高代（F8代）重組自交系材料進(jìn)行基因型分析，結(jié)合葉黃素含量表型數(shù)據(jù)，證明這2個(gè)分子標(biāo)記可以有效區(qū)分高葉黃素含量和低葉黃素含量材料。最后，在與葉黃素含量相關(guān)的近等基因系的構(gòu)建中，證實(shí)了這2個(gè)分子標(biāo)記可用于創(chuàng)制高葉黃素含量的南瓜材料。因此，本研究開發(fā)的G005310和G005670是與葉黃素含量緊密連鎖的InDel分子標(biāo)記，可有效地應(yīng)用于高葉黃素含量和低葉黃素含量材料的篩選和高葉黃素含量材料的創(chuàng)制，可為南瓜中葉黃素含量的分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]林德佩. 南瓜植物的起源和分類[J]. 中國(guó)西瓜甜瓜，2000（1）：36-38.

[2]FRASER P D， BRAMLEY P M. The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids[J]. Progress in Lipid Research，2004，43（3）：228-265.

[3]李福枝，劉飛，曾曉希，等. 天然類胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28（9）：227-232.

[4]GROTEWOLD E. The genetics and biochemistry of floral pigments[J]. Annual Review of Plant Biology，2006，57：761-780.

[5]COE K M， ELLISON S， SENALIK D， et al. The influence of the Or and Carotene Hydroxylase genes on carotenoid accumulation in orange carrots [Daucus carota （L.）][J]. Theoretical and Applied Genetics，2021，134：3351-3362.

[6]RAMEL F， BIRTIC S， GINIES C， et al. Carotenoid oxidation products are stress signals that mediate gene responses to singlet oxygen in plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（14）：5535-5540.

[7]WALTER M H， STRACK D. Carotenoids and their cleavage products： biosynthesis and functions[J]. Natural Product Reports，2011，28（4）：663-692.

[8]FIEDOR J， BURDA K. Potential role of carotenoids as antioxidants in human health and disease[J]. Nutrients，2014，6（2）：466-488.

[9]ROTONDO DOTTORE G， IONNI I， MENCONI F， et al. Antioxidant effects of β-carotene， but not of retinol and vitamin E， in orbital fibroblasts from patients with Graves’ orbitopathy （GO）[J]. Journal of Endocrinological Investigation，2018，41：815-820.

[10]FELTUS F A， WAN J， SCHULZE S R， et al. An SNP resource for rice genetics and breeding based on subspecies indica and japonica genome alignments[J]. Genome Research，2004，14（9）：1812-1819.

[11]馮芳君，羅利軍，李熒，等. 水稻InDel和SSR標(biāo)記多態(tài)性的比較分析[J]. 分子植物育種，2005，3（5）：725-730.

[12]ZHANG S P， MIAO H， CHENG Z C， et al. The Insertion-deletion （Indel） marker linked to the fruit bitterness gene （bt） in cucumber[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，2011，19（4）：649-653.

[13]趙湘，于拴倉，薛林寶，等. 利用SSR和InDel標(biāo)記構(gòu)建白菜×蕪菁分子遺傳圖譜[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（12）：111-115.

[14]張志剛，趙智中，李巧云，等. 大白菜InDels標(biāo)記開發(fā)及其在剩余雜合體鑒定中的應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，24（4）：510-518.

[15]楊易，黎庭耀，李國(guó)景，等. 基于重測(cè)序的長(zhǎng)豇豆基因組InDel標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2022，49（4）：778-790.

[16]LI Y H， WEN C L， WENG Y Q. Fine mapping of the pleiotropic locus B for black spine and orange mature fruit color in cucumber identifies a 50 kb region containing a R2R3-MYB transcription factor[J]. Theoretical and Applied Genetics，2013，126（8）：2187-2196.

[17]郭廣君，孫茜，劉金兵，等. 基于辣椒基因組重測(cè)序的InDel標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（6）：1400-1406.

[18]LI G H， CHEN H C， LIU J L， et al. A high-density genetic map developed by specific-locus amplified fragment （SLAF） sequencing and identification of a locus controlling anthocyanin pigmentation in stalk of Zicaitai （Brassica rapa L. ssp. chinensis var. purpurea）[J]. BMC Genomics，2019，20：1-13.

[19]XU K， ZHU J L， GUO N， et al. A novel 7-base pair deletion at a splice site in MS-2 impairs male fertility via premature tapetum degradation in common bean （Phaseolis vulgaris L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2023，136（3）：56.

[20]CHEN Y， WEN H F， PAN J， et al. CsUFO is involved in the formation of flowers and tendrils in cucumber[J]. Theoretical and Applied Genetics，2021，134：2141-2150.

[21]SUN Y H， LI X Z， MA Z Y， et al. Quantitative trait locus mapping of fruit aroma compounds in cucumber （Cucumber sativus L.） based on a recombinant inbred line population[J]. Horticulture Research，2022，9：151.

[22]TIAN S W， ZHANG J， ZHAO H， et al. Production of double haploid watermelon via maternal haploid induction[J]. Plant Biotechnology Journal，2023，21（7）：1308.

[23]ZHANG J， GUO S G， JI G J， et al. A unique chromosome translocation disrupting ClWIP1 leads to gynoecy in watermelon[J]. The Plant Journal，2020，101（2）：265-277.

[24]鄒劍鋒. 中國(guó)南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性SSR和InDel標(biāo)記分析[D]. 佛山：佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2020.

[25]ZHU L， WANG Y， ZHANG Z L， et al. Chromosomal fragment deletion in APRR2-repeated locus modulates the dark stem color in Cucurbita pepo[J]. Theoretical and Applied Genetics，2022，135（12）：4277-4288.

[26]邱悅菡. 南瓜芋香味性狀相關(guān)代謝物與分子基礎(chǔ)初步解析[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[27]ABBAS H M K， ZHOU Y Y， HUANG H X， et al. QTL mapping， whole genome resequencing， and marker-assisted selection provide basics of early flowering in pumpkin[J]. Plant Breeding，2022，141（2）： 266-276.

[28]王曼曼，屈淑平，黃河勛，等. 南瓜含糖量相關(guān)QTL的標(biāo)記加密及候選基因預(yù)測(cè)[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，34（11）：2407-2415.

[29]HAREL-BEJA R， TZURI G， PORTNOY V， et al. A genetic map of melon highly enriched with fruit quality QTLs and EST markers， including sugar and carotenoid metabolism genes[J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，121：511-533.

[30]LIU S， LIU M Q， CAO Y， et al. Identification of chromosome region and candidate genes for canary-yellow flesh （Cyf） locus in watermelon （Citrullus lanatus）[J]. Plant Science，2023，329：111594.

[31]ZHONG Y J， ZHOU Y Y， LI J X， et al. A high-density linkage map and QTL mapping of fruit-related traits in pumpkin （Cucurbita moschata Duch.） [J]. Scientific Reports，2017，7（1）：12785.

[32]ABBAS H M K， HUANG H X， WANG A J， et al. Metabolic and transcriptomic analysis of two Cucurbita moschata germplasms throughout fruit development[J]. BMC Genomics，2020，21：1-13.

[33]孟霖，劉博，林良斌，等. 白菜型油菜和菜薹的InDel標(biāo)記開發(fā)及其RILs群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2012，39（8）：1491-1500.

[34]李斯更，沈鏑，劉博，等. 基于黃瓜基因組重測(cè)序的InDel標(biāo)記開發(fā)及其應(yīng)用[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（2）：278-283.

[35]張圣平，苗晗，程周超，等. 黃瓜果實(shí)苦味（Bt）基因的插入缺失（Indel）標(biāo)記[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19（4）：649-653.

[36]周艷朝，蔣芳玲，孫敏濤，等. 醋栗番茄LA2093漸滲系的構(gòu)建及花序相關(guān)性狀QTL分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，31（6）：1-8.

[37]鄧?yán)冢私鹦l(wèi)，楊文鵬，等. 利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)創(chuàng)制耐鋁玉米種質(zhì)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，52（4）：908-915.

[38]程朝平，劉成德，楊德衛(wèi)，等. 分子標(biāo)記輔助選擇秈型直立恢復(fù)系[J]. 分子植物育種，2011，9（5）：561-566.

[39]郭廣君，朱雪梅，潘寶貴，等. 利用InDel分子標(biāo)記輔助選育辣椒抗黃瓜花葉病毒病種質(zhì)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，37（5）：1251-1261.

[40]QI J J， LIU X， SHEN D， et al. A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity[J]. Nature Genetics，2013，45（12）：1510-1515.

[41]TZURI G， ZHOU X J， CHAYUT N， et al. A ‘golden’ SNP in CmOr governs the fruit flesh color of melon （Cucumis melo）[J]. The Plant Journal，2015，82（2）：267-279.

[42]GALPAZ N， GONDA I， SHEM-TOV D， et al. Deciphering genetic factors that determine melon fruit quality traits using RNA-Seq based high resolution QTL and eQTL mapping[J]. The Plant Journal，2018，94（1）：169-191.

[43]馮發(fā)強(qiáng)，王國(guó)華，王青峰，等. 甜玉米類胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因PSY1，LCYE和CrtRB1的功能分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（5）：36-42.

[44]周莉. 不同變種甜瓜果實(shí)香氣， 顏色及相關(guān)的CmCCD1基因表達(dá)的研究[D]. 天津：天津大學(xué)，2013.

[45]趙軍林，于喜艷，王秀峰 .橙色果肉甜瓜β-胡蘿卜素積累的分子機(jī)理[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（5）：7-11.

[46]KONG Q S， YUAN J X， GAO L Y， et al. Transcriptional regulation of lycopene metabolism mediated by rootstock during the ripening of grafted watermelons[J]. Food Chemistry，2017，214：406-411.

[47]LUO Y S， WANG C J， WANG M M， et al. Accumulation of carotenoids and expression of carotenoid biosynthesis genes in fruit flesh during fruit development in two Cucurbita maxima inbred lines[J]. Horticultural Plant Journal，2021，7（6）：529-538.

（責(zé)任編輯：陳海霞）