石榴TCP基因家族的生物信息學與表達分析

摘要： TCP是植物特有轉錄因子家族之一，參與植物的葉發育、花發育、分枝發育、芽的休眠、果實的成熟及花色苷的生物合成等生長發育過程。本研究以石榴基因組數據和轉錄組數據為材料，分析了石榴TCP基因家族成員的理化性質、系統進化關系、保守結構域、基因結構和表達情況。結果表明，石榴基因組有22個TCP基因，TCP蛋白氨基酸長度在221～644 aa之間，蛋白分子量為23.23～70.76 ku。石榴TCP基因可分為ClassⅠ（PCF）和ClassⅡ（CYC/TB1和CIN） 兩大類。大多數PgTCP基因無內含子。CIN亞族成員 "PgTCP1、PgTCP3、PgTCP4、PgTCP5 "含有miR319 調控位點。 "PgTCP1和PgTCP3 "在葉片中表達量高， "PgTCP1和PgTCP14 "在花中表達量高。 "PgTCP22 "在果皮發育中表達量降低， "PgTCP2和PgTCP5 "在外種皮發育中表達量降低。該研究結果可為石榴TCP家族基因功能研究，探索TCP調控石榴果實發育及品質形成提供參考，為石榴的分子育種提供科學依據。

關鍵詞： 石榴；TCP轉錄因子；基因家族分析；基因表達；生物信息學

中圖分類號：S665.401 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）01-0041-08

TCP（TEOSINTE BRANCHED 1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTORS）蛋白是植物特有的一類轉錄因子，參與芽的休眠［1］、葉片發育［2-3］、根和毛狀體的形成［4］、花序的發育［5］、節間的伸長［2］、花色苷的生物合成［6-7］和果實成熟［7-10］等諸多生物學過程。目前，模式植物中已鑒定出大量TCP基因，但不同物種間TCP家族成員的數量與功能存在差異。在桃上的研究表明， "PpTCP20 "定位在細胞核中，可形成一個同源二聚體， "PpTCP20通過負調控PpDAM5和PpDAM6 "的表達，來調控桃花芽的休眠［1］。在柳枝稷中，共鑒定到41個TCP基因，分布在18條染色體上，所有的TCP基因均含有TCP保守結構域，并分為2個亞族。表達分析結果表明，16個TCP基因在花序和嫩枝中高表達［11］。在葡萄中鑒定到18個VvTCP基因，分布在11條染色體上。系統發育和基因結構分析結果表明，VvTCP基因可分為ClassⅠ和ClassⅡ，ClassⅡ可進一步分為CIN亞類和CYC/TB1亞類。RNA-Seq和qRT-PCR分析結果表明：11個VvTCP基因在果實發育中表達下調，1個VvTCP基因在果實發育中表達上調。推測大部分VvTCP基因可能參與了葡萄果實早期發育。此外，旱澇脅迫可抑制大多數VvTCP基因的表達［10］。在二倍體野草莓中鑒定到19個FvTCP基因。系統發育分析結果表明，FvTCP基因可分為兩大類，ClassⅡ又分為2個亞類。啟動子分析結果表明，該基因家族啟動子上含有大量的激素和脅迫反應相關的順式作用元件。通過分析FvTCP基因在不同組織和果實發育階段的表達模式表明，12個FvTCP基因組織特異性表達。11個FvTCP基因在果實發育中表達下調，5個FvTCP基因表達上調。亞細胞定位分析結果表明，6個FvTCP-GFP融合蛋白定位在原生質體中。將 "FvTCP9 "在野草莓果實中的瞬時表達，可顯著影響一系列與果實發育和成熟相關的基因［8］。蘋果上的研究表明， "MdTCP46 "是蘋果強光誘導的花青素合成的正調控因子。強光處理后，可誘導 "MdTCP46 "表達，延遲MdTCP46蛋白降解。 "MdTCP46 "可同強光誘導的花青素生物合成所必需的轉錄因子 "MdMYB1 "互作［6］。

隨著測序技術的不斷發展，石榴（Punica granatum L.）基因組測序已經完成，這使通過基因家族分析，進一步了解石榴果實發育中的生理生化過程變得更容易。在本研究中，首先鑒定了石榴TCP家族基因成員、開展了蛋白理化性質分析、系統發育分析、基因結構和蛋白基序分析和miRNA靶位點預測。最后，基于轉錄組數據對TCP家族基因成員進行了表達研究，以期為研究石榴的果實發育中TCP基因的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2022年9月至2023年2月在紅河學院生物科學與農學學院實驗室完成。

1.2 基因組和轉錄組數據的獲得

使用NCBI下載“大笨子”石榴（Punica granatum L.）基因組數據和轉錄組數據。利用PlantTFDB數據庫下載擬南芥、水稻、野草莓、葡萄、番茄和西瓜TCP蛋白序列，并根據相關參考文獻進行命名。

1.3 石榴TCP基因家族成員的鑒定及理化性質分析

石榴TCP基因家族成員的鑒定及理化性質分析參考前期的研究論文［12］進行。

1.4 系統進化樹的構建

利用Clustal W將石榴候選蛋白與擬南芥、水稻、 野草莓、葡萄、番茄和西瓜TCP家族蛋白， 進行多序列比對，使用MEGAX軟件，采用NJ法（neighbor- joining）（Bootstrap=1 000）進行系統進化樹的構建。同時，利用Genedoc軟件對石榴TCP蛋白序列進行比對后進行可視化分析。

1.5 石榴TCP蛋白結構、保守基序和基因結構分析

采用MEME（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme-in.tro.html）分析TCP的模式（motif）分析。參數設置為默認。利用TBtools進行基因結構分析和蛋白保守基序可視化［13］。

1.6 miRNAs的靶位點預測

通過psRNATarget（https：//www.zhaolab.org/psRNATarget/）網站對石榴TCP基因進行靶位點在線預測，參數均設為默認值。

1.7 石榴TCP基因家族的RNA-Seq分析

下載石榴不同組織和不同發育階段的轉錄組數據［14］，參考前期的研究論文進行石榴TCP基因表達分析［12］。

2 結果與分析

2.1 石榴TCP基因家族成員的鑒定及蛋白理化性質分析

共鑒定到22個石榴TCP基因，分別命名為 "PgTCP1～PgTCP22 "。通過ExPASy在線工具對石榴TCP 基因家族進行理化性質分析，由表1可知，石榴TCP基因家族氨基酸長度為221（ "PgTCP2 "）～ 644 aa （ "PgTCP3 "）；蛋白分子量為23.23（ "PgTCP2 "）～70.76 ku（ ""PgTCP3 "）。其等電點（pI）范圍為5.50～10.06。一半蛋白偏酸性，pIlt;7，一半蛋白偏堿性，pIgt;7，PgTCP蛋白的不穩定系數介于41.02～74.60之間，脂肪族氨基酸指數在52.65～81.48之間，平均疏水性指數值在-0.846～-0.374 范圍內變化，均小于0，表明PgTCP蛋白均為親水性蛋白。

2.2 石榴TCP基因家族系統進化分析

為研究石榴與擬南芥、水稻、葡萄、西瓜、野草莓、番茄的TCP之間的進化關系，將7個物種共166條TCP氨基酸序列構建進化樹。由圖1可知，石榴、擬南芥、番茄、葡萄、西瓜、野草莓和水稻的TCP可明顯地分為ClassⅠ（PCF類）和ClassⅡ，ClassⅡ型又包括CIN和CYC/TB1 2個亞家族。在鑒定得到的22個PgTCP中，有11個屬于ClassⅠ型（PCF類），11個屬于ClassⅡ型。 "PgTCP2、PgTCP8、PgTCP10、PgTCP11、PgTCP13、PgTCP14、PgTCP17、PgTCP18、PgTCP19、PgTCP20和PgTCP22 "屬于ClassⅠ型。 "PgTCP9、PgTCP6、PgTCP15、PgTCP21 "屬于CYC/TB1亞族。 "PgTCP1、PgTCP3、PgTCP4、PgTCP5、PgTCP7、PgTCP12、PgTCP16 "屬于CIN亞族。進一步分析可知，所有擬南芥［2，15］、水稻［16］、葡萄［10］、野草莓［8］、西瓜［17］和番茄［18］上的序列分類同已報道的研究一致，表明該進化樹的分析結果是可信的。

TCP基因的數量在不同物種中是不同的，由圖2可知，擬南芥［2，15］、水稻［16］、野草莓［8］、葡萄［10］和番茄［18］基因組中分別有24、21、19、17、36個。大多數物種中PCF亞族含有基因數量最多，CIN亞族次之，CYC/TB1亞族含量最少。雖然在不同物種中各個亞族TCP基因數量存在差異，但幾乎每個亞族所占比例較為一致，這些結果均表明TCP基因家族在物種間的進化具有較高的保守性。

2.3 石榴TCP序列比對分析

利用Genedoc軟件對石榴TCP蛋白序列進行比對，由圖3可知，石榴TCP蛋白序列高度保守，均含有典型的螺旋-環-螺旋（bHLH）結構。相比于ClassⅡ，ClassⅠ中的蛋白序列明顯存在一段4個氨基酸的缺失。ClassⅡ中的2個亞族之間也有明顯的序列差異，其中，CYC/TB1亞族存在保守的SKI、AR、FDK和ASK殘基，而CIN亞族存在保守的SKV、AI和PSK殘基。

2.4 石榴TCP基因家族保守基序分析

利用在線軟件MEME對PgTCP蛋白進行保守基序分析，并利用TBtools軟件結合進化樹進行可視化，由圖4和表2可知，對石榴TCP基因家族成員聚類分析結果表明，PgTCP被分為ClassⅠ（PCF）和ClassⅡ（CYC/TB1和CIN），與之前的分析結果一致，PgTCP蛋白的基序組成和數量均存在差異。motif1是所有PgTCP蛋白共有的基序，motif2是PCF亞族蛋白特有的。PCF亞族蛋白（PgTCP2、PgTCP8、PgTCP10、PgTCP11、PgTCP13、PgTCP14、PgTCP17、PgTCP18、PgTCP19、PgTCP20和PgTCP22）均含有motif2，且motif3是Class Ⅱ蛋白特有的。motif6是CYC/TB1亞族蛋白特有的。這些特異性的基序結構，可能與不同成員參與一些特定的調控過程有關。整體觀察，大部分位于同一亞族的基因具有相似的保守基序，與前面的系統進化樹的分類相吻合，不同亞族成員間的差異也為研究TCP家族中不同亞族的進化提供了參考。

2.5 石榴TCP基因家族內含子/外顯子結構分析

為進一步了解石榴TCP基因的系統進化關系和基因結構，進行了基因內含子/外顯子結構分析。18個PgTCP基因無內含子，其余的4個 "PgTCP（PgTCP3、PgTCP6、PgTCP10和PgTCP21） "僅含有1個內含子。由圖4-C可知，大多數同一家族的PgTCP基因內含子和外顯子的數量和長度是相同的。

2.6 miRNAs的靶位點分析

由表3可知，通過psRNATarget預測PgTCP的miRNAs靶位點，發現CIN亞族成員 "PgTCP1、PgTCP3、PgTCP4、PgTCP5 "有miR319的調控位點。

2.7 石榴TCP基因家族表達分析

為進一步了解PgTCP基因在石榴生長發育和果實發育中的作用，利用NCBI中下載的石榴轉錄組數據［14］，開展了22個PgTCP基因組織器官的表達特性研究。PgTCP基因在不同組織中的表達模式不同。進一步分析結果（圖5-A）表明， "PgTCP4、PgTCP6、PgTCP7、PgTCP9、PgTCP10、PgTCP12、PgTCP15、PgTCP18和PgTCP21在不同組織和果實的不同發育階段低表達。而PgTCP11和PgTCP17在不同器官和果實發育階段高表達。PgTCP1和PgTCP3在葉片中表達量高。相對而言，PgTCP1和PgTCP14在花中表達量高。PgTCP22在果皮發育中表達量降低。PgTCP2和PgTCP5 "在外種皮發育中表達量降低。

為了進一步了解PgTCP基因在石榴種子硬度中的作用，開展了3個品種授粉后50 d的表達分析。結果（圖5-B）表明，PgTCPs在3個品種中表達 差異較大。 "PgTCP4、PgTCP6、PgTCP7、PgTCP8、 "PgTCP9、PgTCP12、PgTCP15、PgTCP18和PgTCP21 "在3個品種中表達量都比較低。 "PgTCP3與種子的硬度呈正相關，而PgTCP2、PgTCP11、PgTCP13和PgTCP14 "與種子的硬度呈負相關。

3 討論與結論

TCP是植物特有的轉錄因子，在植物的生長發育中起重要作用。目前，在擬南芥［2，5，15］、水稻［16］、棉花［19］、番茄［18］、苜蓿［20］、草莓［7］、葡萄［9-10］、黃瓜［21］、西瓜［17］等植物上開展了TCP基因功能的研究。石榴是一種營養豐富、經濟價值很高的水果，但 還缺乏有關TCP基因功能的研究。本研究基于石榴基因組和轉錄組數據開展了石榴TCP基因的進化關系、基因結構、蛋白基序、在不同的組織和發育階段的表達分析，以期為進一步研究該基因家族的功能奠定基礎。

從石榴基因組中共鑒定到22個TCP基因，該基因的數量相對來講是比較保守的。同番茄（30個）和蘋果（52個）相比，石榴TCP基因家族的數量相對較少。這同番茄（960 Mb）和蘋果（742 Mb）的基因組大小相一致，推測TCP基因在不同植物中的擴張程度是不同的［22-23］。有研究表明，蘋果基因組發生了2次全基因組復制事件，所以蘋果中TCP基因家族的數量較多［24］。

蛋白理化性質分析結果表明，最長的PgTCP基因（ "PgTCP3 "）編碼644個氨基酸，最短的（ "PgTCP2 "）編碼221個氨基酸，等電點分布在5.50～10.06之間，提示這些PgTCP基因家族成員具有不同的生物學功能。系統發育分析和序列比對分析結果顯示，22個PgTCP分為ClassⅠ（PCF）和ClassⅡ（CYC/TB1和CIN）。該分類結果與擬南芥、水稻、番茄、 葡萄和野草莓上的結果相一致。由圖1可知，每個Class包含來自擬南芥、水稻、番茄、野草莓、葡萄等不同物種的序列。同一Class中motif組成相似，內含子/外顯子結構相同。保守基序分析和內含子/外顯子結構分析的結果，進一步說明系統進化分析的結果是可靠的。 大部分石榴TCP基因不含內含子，僅4個基因含有1內含子。其中，ClassⅡ中的CIN類基因均不含有內含子，與番茄中報道的TCP基因結構類似［18］，說明植物TCP家族基因結構比較簡單。

miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的單鏈RNA分子，通過識別靶mRNA互補位點，參與植物的轉錄后基因表達調控過程［25］。在植物的分化和演化過程中，miR319在植物中是相對保守的，miR319可以調控CIN亞族［8-9，19］。在柳枝稷上的研究表明，miR319可調控 "PvTCP13、PvTCP15、PvTCP8和PvTCP36 "［11］。miRNA靶位點預測結果表明， "PgTCP1、PgTCP3、PgTCP4和PgTCP5 "基因受miR319調控，推測這4個基因可能存在相對于其他TCP家族成員更復雜的調控機制。

大量的研究表明，TCP基因家族在植物生長發育中發揮著多種功能，如花的發育、葉片的衰老和發育［2-3，5，26-29］。利用轉錄組數據分析了TCP基因在石榴不同組織和果實發育不同階段的表達模式，結果表明，一些PgTCP 基因可根據其在特定組織中的表達情況進行分類，表明同一亞族的基因可能參與了同一個代謝或發育過程。在葡萄上也有類似的報道［10］。

研究表明，TCP在葉片發育中起重要作用，如5個CIN亞族基因（ "AtTCP2、AtTCP3、AtTCP4、AtTCP10和AtTCP24 "）受miR319調控，參與了葉片和花的發育；將 "AtTCP4 "異源表達可造成在葉片發育的早期形成小葉［30］。過表達miR319或抑制CIN亞族基因均可造成延遲衰老，而過表達CIN亞族基因可通過激活茉莉酸的生物合成而加速葉片衰老［31-32］。 "VvTCP5、VvTCP6和VvTCP18 "是擬南芥CIN亞族的同源基因，也含有miR319的調控位點， "VvTCP5 "只在衰老的葉片高表達，表明 "VvTCP5在葡萄葉片衰老中起作用；VvTCP6和VvTCP18 "在嫩葉、成熟葉片、幼嫩的花序和剛萌發的芽中高表達［10］。 "PgTCP1、PgTCP3、PgTCP4和PgTCP5 "是CIN亞族基因，且都含有miR319。 "PgTCP1、PgTCP3、PgTCP4同擬南芥AtTCP3和AtTCP4親緣關系較近，是同源基因。PgTCP5是擬南芥AtTCP2的同源基因。表達分析結果表明，PgTCP1、PgTCP3和PgTCP5 "在葉片中表達量最高。這些結果表明，石榴CIN類亞族基因在葉片發育過程中起的作用，同擬南芥和葡萄上的同源基因的功能是相同的。

果實的成熟和發育是一個復雜的生物過程，受一系列轉錄因子的協同調控。有關CIN亞族成員參與果實發育的報道較少。在桃上的研究表明， "PpTCP.C1和PpTCP.D1.1 "屬于CIN亞族，在果實發育早期高表達［33］。在葡萄上的研究表明， "VvTCP5在果實中不表達，而VvTCP6、VvTCP8、VvTCP11和VvTCP18 "在果實發育早期高表達［10］。 "PgTCP1、PgTCP3、PgTCP4、PgTCP5、PgTCP6、PgTCP7、PgTCP12和PgTCP16 "屬于CIN亞族， "PgTCP4、PgTCP7和PgTCP12 "在果實不同發育階段和不同組織中幾乎不表達。而 "PgTCP3 "在外種皮和果皮的不同發育階段幾乎不表達，而在授粉后50 d的內種皮中表達量較高。 "PgTCP1 "在果實不同組織和不同發育時期表達量差異較大，在葉片中表達量最高，在授粉后140 d的果皮中表達量次之。 "PgTCP5在果實不同組織和不同發育時期差異表達。PgTCP16 "在果皮的不同發育階段表達量高，但在外種皮中幾乎不表達，表明部分石榴CIN亞族成員參與了石榴果實早期的發育。

在葡萄上 "VvTCP1 "屬于CYC/TBI亞族，在果實中不表達［10］。番茄上的 "SlTCP7、SlTCP8、SlTCP9和SlTCP22 "也屬于CYC/TBI亞族，在果實中也不表達［18］。 "PgTCP6、PgTCP9、PgTCP15和PgTCP21， "屬于CYC/TBI亞族，在石榴果實中幾乎不表達。這些結果表明，CYC/TBI亞族不參與果實的發育過程，同葡萄［10］和番茄［18］上的研究結果相一致。

在番茄上的研究表明，ClassⅠ即PCF亞族在番茄果實發育和成熟中起重要作用［18］。在葡萄中，除 "VvTCP13 "外，其余9個PCF亞族基因在果實發育過程中表達量降低［10］。 "PgTCP2、PgTCP8、PgTCP10、PgTCP11、PgTCP13、PgTCP14、PgTCP17、PgTCP18、PgTCP19、PgTCP20和PgTCP22 "屬于PCF亞族基因。除 "PgTCP18 "外，所有成員在不同組織中均表達，是組成性表達基因，該結果同葡萄和野草莓上PCF亞族基因的表達模式一致。在番茄上的研究表明， "SlTCP12、SlTCP15和SlTCP18在果實中表達，參與了果實的發育和成熟。PgTCP11、PgTCP17和PgTCP22分別是SlTCP18、SlTCP15和SlTCP12 "的同源基因［18］。相對而言， "PgTCP11、PgTCP17和PgTCP22 "在果實不同組織中表達量較高，且隨著果實的發育，表達量下調。如 "PgTCP11和PgTCP22的表達量隨果皮的發育逐漸降低。推測PgTCP11、PgTCP17和PgTCP22 "在石榴果實發育和成熟中起重要作用。

本研究在石榴基因組數據中共鑒定出22個TCP基因，對其理化性質、系統進化關系、保守結構域、基因結構和表達情況進行分析。石榴TCP基因可分為Class Ⅰ（PCF）和Class Ⅱ（CYC/TB1和CIN）兩大類。同一亞類在基因結構方面具有相似性。PgTCP蛋白序列高度保守，都含有典型的螺旋-環-螺旋（bHLH）結構。CIN亞族成員 "PgTCP1、PgTCP3、PgTCP4、PgTCP5 "含有miR319調控位點。22個PgTCP基因在不同組織中的表達存在差異，該研究結果為進一步開展石榴TCP基因功能研究奠定了基礎。

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收 稿日期：2023-02-20

基金項目：國家自然科學地區基金（編號：42161015）；云南省教育廳科學研究基金（編號：2023J1115）。

作者簡介：李曉靜（1986—），女，河南洛陽人，博士，講師，主要從事果樹栽培學方面的教學與研究。E-mail：lanmeixj@163.com。

通信作者：岳亮亮，博士，助理研究員，主要從事植物學、生物地理學、濕地學、分子生態學方面的教學與研究。E-mail：yueliangliang@swfu.edu.cn。