高產巨大戟醇鐵海棠毛狀根培養體系的構建

摘要： 為構建高產巨大戟醇的鐵海棠毛狀根培養體系，研究比較了6個不同品種鐵海棠莖葉部分的巨大戟醇含量，以含量高的鐵海棠原種的花梗及葉盤為外植體，考察不同菌株以及不同侵染條件對其誘導率的影響，篩選適宜鐵海棠毛狀根生長的液體培養基，并比較了鐵海棠毛狀根和植株中的巨大戟醇含量差異。結果表明：（1）鐵海棠6個品種間巨大戟醇含量存在顯著差異，含量最高的為鐵海棠原種。（2）以鐵海棠原種的花梗為外植體，預培養7 d，以D 600 nm=0.6的Ar A4菌液侵染6 min，轉入1/2MS固體培養基中共培養3 d可獲得最佳轉化效果，毛狀根誘導率最高達68.33%。（3） 毛狀根在1/2MS液體培養基中生長迅速，長勢良好。（4）毛狀根中巨大戟醇的含量顯著高于鐵海棠原種植株中各部位的含量，達到593.14 mg/kg，鮮質量為0.50 g的毛狀根經懸浮培養10 d后，可獲得132.27 μg巨大戟醇。 鐵海棠6個品種中以鐵海棠原種巨大戟醇含量最高，利用發根農桿菌Ar A4 侵染鐵海棠原種花梗，成功建立了鐵海棠毛狀根的高效誘導及懸浮培養體系，且獲得的毛狀根中巨大戟醇含量高于原植株，為高效獲得巨大戟醇提供了新的途徑。

關鍵詞： 鐵海棠；巨大戟醇；毛狀根；發根農桿菌；誘導率

中圖分類號：S567.1+90.43 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）01-0134-07

巨大戟醇是巨大戟烷型二萜類活性化合物，是合成巨大戟醇甲基丁烯酸酯的主要原料［1-2］，該成分制成的外用凝膠劑（藥品名Picato）已在國外上市，用于治療日光性角化病和皮膚癌［3］。目前原料巨大戟醇主要是從大戟屬植物植株中分離得到，然而植株中的巨大戟醇含量很低，全合成法獲得巨大戟醇又存在著工藝難度大、成本高等產業化生產難題［4］，因此原料巨大戟醇來源匱乏的問題一直制約著其衍生物的藥用價值開發及工業化生產。筆者所在實驗室前期測定了大戟科61種植物植株堿水解后的巨大戟醇含量，發現鐵海棠（Euphorbia milii Ch. des Moulins）中含有相對較多的巨大戟醇，其植株地上部分巨大戟醇含量為136.17 mg/kg（干質量）［5］。因此，鐵海棠可作為巨大戟醇生產研究的理想植物材料。

鐵海棠是大戟科（Euphorbiaceae）大戟屬（Euphorbia）多年生蔓生灌木，別名虎刺梅、麒麟刺等，原產非洲（馬達加斯加），廣泛栽培于熱帶和溫帶地區［6］。鐵海棠也是一種藥用植物，以莖葉、根及乳汁入藥，性味苦澀涼，有小毒，入心經，具有解毒活血、排膿逐水等功效［7］。研究表明鐵海棠次生代謝產物的化學成分主要為黃酮類、三萜類、二萜類及酚類等［8-10］，其中包括大戟科植物特有的巨大戟醇酯類化合物。巨大戟醇酯類化合物是以巨大戟醇為母核酯化衍生出的一類大戟大環二萜酯，具有顯著的抗癌、抗病毒及生物農藥活性等［11-13］，其經堿水解后得到巨大戟醇［5］。

大量研究表明，利用發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）對藥用植物進行毛狀根誘導，獲得的毛狀根生長迅速，無需添加外源植物激素即可自主持續生長，能夠合成原植物所含的次生代謝產物，且得到的次生代謝物產量可能高于原植物［14-15］。利用毛狀根培養技術生產活性次生代謝產物已經在蒙古黃芪、甘草、鉤藤、王不留行等很多藥用植物中成功應用［16-19］。目前，國內外學者對鐵海棠的研究主要集中于其化學成分及藥理活性，尚未見關于鐵海棠毛狀根培養的研究報道。因此，系統研究鐵海棠毛狀根誘導體系的構建，篩選合適的培養條件從而高效地獲得巨大戟醇，為解決巨大戟醇來源匱乏問題提供了新途徑。

本研究選取鐵海棠6個不同品種植株為試驗對象，測定并比較不同品種間巨大戟醇含量差異，篩選出含量最高、最適于進行毛狀根誘導的材料后，對影響鐵海棠毛狀根誘導效率的因素進行優化，同時篩選毛狀根液體培養的最適培養基，建立優化鐵海棠毛狀根培養體系，并比較鐵海棠毛狀根及原植株中巨大戟醇的總含量，以期獲得高產巨大戟醇的毛狀根培養體系，為高效獲得巨大戟醇提供新的途徑，為鐵海棠藥用資源的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021—2022年在江蘇省中國科學院植物研究所天然產物化學研究中心（32°3′32″N，118°49′50″E）進行。樣品采自中山植物園南園溫室，經田梅助理研究員鑒定為大戟科大戟屬鐵海棠的6個不同品種，將其編號為品種A～F（圖1），分別為大基督虎刺梅（A）、鐵海棠原種（B）、凱西虎刺梅（C）、小基督虎刺梅（D）、白花虎刺梅（E）、塔城虎刺梅（F）。發根農桿菌Ar A4、ATCC 15834、MSU 440菌株均由筆者所在實驗室保存。

試驗所用的主要儀器設備有：Agilent 1260 HPLC-DAD-6530 ESI Q-TOF MS液質聯用儀（美國安捷倫公司）、超凈工作臺SW-CJ-1FD（蘇州安泰空氣技術有限公司）、METTLER AE240 電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）等；試驗用的對照品巨大戟醇購于南京春秋生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同品種的鐵海棠植株巨大戟醇含量測定

將以上6個品種的鐵海棠上部莖葉用清水沖洗后晾干，放入液氮速凍，然后置于冷凍干燥機中進行凍干，凍干完成后用打粉機打成均勻粉末，室溫避光儲存于干燥皿中備用。

稱取上述樣品各50 mg，按照Chen等的方法［5］進行甲醇提取及堿水解處理，將其制成濃度為 10 mg/mL 的樣品，按照“1.2.7”節中的色譜和質譜條件進行巨大戟醇含量測定。利用標準曲線計算巨大戟醇含量。

1.2.2 毛狀根的誘導

1.2.2.1 無菌外植體的制備

取鐵海棠原種的花梗和葉片，用加有適量洗衣粉的水浸泡10～15 min，流動自來水沖洗30 min。將其移至超凈工作臺中，進行無菌操作。75%乙醇消毒45 s，無菌水沖洗2次，0.1%氯化汞消毒5 min，無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干表面水分。將花梗切成長度為1 cm左右的小段，葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小的葉盤，接種于1/2MS固體培養基中，25 ℃黑暗條件下預培養7 d。

1.2.2.2 農桿菌的活化及菌液制備

從-80 ℃超低溫冰箱中取出保存的菌株Ar A4、ATCC 15834、MSU 440各50 μL，分別加至5 mL YEB液體培養基中，在含發根農桿菌Ar A4和ATCC 15834的培養基中各加入50 mg/L卡那霉素，含MSU 440的培養基中加入50 mg/L鏈霉素，28 ℃、185 r/min快速振蕩培養24 h，復蘇菌體。每種農桿菌各取500 μL復蘇菌液加入50 mL YEB液體培養基中，培養基中的抗生素濃度與復蘇菌體時相同，在28 ℃、185 r/min條件下振蕩培養，待菌液D 600 nm至0.4～0.8時，停止振蕩培養。將菌液5 000 r/min離心8 min，棄去上清，隨即加入等體積的MS液體培養基，并加入 100 μmol/L 乙酰丁香酮（AS），重懸菌體后用于侵染轉化。

1.2.2.3 毛狀根的誘導

待鐵海棠原種的花梗和葉盤預培養結束后，取出外植體放入上述已制備好的侵染菌液中，侵染4～8 min，取出外植體，用無菌濾紙將表面的菌液吸干，置于1/2MS固體培養基上，25 ℃黑暗共培養2～4 d。共培養結束后，轉移至含有400 mg/L頭孢噻肟鈉（Cef）的1/2MS固體培養基中繼續培養，每7 d換1次培養基，若無明顯菌斑長出，則逐步降低Cef濃度，直至不添加Cef。

1.2.3 鐵海棠毛狀根PCR鑒定

分別取鐵海棠的毛狀根和鐵海棠原種植株根，用TIANGEN試劑盒（DP305）提取基因組DNA，以發根農桿菌Ar A4質粒作為陽性對照，鐵海棠原種植株根為陰性對照，PCR擴增發根農桿菌Ri質粒T-DNA上的rolB和rolC基因序列，所用rolB基因的上游引物為5′- C G A G G G G A T C C G A T T T G C T T T -3′，下游引物為5′- G A C G C C C T C C T C G C C T T C C T -3′；rolC基因的上游引物為5′- C T C C T G A C A T C A A A C T C G T C -3′，下游引物為5′- T G C T T C G A G T T A T G G G T A C A -3′。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃終延伸10 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 鐵海棠毛狀根液體培養

在無菌條件下，取長勢良好的鐵海棠毛狀根0.50 g，分別轉移至不含激素的MS、1/2MS和White 3種液體培養基中，每組3瓶，蔗糖濃度為30 g/L，pH值為5.8，25 ℃、120 r/min 進行振蕩暗培養，考察不同液體培養基對鐵海棠毛狀根生長的影響。培養10 d后觀察鐵海棠毛狀根的生長情況及增殖倍數，篩選出最適液體培養基。

1.2.5 鐵海棠毛狀根中巨大戟醇含量測定

為了比較鐵海棠毛狀根及鐵海棠原種植株中巨大戟醇及其衍生物的含量，將鐵海棠毛狀根及鐵海棠原種植株的根、莖、葉、花苞及花放入液氮速凍，然后置于冷凍干燥機中進行凍干，凍干完成后用打粉機打成均勻粉末，室溫避光儲存于干燥皿中。分別稱取以上凍干粉末各50 mg，按照Chen等的方法［5］進行甲醇提取及堿水解處理，將鐵海棠毛狀根以及鐵海棠原種的根、莖制成濃度為2 mg/mL的樣品，葉、花苞及花制成濃度為50 mg/mL的樣品，按照“1.2.7”節中的色譜和質譜條件進行含量測定。

1.2.6 標準品溶液的制備

精密稱取巨大戟醇對照品8.0 mg， 置于25 mL容量瓶中，加色譜甲醇超聲振蕩溶解，定容至25 mL，配制成濃度為0.32 mg/mL 的對照品母液。取巨大戟醇對照品母液，采用梯度稀釋法，由高到低用色譜甲醇分別稀釋成5個濃度梯度：2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/mL。按照“1.2.7”節中的色譜和質譜條件進行測定。

1.2.7 色譜和質譜條件

檢測儀器：安捷倫HPLC- Q-TOF-MS/MS（1260 HPLC + 6530 Q-TOF）；色譜柱：Agilent C18 column（2.7 μm，4.6 mm×100 mm）；流動相：水（0.1%甲酸，A相），甲醇（0.1%甲酸，B相），檢測程序：0～5 min，40%～75% B；5～15 min，75% B；15～30 min，75%～ 100% B；30～40 min，100% B；40～50 min，40% B；流速： 0.5 mL/min；進樣量：5 μL；檢測波長：280 nm。

質譜離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；氣體流速：10.0 L/min；離子源溫度：350 ℃；毛細管電壓：3 500 V；毛細管出口電壓：130 V；錐孔電壓：65 V；八極桿電壓：750 V；霧化器壓力：50 psig；采集范圍：質荷比100～1 300；碰撞能量：30 eV。

1.3 數據處理與分析

探究不同因素對毛狀根誘導率的影響時，每組試驗均重復3次，每次統計20個外植體的數據，3次重復共計60個外植體。采用Excel 2016和SPSS 26.0對數據進行統計整理和方差分析，采用Origin 2022進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

按照“1.2.7”節中的色譜和質譜條件測定各個濃度梯度的峰面積，以巨大戟醇濃度（μg/mL）為橫坐標（x），提取巨大戟醇特征離子（質荷比313.00），以峰面積積分值為縱坐標（y），繪制標準曲線。如圖2所示，巨大戟醇標準曲線的線性回歸方程為 y=795 599 x+77 929，r2=0.999 3。線性范圍為0.125～2.000 μg/mL。

2.2 不同品種的鐵海棠植株中巨大戟醇含量

將不同品種的鐵海棠上部莖葉充分堿水解后，進行液質檢測。根據巨大戟醇的標準曲線，分別計算出不同品種鐵海棠上部莖葉中總巨大戟醇的含量，結果如圖3所示。不同品種的鐵海棠上部莖葉中巨大戟醇含量存在顯著差異（Plt;0.05），其中，以鐵海棠原種上部莖葉中巨大戟醇的含量最高，為157.09 mg/kg。因此，后續毛狀根誘導試驗用鐵海棠原種的花梗及葉片進行。

2.3 毛狀根的誘導

2.3.1 不同發根農桿菌類型對毛狀根誘導率的影響

本試驗選用3種發根農桿菌Ar A4、ATCC 15834、MSU 440分別侵染鐵海棠原種花梗。如表1所示，3種發根農桿菌菌株都可以有效誘導鐵海棠原種花梗產生毛狀根，但不同類型發根農桿菌菌株的毛狀根誘導率顯著不同，這可能是由于植物細胞對不同菌株的敏感性不同。3種菌株的誘導率由大到小依次為Ar A4＞MSU 440＞ATCC 15834，其中Ar A4對花梗毛狀根的誘導率可達66.67%，為誘導鐵海棠原種花梗形成毛狀根的最佳發根農桿菌菌株。因此，后續試驗用發根農桿菌Ar A4進行。

2.3.2 外植體類型對毛狀根誘導率的影響

以發根農桿菌Ar A4分別侵染鐵海棠原種的花梗和葉盤。由表2可知，Ar A4對花梗和葉盤的誘導能力不同，這說明外植體不同，對毛狀根誘導的影響較大。其中，花梗的誘導率較高，誘導率可達66.67%。因此，用花梗作為鐵海棠毛狀根的誘導材料更合適。

2.3.3 發根農桿菌Ar A4菌液濃度對毛狀根誘導率的影響

發根農桿菌菌液的濃度對毛狀根的誘導率也有一定的影響。由表3可知，當菌液濃度為D 600 nm=0.6時，誘導率最高，可達66.67%。當菌液濃度過低時，農桿菌數量少，誘導率低，當農桿菌濃度升高后，誘導率隨之提高，但當菌液濃度過高時，外植體易褐化且除菌困難，誘導率降低。因此，在本試驗中，菌液濃度為D 600 nm=0.6左右時，是適合誘導鐵海棠花梗產生毛狀根的菌液濃度。

2.3.4 侵染時間對毛狀根誘導率的影響

試驗設置4組不同的侵染時間，分別為4、6、8、10 min，20 d后分別統計各組的毛狀根發根數量。由表4可知，侵染6 min時誘導率最高，為68.33%。侵染時間過長和過短都不利于毛狀根的誘導，侵染時間短，質粒的轉化效率低，毛狀根誘導率低；隨著侵染時間進一步延長，對外植體傷害較大，誘導后出現花梗兩端邊緣變黑且菌體過度繁殖等情況，毛狀根的誘導率下降。結果表明，侵染6 min時誘導率最高，是誘導鐵海棠毛狀根適合的侵染時間。

2.3.5 共培養時間對毛狀根誘導率的影響

共培養時間是發根農桿菌將T-DNA轉移并整合到植物細胞基因組的時間，共培養時間對毛狀根的誘導率有重要影響。本試驗設置共培養時間分別為2、3、4 d，并統計其誘導率。從表5可以看出，3個共培養時間均能誘導鐵海棠原種花梗產生毛狀根，隨著共培養時間的延長，鐵海棠毛狀根的誘導率先上升后下降，其中共培養3 d時毛狀根的誘導率最高，可達66.67%，共培養4 d時誘導率降到36.67%，與 3 d 相比，降低了45.00%。因此，選用3 d作為誘導鐵海棠毛狀根的共培養時間最合適。

2.4 鐵海棠毛狀根液體培養基的篩選

共培養結束后將外植體轉到添加400 mg/L Cef的1/2MS除菌培養基培養，約10 d后可觀察到花梗兩端長出白色毛狀根（圖4-A），截取生長良好的毛狀根在除菌培養基上單獨培養（圖4-B），待其生長2周后轉入液體培養基進行懸浮培養（圖4-C）。毛狀根液體培養基篩選試驗結果（圖4-D至圖4-F，表6）顯示：1/2MS和MS液體培養基中的毛狀根生長狀態良好，呈黃白色，具有很多細小分枝，增殖倍數分別為4.66和4.50；White液體培養基中鐵海棠毛狀根呈黃色，生長狀態不佳且緩慢，增殖倍數只有2.18。說明培養基不同，對鐵海棠毛狀根的生長有較大的影響。結果表明，與White培養基相比，1/2MS和MS液體培養基更適于鐵海棠毛狀根的生長。比較這3種培養基的配方發現，其無機鹽的種類和濃度不同，說明1/2MS和MS培養基中所含的無機鹽可能更適于鐵海棠毛狀根的生長。鐵海棠毛狀根在1/2MS液體培養基中增殖倍數高于MS液體培養基，推測可能是無機鹽濃度稍低更適于鐵海棠毛狀根的生長。因此，篩選出 1/2MS 液體培養基為適宜鐵海棠毛狀根懸浮培養的最適培養基。

2.5 鐵海棠毛狀根PCR鑒定

以鐵海棠原種植株根作為陰性對照，以發根農桿菌Ar A4質粒作為陽性對照，PCR擴增發根農桿菌rolB和rolC基因。如圖5所示，2個鐵海棠毛狀根株系DNA均擴增出了rolB和rolC基因片段，和發根農桿菌Ar A4質粒DNA擴增出的rolB和rolC基因片段大小一致（rolB：622 bp；rolC：586 bp），正常植株根DNA未擴增出rolB和rolC的基因片段。表明發根農桿菌Ar A4中Ri質粒的T-DNA已被成功整合到鐵海棠毛狀根基因中。

2.6 鐵海棠植株及毛狀根中巨大戟醇含量測定

將鐵海棠原種的根、莖、葉、花苞、花以及發根農桿菌Ar A4誘導的毛狀根進行充分堿水解，巨大戟醇酯全部水解為巨大戟醇后， 進行液質檢測。根據巨大戟醇的標準曲線，分別計算出鐵海棠毛狀根和鐵海棠原種根、莖、葉、花苞及花中總巨大戟醇的含量，結果如圖6所示。鐵海棠毛狀根的巨大戟醇含量顯著高于鐵海棠原種植株各組織部位中的巨大戟醇含量，達到593.14 mg/kg，分別是根、莖、葉、花苞及花中的1.72、3.73、42.61、39.49倍。鮮質量為0.50 g的鐵海棠毛狀根在 1/2MS 液體培養基中懸浮培養10 d后，生長狀態良好，由原來的 0.50 g 增殖到2.33 g，鐵海棠毛狀根含水量約為90%。因此，通過計算可以得出，0.50 g鐵海棠毛狀根經懸浮培養10 d后，即可獲得 132.27 μg 巨大戟醇。由此可見，通過建立優化鐵海棠毛狀根誘導培養體系，獲得的毛狀根能夠生產出高于鐵海棠正常植株中的巨大戟醇積累量，且與植株相比，毛狀根具有生長迅速、生長周期短等優點。因此，該體系的建立為高效獲得巨大戟醇提供了新的途徑。

3 討論

毛狀根是生產次生代謝產物較理想的原材料，具有生長迅速、無需外源激素等特點，且能合成與原植物相同甚至更高含量的次生代謝產物［19］。本研究成功獲得了高產巨大戟醇的鐵海棠毛狀根誘導及培養體系，為利用鐵海棠毛狀根工業化生產巨大戟醇等次生代謝產物奠定了基礎。毛狀根的誘導及培養受到許多因素的影響，如外植體類型、發根農桿菌類型、菌液濃度、侵染時間、共培養時間、培養基種類等。

3.1 外植體的選擇

鐵海棠品種較多，本研究測定了鐵海棠6個不同品種莖葉部分的巨大戟醇含量，結果表明，不同品種的鐵海棠之間巨大戟醇含量存在顯著性差異。為獲得高產巨大戟醇的鐵海棠毛狀根培養體系，本研究以巨大戟醇含量最高的鐵海棠原種為植物材料，進行毛狀根誘導試驗。

利用發根農桿菌進行遺傳轉化時，根、莖、葉、果實等均可作為外植體，對于同一植物，外植體不同，其誘導率也有一定差異。如何鳳發等以絞股藍組培苗的葉片、葉柄、莖段作為轉化材料時發現葉片的誘導率最高［20］。賈春秋等以苦參根、莖和幼芽切段為外植體，發現幼芽的誘導率較高［21］。本研究發現，以鐵海棠原種的花梗和葉盤作為外植體均能誘導出毛狀根，但以花梗為外植體誘導產生毛狀根的誘導率可達66.67%。

3.2 發根農桿菌類型、菌液濃度、侵染時間、共培養時間對誘導率的影響

對于同一植物細胞，不同發根農桿菌菌株具有不同的毛狀根誘導能力。薛雯心等使用發根農桿菌Ar A4、C58C1和A1476對黨參進行毛狀根誘導，結果表明Ar A4誘導效果最好［22］。向倩倩等利用發根農桿菌C58C1和ATCC 15834誘導三葉青葉片，發現ATCC 15834在試驗條件下不能誘導三葉青產生毛狀根，而C58C1則可以［23］。本研究選用的3種發根農桿菌（Ar A4、ATCC 15834、MSU 440）均為農桿堿型菌株，致根能力強，結果表明這3種菌株均能誘導鐵海棠原種產生毛狀根，但誘導能力不同，其中Ar A4的誘導率最高。

研究表明，菌液濃度、侵染時間、共培養時間等都會對毛狀根誘導率有一定的影響。王麗等誘導龍葵毛狀根時發現菌液濃度為D 600 nm=0.6時誘導率最高［24］。劉連旺等對地黃的研究結果表明侵染時間為10 min時，誘導效果最佳［25］。林志豪等研究發現，黃瓜中國龍毛狀根誘導適宜的共培養時間為2 d，此時誘導率較高且受到農桿菌的污染較少［26］。本試驗發現發根農桿菌Ar A4在菌液濃度為D 600 nm=0.6，侵染時間為6 min，共培養時間為 3 d 時，對鐵海棠原種花梗的誘導率最高。菌液濃度低，侵染時間和共培養時間短時，毛狀根誘導率低；但當菌液濃度過高，侵染時間和共培養時間過長時，則會導致菌體大量繁殖，外植體褐化死亡。因此，合適的菌液濃度、侵染時間以及共培養時間能夠提高毛狀根的誘導率。

3.3 培養基種類對毛狀根生長的影響

當培養基成分不同時，毛狀根的生長表現出一定的差異性［27］。李云芳研究發現，在MS、1/2MS、B5、N6液體培養基中，1/2MS液體培養基最利于三七毛狀根的生長［28］。高帥等分別用MS、1/2MS、B5、6-7-V和White等5種培養基培養金鐵鎖毛狀根，發現其在B5培養基中生長最快，而對于毛狀根總皂苷的積累而言，則是在1/2MS培養基中的積累量最高，在B5培養基中總皂苷的積累最少［29］。在本研究中，與MS、White培養基相比，1/2MS液體培養基更有利于鐵海棠毛狀根的生長。

3.4 鐵海棠毛狀根體系的價值

許多研究表明，利用發根農桿菌誘導得到的毛狀根可以用于生產原植物所含的次生代謝產物，其含量甚至高于原植株。如張弘弛等對恒山黃芪毛狀根的總黃酮和總皂苷含量進行測定表明，其含量分別是自然根中的1.72倍和2.31倍［30］。吳順等對鉤藤帶鉤枝條、幼根和毛狀根的鉤藤堿進行含量測定，發現其毛狀根中鉤藤堿含量最高可達帶鉤枝條的2.06倍［18］。本研究通過測定比較鐵海棠毛狀根及鐵海棠原種植株根、莖、葉、花苞及花中巨大戟醇的總含量發現，鐵海棠毛狀根的巨大戟醇含量高于鐵海棠原種植株各組織部位中的巨大戟醇含量，分別是根、莖、葉、花苞及花中的1.72、3.73、42.61、39.49倍，達到593.14 mg/kg。0.50 g 鐵海棠毛狀根經懸浮培養10 d即可獲得132.27 μg巨大戟醇，利用鐵海棠毛狀根體系生產巨大戟醇，具有生長速度快、巨大戟醇含量高、不受環境因素影響等優點，這為利用鐵海棠毛狀根工業化生產巨大戟醇等次生代謝物奠定了重要基礎。

4 結論

本研究首次對大戟科植物鐵海棠進行毛狀根誘導，對外植體、發根農桿菌菌株、菌液濃度等條件進行篩選，成功構建了鐵海棠毛狀根的高效誘導及懸浮培養體系。該體系具有生產巨大戟醇等大戟二萜類次生代謝物的應用潛力，為高效獲得巨大戟醇提供了新的途徑。后期還可對鐵海棠毛狀根進行目的產物的誘導子篩選、毛狀根植株再生體系及轉基因植物培育等研究，充分利用毛狀根技術的優勢，為進一步開展該類活性物質生物合成研究和鐵海棠藥用資源的開發利用奠定基礎。

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收 稿日期：2023-03-09

基金項目：國家自然科學基金（編號：32270404）；江蘇省農業科技自主創新資金［編號：CX（22）3068］。

作者簡介：孫 茜（1998—），女，江西萍鄉人，碩士研究生，主要從事植物化學研究。E-mail：1063761910@qq.com。

通信作者：陳 雨，博士，研究員，主要從事天然產物化學研究。E-mail：ychen@jib.ac.cn。