不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦生長性能及免疫功能的影響

摘 要：該試驗通過在飼料中添加不同濃度的賴氨酸，探究其對紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）幼蝦生長性能和免疫功能的影響。該試驗選取健康、初始體質量為（0.45±0.32）g的紅螯螯蝦為試驗對象，共900尾，分為5個試驗組（A～E），每組設3個重復。配制賴氨酸的不同添加量為1.3%、1.6%、1.9%、2.2%、2.5%的等氮、等能的5種配合飼料，進行為期8周的飼養試驗。試驗結果顯示，與其他各組相比，D組（2.2%）達到最大值；終末體質量、增重率和特定生長率有顯著差異（P＜0.05）；血清中HEM、ALB、GLB、肝胰腺中AKP、ACP和免疫基因ALF、LZM、CHH、SPI的基因表達水平D組達到最大值，差異顯著（P＜0.05）；血清和肝胰腺中的ALT、AST活性D組達到最小值，差異顯著（P＜0.05）。試驗結果表明，紅螯螯蝦飼料中最適的賴氨酸添加量為1.75%～2.05%。

關鍵詞：賴氨酸；紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）；生長性能；免疫功能

中圖分類號：S966.12文獻標志碼：A

氨基酸是蛋白質的基本組成單位。蛋白質在機體的吸收方式是其進入體內后，被降解為小分子肽或游離性氨基酸經腸道吸收，從而可表明蝦蟹動物對于蛋白質和氨基酸具有同樣的營養需求[1]。賴氨酸為蝦蟹動物體內必需氨基酸，通常視為是蝦蟹動物的第一或第二類限制性氨基酸和重要的蛋白質組成，被稱為“生長性氨基酸”，若飼料中賴氨酸含量不足，會造成蝦蟹類動物的生長緩慢和飼料利用率不高[2]。目前，國內外學者對克氏原螯蝦[3]、凡納濱對蝦[4]、中華絨螯蟹[5]等蝦蟹動物賴氨酸的需求量進行了相關研究。并且目前未見到有關紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）飼糧賴氨酸水平的相關報道，確定紅螯螯蝦幼蝦專用飼料賴氨酸添加量是文章的主要研究內容。

紅螯螯蝦又稱澳洲淡水小龍蝦，屬于節肢動物門、擬螯蝦科動物。原產澳大利亞，是一種淡水經濟蝦[6]。紅螯螯蝦具有低脂肪高蛋白，適應性和抗病力強等特點，并且該紅螯螯蝦有較高的營養價值，具備較大的市場潛力。紅螯螯蝦喜暗怕光，白天隱匿，夜間活動，善于爬行，不善于在水中游行，攝食廣泛，屬于雜食性動物，且蛻皮間隔時間會隨著個體的生長而延長[7]。該研究利用劑量效應法，探討飼糧賴氨酸水平對紅螯螯蝦的生長性能、飼料利用率以及免疫功能的影響，為紅螯螯蝦幼蝦專用飼料提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以味精蛋白、菜粕、葵花粕、花生粕為蛋白源，磷脂油為脂肪源，面粉和米糠為糖源，纖維素為填充物，配制蛋白質水平25%，脂肪水平為6%的半純合飼料（表1）。飼料添加不同水平的賴氨酸并相應減少非必需氨基酸和纖維素制成等氮、等能的5種配合飼料，賴氨酸的添加量為：1.3%、1.6%、1.9%、2.2%、2.5%，并將其分為A，B，C，D，E五組。其中各組飼料賴氨酸的實測值分別是1.15%、1.46%、1.75%、2.05%、2.27%，占飼料蛋白的4.60%、5.84%、7.00%、8.20%、9.08%（表2）。將試驗飼料原料粉碎過60目篩，按配方稱重，混合均勻，壓制成粒徑為1.5 mm，干燥后放入4 ℃冰箱備用。

1.2 飼養管理

紅螯螯蝦蝦苗來自吉林省公主嶺市藍谷水產農民專業合作社，飼養試驗在吉林省公主嶺市稻漁科技小院（吉林省公主嶺市南崴子村，東經：124.82°，北緯：43.50°）的溫棚帆布養殖池（400 cm×120 cm×80 cm）進行。飼養開始前預飼4周，24 h不間斷充氧，循環過濾。水溫在24℃～29℃，氨氮＜0.3 mg/L，亞硝酸鹽＜0.05，溶解氧5 mg/L～10mg/L，pH值6.5～7.5。預飼結束后，挑選個體健康，附肢健全且活躍性靈敏的紅螯螯蝦幼蝦，初始體質量為（0.45±0.32）g。試驗時間為2022年7月8日至9月2日進行，通過8周的養殖完成了試驗的養殖階段。試驗過程中投喂堅持“四定”的原則，分2次投喂（7：00，18：00）。日投飼量為體質量的3%～5%，其中早上飼喂量占日投飼量的30%；下午飼喂量占日投飼量的70%。每周換水1次，每次換水1/4～1/3，保證養殖水體的水質清新，每天記錄養殖箱中蝦的攝食情況，觀察蝦的活動狀態。

1.3 生長指標計算

增重率（%）WGR=100%×（終末均重－初始均重）/初始均重

成活率（%）SR=100%×實驗結束蝦尾數/實驗開始蝦尾數

飼料效率（%）FE=（終末蝦總重+死亡蝦總重－初始體質量）/攝食量

特定生長率（%/day）SGR=100%×[ln（終末均重）－ln（初始均重）]/試驗天數

蛋白質沉積率（%）PPV=（終末體質量×終末蝦蛋白含量－初始體質量×初始蝦蛋白含量）/（飼料攝取量×飼料蛋白含量）×100%

肝體比（%）HSI=（肝胰腺濕重/體質量）×100%

蛋白質效率（%）PER=蝦體凈增重/（飼料攝入量×飼料蛋白質含量）×100%

1.4 血液生化指標的測定

獲得的血清用于測定總蛋白（考馬斯亮藍法）、白蛋白（微板法）、球蛋白（免疫比濁法）、谷草轉氨酶（微板法）、谷丙轉氨酶（微板法）和血漿銅藍蛋白（比色法）。通過試劑盒法進行測定，血清生化指標測定均按照南京建成生物公司研究所提供的方法進行。

1.5 免疫酶活力的測定

組織勻漿后得到的上清液用于肝胰腺的谷草轉氨酶（微板法）、谷丙轉氨（微板法）、酸性磷酸酶（分光光度計法）、堿性磷酸酶（微板法）、總超氧化物歧化酶（羥胺法）的酶活力測定。

1.6 基因表達的測定

反轉錄得到的cDNA通過熒光定量PCR測定相關基因的表達水平。以肌動蛋白β-actin為內參基因，用PefectStart@ Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒進行測定。PCR反應體系包含2×PefectStart@ Green qPCR SuperMix（10 μL），上下游引物和cDNA 為0.4 μL，dd H2O為8.8 μL。PCR反應條件為預變性（94℃，30 s）；40個循環（94℃，5 s；60℃，30 s）。試驗的反應體系和反應條件完全按照試劑盒的相關說明進行操作。

引物設計及合成。在GenBank中查找目的基因序列并進行引物的設計，各引物模板如下所示（見表3）。

總RNA的提取檢測、反轉錄及cDNA的合成。提取肌肉及肝胰腺組織總RNA，通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的質量，通過超微量分光光度計檢測RNA濃度和質量。根據提取的RNA濃度取RNA 50 ng～2 μg之間，按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix FastKing一步法除基因組cDNA，第一鏈合成預混試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

實驗結果采用平均數±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析。經單因素方差分析法，采用Duncan多重比較法進行多重比較，若存在顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果

2.1 不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦生長及飼料利用率的影響

賴氨酸水平D組（2.2%）的特定生長率、增重率、終末體質量達到最大值，且這三個指標隨著飼糧賴氨酸濃度的上升，也呈上升趨勢，顯著高于其他各組（P＜0.05）。通過數據表明若賴氨酸濃度進一步提高，上述指標均有一定程度的下降趨勢。肉重比、肝體比、成活率以及飼料系數影響差異不顯著（P＞0.05）（見表4）。

通過對飼糧賴氨酸水平（實測值）與紅螯螯蝦幼蝦增重率進行了二次回歸分析得出飼料中賴氨酸水平和增重率的回歸方程為：y=-484.831x ＋1971.21x－747.86，其中x表示飼糧賴氨酸水平（%），y表示增重率（%）（見圖1）。根據二次回歸分析結果與方差分析綜合分析得出紅螯螯蝦幼蝦最大增重率的最適賴氨酸水平范圍為1.75%～2.05%。

2.2 不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦血液生化指標的影響

HEM、ALB、GLB的活性隨著賴氨酸濃度的提高而升高，當賴氨酸濃度達到D組（2.2%）后體現為下降趨勢，其中D組顯著高于其他各組（P＜0.05）。ALT、AST的活性隨著賴氨酸濃度的升高而降低，當賴氨酸濃度達到最適濃度后體現為上升趨勢，D組顯著低于其他各組（P＜0.05）（見表5）。

2.3 不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦代謝、免疫酶活力的影響

ALT和AST的活性均隨著賴氨酸濃度的提高而降低，當賴氨酸濃度達到最適濃度后出現上升趨勢，D組顯著高于其他各組（P＜0.05）。而AKP、ACP的活性隨著賴氨酸的濃度的升高而上升，當賴氨酸濃度達到最適濃度后體現為下降趨勢，D組顯著高于其他各組（P＜0.05）。LZM隨賴氨酸水平的升高而上升，且E組顯著高于其他各組（P＜0.05）（見表6）。

2.4 不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦肝胰腺組織免疫基因的影響

抗脂多糖因子（ALF）、溶菌酶（LZM），甲殼類高血糖激素（CHH）、絲氨酸蛋白酶抑制劑（SPI）的基因表達水平均呈先升高后降低的趨勢，且D組的ALF和LZM、CHH、SPI值均高于其他各組（P＜0.05）。其中E組HEM基因水平顯著高于其他各組（P＜0.05）（見圖2）。

3 討論

3.1 飼糧中不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦生長及飼料利用的影響

通過對飼料氨基酸組成結果的分析可知，賴氨酸作為飼料氨基酸的唯一變量，除賴氨酸外，其他氨基酸各組間均不顯著。大量研究表明，缺乏賴氨酸時會導致蝦蟹利用率下降，生長緩慢，其對蝦蟹的生長、代謝等均有至關重要的作用[8-11]。該試驗中的賴氨酸添加量為2.05%時，增重率和特定生長率達到最大值，超過2.05%時，出現負增長。飼料系數在2.05%時達到最小值，此時的飼料利用率最大，超過2.05%時，飼料系數增加。由此可知，當飼料中賴氨酸的水平不足時會使蛋白質利用性下降，致使氨基酸平衡被打破，進而影響紅螯螯蝦的生長發育以及飼料利用率。

3.2 不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦血液生化指標的影響

張微微等[3]研究表明，隨著飼料中賴氨酸添加量的提高，克氏原螯蝦血液中紅細胞比容顯著增加，血藍蛋白含量也呈增加趨勢。該試驗中賴氨酸水平的升高顯著提高了紅螯螯蝦蝦體中血藍蛋白含量，與克氏原螯蝦上所得結果相似。牛小天等[12]研究表明，隨著飼料中賴氨酸添加水平的提高，勃氏雅羅魚血清中ALB、GLB含量受到賴氨酸水平的影響呈“上升-下降”趨勢，ALT、AST的活性均受賴氨酸水平影響呈先降低后升高趨勢。該試驗血清中ALB、GLB的活性逐漸升高，達到最大值后出現負增長，而ALT、AST的活性隨著賴氨酸濃度的升高而降低，與牛小天等的研究結果相同。由此可知，飼料中適宜的賴氨酸添加量有可能提高紅螯螯蝦的機體免疫力。

3.3 不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦代謝、免疫酶活力的影響

AKP和ACP是研究水產動物重要的生理、病理和毒理學指標，在免疫反應中發揮作用，這兩者均能反映相應組織或器官的生理病理狀態，是動物溶酶體酶的重要組成部分[13]。熊偉[14]試驗表明飼料中添加適量賴氨酸對菲牛蛭腸道中AKP、ACP酶活性有一定的促進作用。該試驗中隨著賴氨酸水平的升高，AKP和ACP的活性在添加量為2.05%時，達到峰值后開始下降，這與熊偉的試驗結果相似。由此可知，飼料中賴氨酸添加量為2.05%時，對紅螯螯蝦幼蝦免疫酶活有顯著影響。

3.4 不同賴氨酸水平對紅螯螯蝦幼蝦肝胰腺組織免疫基因的影響

ALF是蝦蟹中重要的抗菌肽類，其在先天免疫系統中起著重要作用[15]。LZM是一種堿性酶，具有抗菌、消炎、抗病毒的作用[16]。CHH以及SPI在甲殼動物的脂質代謝、抗應激能力以及凝血、補體活化、感染、細胞遷移等多個方面中起著重要的調節作用，也是生物體內免疫系統的重要組成部分[17-18]。該試驗結果表明，飼料中添加不同賴氨酸水平顯著升高了ALF、LZM、CHH、SPI的基因表達水平，與其他各組相比，2.2%組達到最大值。由此可知，添加適量的賴氨酸水平能提高幼蝦肝胰腺組織免疫基因的表達，增強幼蝦肝胰腺組織的免疫功能。

4 結論

試驗結果表明，飼料中添加1.75%～2.05%的賴氨酸對紅螯螯蝦幼蝦生長性能和免疫方面均有顯著影響。

參考文獻：

[1]楊鳳.動物營養學[M].北京：中國農業出版社，1993.

[2]王雪，熊偉，姚俊杰，等.配合飼料添加賴氨酸對菲牛蛭生長及水蛭素活性的影響[J].貴州農業科學，2018，46（5）：88-91.

[3]張微微，徐維娜，王瑩，等.飼料中賴氨酸水平對克氏原螯蝦生長、體組成與消化酶活性的影響[J].中國水產科學，2013，20（2）：402-410.

[4]郭旭，戴習林，華雪銘，等.發酵豆粕部分替代魚粉后凡納濱對蝦對賴氨酸的需求量[J].水產學報，2021，45（6）：910-919.

[5]葉金云，王友慧，郭建林，等.中華絨螯蟹對賴氨酸、蛋氨酸和精氨酸的需要量[J].水產學報，2010，34（10）：1541-1548.

[6]秦高嬋，陳紅林，儲天琪，等.不同生長時期紅螯螯蝦肌肉和肝胰腺內氨基酸和脂肪酸變化分析[J].漁業科學進展，2021，42（6）：84-92.

[7]彭張華.澳洲淡水小龍蝦繁育技術的探究[J].海洋與漁業（水產前沿），2016（11）：4.

[8]周小秋，楊鳳，周安國.水生動物賴氨酸營養研究進展[J].四川農業大學學報，2002（2）：172-176.

[9]周凡，邵慶均.賴氨酸在魚飼料中的應用的研究進展[J].糧食與飼料工業，2008（5）：42-44.

[10]李正民，胡吉卉，閻斌倫.賴氨酸對水產動物生長性能影響研究進展[J].科學養魚，2022（2）：68-69.

[11]唐黎標.賴氨酸在魚類飼料中的應用[J].漁業致富指南，2011（19）：25-26.

[12]牛小天，左亞南，張家松，等.飼料中賴氨酸水平對勃氏雅羅魚生長、飼料利用、血液生化指標、賴氨酸代謝酶活性及相關基因表達的影響[J].水產學報，2019，43（10）：2154-2165.

[13]柳旭東，張利民，王際英，等.鹽度對水產動物組織中酶活力的影響[J].養殖與飼料，2008（11）：68-71.

[14]熊偉.賴氨酸添加對菲牛蛭生長和抗凝酶活性影響研究[D].貴陽：貴州大學，2018.

[15]佚名.中國科學院海洋研究所[J].高科技與產業化，2013（1）：94-97.

[16]戴廣政.中波紫外線對大鼠的免疫毒性研究[D].銀川：寧夏醫科大學，2014.

[17]雷易果，陳兆明，王偉.墨吉明對蝦高血糖激素基因FmCHH-I的分子鑒定和表達特征[J].廣東海洋大學學報，2022，42（5）：38-44.

[18]裘智勇，張志芳，葉夏裕，等.絹絲昆蟲蛋白酶抑制劑研究進展[J].生物技術通報，2002（1）：26-29.

The effect of different lysine levels on the growth performance and immune function of juvenile Cherax quadricarinatus

YUAN Haiyan LI Kuochen LIU Hongjian YANG Liang ZHANG Ruixue HOU Yulin ZHOU Jingxiang WANG Qiuju

Abstract：This experiment investigates the effects of adding different concentrations of lysine to feed on the growth performance and immune function of Cherax quadricarinatus. This experiment selected 900 healthy Cherax quadricarinatus with an initial weight of （0.45 ± 0.32） g as the experimental subjects， divided into 5 experimental groups （A-E）， each with 3 replicates. Five types of formula feed with different amounts of lysine added： 1.3%， 1.6%， 1.9%， 2.2%， and 2.5% of equal nitrogen and equal energy were prepared for an 8-week feeding experiment. The experimental results showed that compared with other groups， Group D（2.2%） reached its maximum value. There were significant differences in final body weight， weight gain rate， and specific growth rate （Plt;0.05）. The gene expression levels of HEM， ALB， GLB in serum， AKP， ACP in liver and pancreas， and immune genes ALF， LZM， CHH， and SPI in group D reached their maximum values， with significant differences （Plt;0.05）; The activity of ALT and AST in serum and hepatopancreas in group D reached the minimum value， with significant differences （Plt;0.05）. In summary， this article recommends that the optimal amount of lysine added to Cherax quadricarinatus feed is 1.75% -2.05%.

Keywords： lysine; Cherax quadricarinatus; growth performance; immune function

基金項目：吉林省科技廳項目（編號：20210202036NC）。

作者簡介：袁海延（1991-），女，吉林省水產技術推廣總站助理工程師。主要從事漁業養殖技術工作。E-mail：787804815@qq.com。

通信作者：王秋舉（1985-），女，吉林農業大學動物科學技術學院副教授。研究方向：甲殼動物營養與免疫。E-mail：wangqiuju0439@163.com。