芋頭貯藏期腐爛病病原菌的鑒定、生物學特性及防治藥劑篩選

摘要： 貯藏期腐爛病是芋頭上發生的一種病害，嚴重影響芋頭的產量和品質，給芋頭生產造成極大的損失。為明確芋頭貯藏期腐爛病病原菌種類，研究其病原菌的生物學特性，以及篩選適于防治芋頭貯藏期腐爛病的藥劑，作者從江蘇省南通市采集病樣，利用組織分離法獲得病原菌，采用形態學及分子生物學手段鑒定其病原菌種類，對該病原菌在不同培養基、溫度和pH值等條件下的生物學特性進行研究，并通過生長速率法測定7種殺菌劑對該病原菌的室內毒力。結果顯示，南通市芋頭貯藏期腐爛病病原菌為芋疫霉（Phytophthora colocasiae）。生物學特性研究表明，該病原菌最適生長條件為V8培養基，pH值為5，溫度為25～30 ℃。7種殺菌劑室內毒力測定結果表明，雙炔酰菌胺、甲霜靈、 烯酰嗎啉和氟嗎啉對芋疫霉菌絲生長具有較好的抑制效果，其EC 50值分別為0.007 2、0.092 2、0.120 0、 0.677 8 μg/mL ， 其他3種霜脲氰、氟啶胺、丙森鋅的抑菌效果較差，EC 50值分別為6.985 0、22.347 3、52.519 3 μg/mL。本研究結果可為芋頭腐爛病的防治提供參考。

關鍵詞： 病原鑒定；生物學特性；藥劑篩選；芋疫霉；芋頭；貯藏期腐爛病

中圖分類號：S182；S632.309+.3 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）01-0117-06

芋（Colocasia esculenta）屬于天南星科芋屬植物，其塊莖富含維生素、膳食纖維、淀粉、非淀粉多糖等功能成分，是非洲、亞洲和拉丁美洲熱帶地區的重要糧食作物［1-2］。我國是芋主產國之一，總產量基本位居世界第二［3-4］。芋在我國以珠江流域栽培最多，長江流域次之［5］。芋在生長過程中常受到病害的侵襲，如芋疫病、炭疽病、污斑病、軟腐病、細菌性斑點病等，發病田塊病株率一般為30%～50%，嚴重時可達100%。這些病害的發生嚴重影響芋的產量，造成巨大的經濟損失［6］。芋頭于每年10—11月采收并貯藏，以便長期滿足市場需求，而芋頭在貯藏過程中易造成傷口，加上貯藏環境濕度大，容易引起病原菌的感染，從而引起芋頭腐爛，嚴重影響芋頭的品質。目前發現引起芋頭貯藏期腐爛病的病原有腐霉屬（Pythium spp.）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、歐文氏菌屬（Erwinia carotovora subsp. carotovora、E. chrysanthemi）和果膠桿菌屬細菌（Pectobacterium aroidearum）［7-10］，而對于該病害防治主要依靠化學藥劑和抗生素，如代森銨、次氯酸鹽和農用鏈霉素等［11］。

2019年，江蘇南通農戶在芋頭貯藏過程中發現其塊莖腐爛。為明確引起芋頭貯藏期腐爛病的原因，利用組織分離法分離獲得病原菌，結合形態學及分子生物學手段鑒定病原菌種類，對該病原菌在不同溫度、pH 值和培養基等條件下的生物學特性進行研究，并測定7種殺菌劑對病原菌的室內毒力，以期為芋頭貯藏期腐爛病的有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離、鑒定

2019年12月，從江蘇省南通市芋生產與貯藏試驗點采集發病的芋塊莖，在揚州大學植物病理學實驗室利用組織分離法分離病原物［12］。首先將病部沖洗干凈，于超凈工作臺中用無菌刀片取病健交界處組織，用濃度為10%的次氯酸鈉溶液消毒20～30 s；消毒后的組織立即用無菌水漂洗3次，用無菌濾紙吸干組織表面的水分，再將組織移至含0.3%乳酸的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，密封后置于25 ℃恒溫培養箱中倒置培養。待菌絲長出后，用挑針挑取菌落邊緣絲轉移至V8培養基斜面，待菌絲長滿斜面后置于10 ℃冰箱保存。

1.2 致病性測定

選取健康的芋頭，清洗后去除接種部位絨毛，用小刀輕輕削破表皮作為接種處。菌株利用V8培養基培養病原菌3 d后，取菌落邊緣直徑8 mm的菌餅覆蓋于接種處，以無菌V8培養基為對照，每個處理設置3次重復。每天觀察芋頭發病情況。

1.3 病原菌形態學鑒定

將菌株接種于V8培養基平板，25 ℃全黑暗條件下培養5 d。培養期間觀察并記錄菌株的形態特征，對菌落形態、菌絲形態、孢子囊等特征進行肉眼與顯微觀察。

1.4 病原菌分子生物學鑒定和系統發育分析

將病原菌置于25 ℃恒溫培養箱中培養2 d，在菌落邊緣用打孔器取直徑8 mm的菌塊，接種至PDB培養液，于25 ℃恒溫搖床中以180 r/min培養36～48 h。按北京索萊寶科技有限公司真菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取菌株基因組DNA。以菌株基因組DNA為模板擴增內轉錄間隔區基因片段（internally transcribed spacer，ITS），供試引物為ITS4（5′- G G A A G T A A A A G T C G T A A C A A G G -3′），ITS5（5′- T C C T C C G C T T A T T G A T A T G C -3′）。擴增產物經回收、純化后，連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α菌株，陽性克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果利用NCBI數據庫進行比對［13］，并使用Phylosuite軟件，采用貝葉斯法（Bayesian inference，BI）構建系統發育樹。

1.5 病原菌生物學特性研究

1.5.1 不同培養基對病原菌菌絲生長的影響

培養基選用V8培養基、PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基［14］、PSA馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基［15］、CMA玉米粉瓊脂培養基［16］、察氏固體培養基［17］，還有自制芋頭培養基（芋頭200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL）。在培養基平板中央接種直徑8 mm的菌餅，25 ℃暗培養5 d，每個處理3次重復，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.5.2 pH值對病原菌菌絲生長的影響

用 1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將V8培養基pH值分別調整至3～10［18］。在培養基平板中央接種直徑8 mm的菌餅，25 ℃暗培養5 d，每個處理3次重復，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.5.3 溫度對病原菌菌絲生長的影響

將直徑 8 mm 的菌餅接入V8培養基，分別移入10、15、20、25、30、35 ℃的生化培養箱中進行培養［19］，培養 5 d，每個處理3次重復，十字交叉法測量菌落直徑。

1.6 防治藥劑室內毒力測定

供試藥劑為98%甲霜靈原藥（浙江禾本科技股份有限公司）、98%烯酰嗎啉原藥（江蘇輝豐生物農業股份有限公司）、96%霜脲氰原藥（美國杜邦公司）、23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑（先正達南通作物保護有限公司）、30%氟嗎啉懸浮劑（沈陽科創化學品有限公司）、500 g/L氟啶胺懸浮劑（江西禾益化工股份有限公司）、70%丙森鋅可濕性粉劑（拜耳股份公司）。

配制成不同濃度的含藥V8培養基，以不含藥劑的V8培養基作為對照，在培養基平板中央接種直徑8 mm的菌餅，25 ℃暗培養6 d，每個處理3次重復，十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率，將抑制率轉換成概率值，作為因變量（y），以處理藥劑濃度的對數值為自變量（x），得出毒力回歸方程。

I= D c-D t D c-8 mm ×100%；

式中：I表示菌落生長抑制率；D c表示對照菌落直徑；D t表示處理菌落直徑。

y=a+bx。

式中：y表示抑制概率值；x表示藥劑濃度對數。

1.7 數據分析

利用Excel軟件和DPS數據處理軟件進行數據的統計分析，采用Duncan's新復極差法（DMRT）進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 芋頭貯藏期腐爛病癥狀、病原分離及科赫法則驗證

芋頭貯藏期腐爛病發病塊莖癥狀主要表現為干腐和濕腐：若位于芋堆表層，或通風條件較好的情況下，發病塊莖主要表現為干腐（圖1-A）；若位于芋堆下層，或通風條件不良，濕度大，則主要表現為濕腐（圖1-B）。切開病芋，可見病健交界處明顯，塊莖內病部大多見紅褐色木質化部分（圖1-C、圖1-D）。病部無惡臭。

通過組織分離法和單孢分離法分離純化共獲得12株菌株，之后取優勢菌株中的1株，命名為 NT-1，并利用菌餅對健康的芋頭進行科赫法則驗證。結果表明，NT-1菌株可侵染芋頭塊莖，且癥狀與自然發病的癥狀基本一致（圖1-E、圖1-F）。

2.2 病原菌的形態學鑒定

NT-1菌株在V8平板上菌落為白色圓形，邊緣整齊，菌絲較為稀疏，氣生菌絲較少，為無隔菌絲（圖2-A、圖2-B），并產生大量孢子囊。孢子囊長卵形或橢圓形，基部圓形，有明顯的乳突（圖2-C）。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

通過對NT-1菌株ITS序列的擴增和測序，獲得長度為869 bp的序列。將序列信息上傳至NCBI數據庫，獲得NCBI登錄號為MZ407603.1，并利用該序列進行建樹分析。結果表明，NT-1菌株與芋疫霉（Phytophthora colocasiae）的3個菌株聚為1支，自展值為100（圖3）。結合形態學和分子生物學鑒定結果，明確芋貯藏期腐爛病病原菌為芋疫霉（P. colocasiae）。

2.4 病原菌的生物學特性研究

2.4.1 不同培養基對芋疫霉NT-1菌株生長的影響

由圖4可知，NT-1菌株在6種培養基上均可生長，其中在V8培養基、芋頭培養基和PSA培養基中菌落直徑最大，其次是PDA培養基，而在察氏固體培養基和玉米瓊脂培養基中直徑最小。因此，芋疫霉 NT-1 菌株的最適培養基為V8培養基、芋頭培養基和PSA培養基。

2.4.2 pH值對芋疫霉NT-1菌株生長的影響

由圖5可知，芋疫霉NT-1菌株在pH值3～10的條件下都能生長。當pH值為3～5時，菌絲生長速率呈上升趨勢，而pH值為6～10時菌絲生長速率呈下降趨勢。結果表明，芋疫霉NT-1菌株適宜生長pH值范圍較廣，其最適生長pH值為5。

2.4.3 溫度對芋疫霉NT-1菌株生長的影響

由 圖6可知，芋疫霉NT-1菌株在15～30 ℃之間均 可生長， 菌絲生長呈上升趨勢； 溫度為10、35 ℃時，菌絲的生長明顯受到抑制；25、30 ℃時菌落直徑相差不大，差異不顯著。結果表明，芋疫霉NT-1菌株菌絲最適生長溫度為25～30 ℃。

2.5 7種常用藥劑對芋疫霉NT-1菌株的室內毒力測定

供試的7種殺菌劑對芋疫霉NT-1菌株菌絲生長均有不同程度的抑制效果。其中雙炔酰菌胺毒力最強，其EC 50值為0.007 2 μg/mL；其次為甲霜靈、烯酰嗎啉和氟嗎啉，EC 50值分別為0.092 2、0.120 0 、0.677 8 μg/mL。其他3種藥劑對芋疫霉NT-1菌株菌絲生長的抑制作用為霜脲氰gt;氟啶胺gt;丙森鋅，其EC 50值為6.985 0～52.519 3 μg/mL（表2）。

3 討論

貯藏期腐爛病發生于收獲后的芋頭塊莖，該病害嚴重影響芋頭的品質，造成經濟損失。目前已報道的能引起芋頭塊莖腐爛的病原菌有腐霉屬、尖孢鐮刀菌、歐文氏菌屬和果膠桿菌屬細菌［7-10］。本研究從江蘇省南通市芋頭貯藏期腐爛病病樣中分離病原菌，結合形態學特征和系統發育分析結果，明確了引起該病害的病原菌為芋疫霉（P. colocasiae）。由芋疫霉引起的芋疫病是芋頭生產中最具破壞性的病害，可危害生長過程中芋的葉片、葉柄和球莖，發生嚴重時造成大量葉片腐爛和植株枯死［20-25］，而由芋疫霉引起的芋頭貯藏期腐爛病則是本研究首次報道并證實的。

植物病原真菌最適生長的營養條件可利用含不同碳源或氮源的培養基進行測定［21-24］，而疫霉屬病原菌最適營養條件的確定需要配制不同類型的培養基。例如張世才等利用選擇性燕麥培養基（OMA）分離和培養辣椒疫霉（P. capsici），并觀察該病原菌在PDA培養基、胡蘿卜培養基、V8培養基和OMA培養基上的生長速度和產孢情況［14］；盧昕等利用CMA培養基培養棕櫚疫霉（P. palmivora），并測量該病原菌在V8培養基、CMA培養基和CA培養基等8種培養基上的生長速度［25］； 鄒芬等同樣利用V8培養基分離和培養了芋疫霉，并觀察該病原菌在V8培養基上的菌絲和孢子形態［26］。本試驗利用5種已報道的培養基和自制芋頭培養基測定芋疫霉的生物學特性，其中病原菌在V8培養基中生長最好。

病原菌生物學特性指標也包括菌絲生長的最適溫度和pH值［27］。葉泉清等測定芋疫霉菌絲生長最適溫度為25 ℃［28］，趙雁等測定棕櫚疫霉和惡疫霉生長的最適pH值均為5［18，25］，翁琳琳等測定芋疫霉在V8培養基上的最適產毒條件pH值為 6［29］。本研究測定的芋疫霉NT-1菌株最適溫度為25～30 ℃，最適生長pH值為5，這可能是因為病原菌種類不同以及同種病原菌來源不同導致其最適生長條件存在差異。

前人研究發現，雙炔酰菌胺對芋疫霉菌絲的抑制作用最強，其EC 50值為0.006 μg/mL［26］，在田間以40～45 mL/667 m2用量施用雙炔酰菌胺有較好的防效［30-31］。甲霜靈在芋疫病上使用多年，當濃度為 5 μg/mL 時已經出現抗性菌株［32］，現多與其他藥劑組成復配劑使用。烯酰嗎啉對卵菌有特效，同時因其對菌抑制作用強，且與甲霜靈等苯酰胺類殺菌劑無交互抗性而受到重視［12］。本研究中雙炔酰菌胺對芋疫霉NT-1菌株EC 50值為 0.007 2 μg/mL， 與鄒芬等的研究結果［26］基本一致；在前人研究中甲霜靈的復配劑如甲霜·霜脲氰和甲霜靈·錳鋅在田間防治芋疫病都具有較好的效果［30-31］。本研究測定的烯酰嗎啉EC 50值 "（0.120 0 μg/mL） 與崔曉嵐等研究結果中烯酰嗎啉對辣椒疫霉的EC 50值［33］ 和鄒芬等測定烯酰嗎啉對芋疫霉菌的EC 50值［26］亦相差不大。以上研究結果可為芋頭貯藏期腐爛病的防治提供參考。

4 結論

本研究明確江蘇南通芋頭貯藏期腐爛病病原菌為芋疫霉，該病原菌最適生長條件為V8培養基，25～30 ℃，pH值為5。7種用于室內毒力測定的殺菌劑中，雙炔酰菌胺、甲霜靈、烯酰嗎啉和氟嗎啉抑菌效果較好。本研究結果可為芋頭貯藏期腐爛病的防治提供理論依據。

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收 稿日期：2023-03-23

基金項目：江蘇省現代農業產業技術體系建設專項［編號：JATS（2021）338］；揚州大學創新培育基金（編號：135030485）。

作者簡介：楊 峰（1993—），男，江蘇響水人，碩士研究生，從事蔬菜病害防治研究。E-mail：502634646@qq.com。

通信作者：陳 宸，博士，講師，從事植物病害致病機制及防控研究，E-mail：chenc@yzu.edu.cn；陳夕軍，博士，副教授，從事植物病害致病機制及防控研究，E-mail：xjchen@yzu.edu.cn。