藜麥CqCHS1基因的克隆及脅迫下表達分析

摘要： 查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是植物類黃酮合成途徑中的一個關鍵限速酶，參與植物中多個合成代謝途徑，包括花青素合成。通過 PCR 反應成功克隆出藜麥CHS基因（ "CqCHS1 "）的 cDNA 全長序列，并進行預測分析，包括 "CqCHS1 "基因結構和編碼的蛋白質保守結構域。同時，利用 qRT-PCR 技術檢測了在不同脅迫處理下 "CqCHS1 "的表達情況。結果表明， "CqCHS1 "基因包含2個外顯子和1個內含子，其編碼的蛋白質由392個氨基酸殘基組成。CqCHS1蛋白是親水性蛋白質，不存在信號肽，定位于細胞質。進化分析顯示， "CqCHS1 "與擬南芥 "AtCHS1 "的親緣關系最近，其基因功能可能存在相似性。此外，還發現在 "CqCHS1基因啟動子區域存在多個與脅迫和激素響應相關的順式作用元件。表達分析結果表明，藜麥幼苗中CqCHS1 "的表達不會受到干旱脅迫的影響，而外源脫落酸（ABA）處理會抑制 "CqCHS1 "的表達，低溫脅迫則會誘導 "CqCHS1 "的表達。本研究結果為進一步探究藜麥 "CqCHS1 "的基因功能提供了基礎。

關鍵詞： 藜麥；查爾酮合酶基因；克隆；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號：S519.01 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）01-0049-07

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）是一年生莧科藜屬作物，原產于南美洲安第斯山區，距今已有 7 000 多年的栽培歷史，因其出色的營養價值和抗逆能力，被聯合國糧食及農業組織認定為最適宜人類的全營養食品。同時，藜麥也是一種優秀的觀賞性植物，成熟期花色是景觀藜麥育種中重要的性狀之一，但對其花色形成機制的研究卻十分欠缺。查爾酮合酶（CHS）是植物類黃酮途徑的關鍵酶，其催化了1個分子的香豆酰CoA （coumaryl CoA）與3個分子的丙酚CoA （malonyl CoA）生成4，5，7-三羥基黃烷酮（narigeninchalcone），在植物器官著色、響應非生物脅迫等過程中發揮著重要的作用［1-5］。Reimold等于1983年發表了第1個荷蘭芹的CHS序列，此后高粱、玉米、矮牽牛、小麥、谷子等作物的CHS基因先后被克隆［6-10］。

目前關于藜麥CHS基因的研究鮮有報道，為了探究藜麥中CHS基因的功能，本研究克隆了藜麥 "CHS1 "基因，對藜麥 "CqCHS1 "基因進行生物信息學分析，研究其蛋白質相關特性，并用實時PCR（qRT-PCR）法分析其在不同脅迫下的表達差異，以期為藜麥花色調控、響應非生物脅迫的分子機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

藜麥品種蘇藜1號于2021年12月種植于江蘇省淮安市農科院科研創新基地溫室大棚，移栽7 d后分別進行5.0 mg/L脫落酸（ABA）、200 mmol/L甘露醇噴施，后置于4 ℃培養箱處理48 h，隨后將試驗材料裝入滅過菌的離心管中，立即加液氮，然后置于-80 ℃冰箱內保存。

1.2 藜麥 "CHS1 "基因cDNA的獲得

利用Ensemble Plant數據庫檢索擬南芥 "CHS1 "，然后在本地藜麥基因組數據庫中BLAST尋找其同源序列。通過生物信息學分析，拉取其編碼序列（CDS），并利用Primer 5.0軟件設計特異性引物（表1）。以藜麥葉片cDNA為模板進行擴增，獲得產物電泳檢測，隨后切膠回收目的條帶，連接到 pMD18-T 載體上，轉化大腸桿菌后送百格基因科技（江蘇）有限公司測序。

1.3 生物信息學分析

使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對藜麥CHS的一級結構及其理化性質進行分析；使用SOPMA（https：//links.jianshu.com/go？to=http%3A%2F%2Fnpsa-pbil.ibcp.fr%2Fcgi-bin%2Fnpsa_automat.pl%3Fpage%3Dnpsa_sopma.html）預測藜麥CHS 蛋白的二級結構；使用TMHMM 2.0 （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）預測藜麥CHS蛋白質跨膜區域；使用SigalP（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）對藜麥CHS的信號肽進行預測；使用ProtComp（https：//pypi.org/project/protcomp/）預測蛋白的亞細胞定位；使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive#structure）對藜麥CHS蛋白三維結構圖建模；使用MEGA 6.0軟件用鄰接法構建系統進化樹；使用Plantcare對CHS啟動子序列進行分析。

1.4 實時熒光定量 PCR 檢測

根據獲得的藜麥CHS 基因的核酸序列，利用Primer 5.0軟件設計熒光定量引物。以藜麥幼苗葉片cDNA 為模板， 選取 "EF1a "基因作為內參基因，參照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書，進行實時熒光定量分析。反應體系為cDNA 模板 1 μL，10 μmol/L "PF/PR 0.4 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 5.0 μL，RNase free H 2O 3.2 μL。反應程序設置為95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性 10 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，共 40 個循環。每個樣品重復3次，使用 2-ΔΔC T 法計算出目的基因的表達量。

2 結果與分析

2.1 ""CqCHS1 "基因的克隆

本研究首先對藜麥 "CqCHS1 "基因的CDS進行了擴增。用設計的基因特異性引物進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，擴增出的片段大小符合預期（圖1）。隨后對該PCR擴增產物進行測序后證實了該片段是大小為1 179 bp的 "CqCHS1 "基因的CDS片段（圖2）。

2.2 CqCHS1蛋白質的生物信息學分析

2.2.1 蛋白質理化性質分析

本研究對藜麥 "CqCHS1 "基因編碼的蛋白質理化性質進行了分析。ProtParam在線預測分析的結果（表2）表明，CqCHS1蛋白質的分子量為43.06 ku，分子式為C 1 913H 3 055N 513O 566S 24，總原子數6 071，包含392個氨基酸殘基。總的帶正電殘基（Asp+Glu）為44，帶負電殘基（Arg+Lys）為48。在 "CqCHS1 "編碼的蛋白質中，不含Pyl（O）和Sec（U），含量最高的是Leu（L），占10.5%（表3）。CqCHS1蛋白質的理論等電點為6.12，顯酸性；不穩定系數為38.95，屬于穩定蛋白質。脂溶指數為88.32，親水性評估分值為 -0.085，因此CqCHS1為親水蛋白質。

2.2.2 CqCHS1蛋白質結構分析

利用在線網站SWISS-MODEL和SOPMA對CqCHS1蛋白質序列進行結構建模與分析。預測及分析結果顯示，CqCHS1蛋白質氨基酸序列的二級結構包含α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲及延伸鏈（表4，圖3），各部分所占比例不同，最大量的結構元件是α-螺旋，占比為44.90%，接著是無規則卷曲，占比為32.14%。對CqCHS1蛋白質進行三維結構建模，根據建模情況匹配到的最佳模型見圖4，相似度達到84.79%。

2.2.3 CqCHS1蛋白跨膜結構域預測、亞細胞定位分析及信號肽預測

利用TMHMM在線工具對藜麥CqCHS1蛋白質的跨膜結構進行分析，結果顯示，該蛋白質不存在跨膜結構域（圖5）。隨后對 CqCHS1進行亞細胞定位分析，結果表明CqCHS1 蛋白質定位在細胞質。用 SigalP 5.1 對CqCHS1進行信號肽預測，由圖6可知，藜麥CqCHS1蛋白質中無信號肽存在的可能，屬于非分泌蛋白。

2.2.4 藜麥 "CqCHS1 "基因結構、CqCHS1蛋白質保守結構域及模體分析

利用TBtools對 "CqCHS1 "的基 因結構作圖（圖7-A），結果表明， "CqCHS1 "基因編碼區包含2個外顯子和1個內含子，在其5′和3′端都存在非翻譯區（UTR）。接著對 nbsp;CqCHS1 "基因編碼的蛋白質序列進行了分析，保守結構域預測結果表明，CqCHS1屬于PLN03170超家族（圖7-B、7-C），藜麥 "CqCHS1 "基因編碼的蛋白質具有ACP_syn_Ⅲ_C保守結構域，位于第 296～387個氨基酸，該結構域中包含了查爾酮合酶基因家族的特征氨基酸序列WGVLFGFGPGL。接著對CqCHS1蛋白質包含的模體進行分析，結果（圖7-D）顯示，CqCHS1蛋白質共存在10類包含不同氨基酸序列的模體，值得注意的是，10類模體的2個或3個重復并不是串聯存在，而是分布在CqCHS1蛋白的不同位置。

2.2.5 藜麥CqCHS1蛋白質系統進化分析

使用MEGA 6.0 軟件，對包括藜麥在內的9個物種的CHS蛋白質序列進行進化分析。結果顯示，藜麥CqCHS1與擬南芥AtCHS1、玉米ZmCHS1和水稻OsCHS1有較近的親緣關系，其中與擬南芥AtCHS1的親緣關系最近，二者處在同一進化分支上（圖8）。

2.2.6 藜麥 "CqCHS1 "基因啟動子上順式轉錄元件分析

轉錄因子通過與基因啟動子中的順式作用元件結合以調節下游基因的表達是植物參與環境變化響應的重要機制。本研究對藜麥 "CqCHS1 "基因編碼區上游2 000 bp的啟動子區域進行分析，預測該區域存在的可能與不同轉錄因子結合的順式作用元件。結果（圖9）表明，在藜麥 "CqCHS1 "啟動子區域存在多個與逆境脅迫響應相關的順式作用元件，包括MYB、G-Box及ARE等。同時鑒定到了與植物激素ABA、生長素和水楊酸響應相關的順式作用元件ABRE、AuxRR_core、TCA-element等。此外，該啟動子區域還存在與種子發育相關的順式作用元件RY-element，這些結果表明， "CqCHS1 "可能參與了藜麥對非生物脅迫的響應及種子的形成和發育。

2.3 藜麥 "CqCHS1 "基因在逆境脅迫下的表達

在藜麥 "CqCHS1 "上游啟動子區域鑒定到了多個與脅迫響應及植物激素響應相關的順式作用元件，表明 "CqCHS1 "基因可能參與了藜麥對非生物脅迫的響應。本研究利用qRT-PCR對該基因在不同脅迫下響應的表達情況進行了分析，結果顯示，在外源施加ABA之后，藜麥葉片中 "CqCHS1 "基因的相對表達量極顯著下調；而在低溫脅迫下， "CqCHS1 "基因被誘導表達，與對照相比其相對表達量表現為極顯著上調；在干旱脅迫下，藜麥葉片中 "CqCHS1 "基因的表達量與對照相比沒有顯著變化（圖10）。這些結果表明， "CqCHS1 "確實參與了藜麥對植物激素以及非生物脅迫的響應。

3 討論與結論

查爾酮合成酶（CHS）屬于植物聚酮合酶超家族成員，是植物類黃酮合成路徑中的1個關鍵限速酶，參與植物體中黃酮和類黃酮類化合物的生成。作為植物類黃酮類物質合成的關鍵基因，CHS基因參與了植物中包括花青素合成在內的多個合成代謝途徑。研究表明，CHS參與了花青苷的起始合成過程，并最終影響植物中花青素的積累［11］。CHS基因在植物生長發育過程中發揮著重要作用，對CHS基因功能的鑒定及其對參與基因調控網絡的解析已成為科學研究的熱點［12］。

本試驗以藜麥的CHS基因為研究對象，成功克隆出了 "CqCHS1 "的全長cDNA序列，之后對 "CqCHS1 "的基因結構和對編碼的蛋白質進行生物信息學分析。之前的研究表明，植物中CHS基因的編碼區序列是比較保守的，除金魚草等少數物種外，已經鑒定及克隆的多種植物的CHS基因編碼區都包含2個外顯子和1個內含子［13］，本研究關注的藜麥CHS基因編碼區同樣由2個外顯子和1個內含子組成。保守結構域是指在生物進化或者一個蛋白質家族中具有的相同的結構域。保守結構域通常具有重要的功能，并且與蛋白質完成生理功能有著密切的關系。對藜麥CHS編碼的蛋白質序列分析結果表明，CqCHS1蛋白質屬于PLN03170超家族，其蛋白質序列中包含查爾酮合酶基因家族特征氨基酸序列WGVLFGFGPGL，這與之前研究得出的CHS基因編碼的蛋白具有較強的保守性的結果是一致的。系統進化樹分析結果顯示，藜麥CqCHS1與擬南芥、水稻和玉米中的CHS蛋白質親緣關系較近，可以推測 "CqCHS1基因的功能與AtCHS1、OsCHS1和ZmCHS1 "可能也具有相似性。

多種植物CHS基因都會參與對植物激素和非生物脅迫的響應。鹽脅迫、低溫脅迫及干旱脅迫都能顯著誘導葡萄根中VvCHS基因的表達，其表達量相比于對照顯著上調［14］。在桑葚中，CHS基因能夠參與調控植株對干旱和鹽脅迫的耐受性［15］。向日葵HaCHS基因的表達受低溫和茉莉酸（JA）等的調控［16］。紫莖澤蘭查爾酮合成酶 "EaCHS1 "通過維持ROS穩態在植物對鹽脅迫的耐受性中發揮作用［17］。面對環境脅迫時，植物細胞通過多種信號傳導途徑傳遞脅迫信號，進而對脅迫做出應答。其中刺激誘導轉錄因子與基因啟動子區域順式作用元件結合進而調節下游基因的表達是植物參與對環境變化響應的重要機制。本研究在 "CqCHS1 "基因的啟動子區域檢測到了多個與激素和脅迫響應有關的順式作用元件，這為轉錄因子結合并進一步影響下游基因表達機制的存在提供了依據。基于這一結果，對 "CqCHS1 "基因的表達受脅迫處理的影響情況進行了檢測，結果表明，外源ABA處理能極顯著下調藜麥幼苗中 "CqCHS1 "基因的表達水平，相反，冷脅迫下 "CqCHS1 "基因的表達水平能被顯著誘導。這些結果表明，與其他植物中的CHS編碼基因一樣，藜麥 "CqCHS1 "基因在調控花青素合成的同時也參與了植株對外界環境和激素的響應。后續可以通過酵母單雜交篩庫等試驗篩選與 "CqCHS1 "啟動子區域結合的轉錄因子，探索該基因參與脅迫響應的調控網絡，同時可以利用基因編輯和基因過表達等方式對基因功能進行深入的研究。

花青素的累積決定著花色的形成及果實的著色，CHS也參與了植物中花青素的合成，之前研究表明，CHS在其他物種中參與了對病原體的防御和花色素的形成［18-20］。本研究沒有涉及到藜麥 "CqCHS1 "基因對花青素合成影響的研究，關于 "CqCHS1 "基因如何影響花青素的含量及其在花色改良方面的應用潛力還有待研究。

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收 稿日期：2023-03-22

基金項目：江蘇省現代農業產業技術體系推廣示范項目［編號：JATS（2022）210］；淮安市農科院科研發展基金（編號：HNY202126）；江蘇省農業科技自主創新資金［編號：CX（22）3188］。

作者簡介：尹 航（1996—），男，江蘇淮安人，碩士，研究實習員，主要從事藜麥育種研究。E-mail：2568572715@qq.com。

通信作者：吳傳萬，博士，研究員，主要從事作物生理與調控及植物生長調節劑研發。E-mail：hacwwu@163.com。