藜麥CqCHS1基因的克隆及脅迫下表達(dá)分析

摘要： 查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是植物類黃酮合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶，參與植物中多個(gè)合成代謝途徑，包括花青素合成。通過 PCR 反應(yīng)成功克隆出藜麥CHS基因（ "CqCHS1 "）的 cDNA 全長序列，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，包括 "CqCHS1 "基因結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，利用 qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)了在不同脅迫處理下 "CqCHS1 "的表達(dá)情況。結(jié)果表明， "CqCHS1 "基因包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)由392個(gè)氨基酸殘基組成。CqCHS1蛋白是親水性蛋白質(zhì)，不存在信號(hào)肽，定位于細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)化分析顯示， "CqCHS1 "與擬南芥 "AtCHS1 "的親緣關(guān)系最近，其基因功能可能存在相似性。此外，還發(fā)現(xiàn)在 "CqCHS1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)與脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。表達(dá)分析結(jié)果表明，藜麥幼苗中CqCHS1 "的表達(dá)不會(huì)受到干旱脅迫的影響，而外源脫落酸（ABA）處理會(huì)抑制 "CqCHS1 "的表達(dá)，低溫脅迫則會(huì)誘導(dǎo) "CqCHS1 "的表達(dá)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究藜麥 "CqCHS1 "的基因功能提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 藜麥；查爾酮合酶基因；克隆；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S519.01 "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）01-0049-07

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）是一年生莧科藜屬作物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，距今已有 7 000 多年的栽培歷史，因其出色的營養(yǎng)價(jià)值和抗逆能力，被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織認(rèn)定為最適宜人類的全營養(yǎng)食品。同時(shí)，藜麥也是一種優(yōu)秀的觀賞性植物，成熟期花色是景觀藜麥育種中重要的性狀之一，但對(duì)其花色形成機(jī)制的研究卻十分欠缺。查爾酮合酶（CHS）是植物類黃酮途徑的關(guān)鍵酶，其催化了1個(gè)分子的香豆酰CoA （coumaryl CoA）與3個(gè)分子的丙酚CoA （malonyl CoA）生成4，5，7-三羥基黃烷酮（narigeninchalcone），在植物器官著色、響應(yīng)非生物脅迫等過程中發(fā)揮著重要的作用［1-5］。Reimold等于1983年發(fā)表了第1個(gè)荷蘭芹的CHS序列，此后高粱、玉米、矮牽牛、小麥、谷子等作物的CHS基因先后被克隆［6-10］。

目前關(guān)于藜麥CHS基因的研究鮮有報(bào)道，為了探究藜麥中CHS基因的功能，本研究克隆了藜麥 "CHS1 "基因，對(duì)藜麥 "CqCHS1 "基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，研究其蛋白質(zhì)相關(guān)特性，并用實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）法分析其在不同脅迫下的表達(dá)差異，以期為藜麥花色調(diào)控、響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

藜麥品種蘇藜1號(hào)于2021年12月種植于江蘇省淮安市農(nóng)科院科研創(chuàng)新基地溫室大棚，移栽7 d后分別進(jìn)行5.0 mg/L脫落酸（ABA）、200 mmol/L甘露醇噴施，后置于4 ℃培養(yǎng)箱處理48 h，隨后將試驗(yàn)材料裝入滅過菌的離心管中，立即加液氮，然后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 藜麥 "CHS1 "基因cDNA的獲得

利用Ensemble Plant數(shù)據(jù)庫檢索擬南芥 "CHS1 "，然后在本地藜麥基因組數(shù)據(jù)庫中BLAST尋找其同源序列。通過生物信息學(xué)分析，拉取其編碼序列（CDS），并利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。以藜麥葉片cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物電泳檢測(cè)，隨后切膠回收目的條帶，連接到 pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后送百格基因科技（江蘇）有限公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)藜麥CHS的一級(jí)結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)進(jìn)行分析；使用SOPMA（https：//links.jianshu.com/go？to=http%3A%2F%2Fnpsa-pbil.ibcp.fr%2Fcgi-bin%2Fnpsa_automat.pl%3Fpage%3Dnpsa_sopma.html）預(yù)測(cè)藜麥CHS 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用TMHMM 2.0 （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）預(yù)測(cè)藜麥CHS蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域；使用SigalP（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）對(duì)藜麥CHS的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用ProtComp（https：//pypi.org/project/protcomp/）預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位；使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive#structure）對(duì)藜麥CHS蛋白三維結(jié)構(gòu)圖建模；使用MEGA 6.0軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用Plantcare對(duì)CHS啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)

根據(jù)獲得的藜麥CHS 基因的核酸序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物。以藜麥幼苗葉片cDNA 為模板， 選取 "EF1a "基因作為內(nèi)參基因，參照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。反應(yīng)體系為cDNA 模板 1 μL，10 μmol/L "PF/PR 0.4 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 5.0 μL，RNase free H 2O 3.2 μL。反應(yīng)程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性 10 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，共 40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，使用 2-ΔΔC T 法計(jì)算出目的基因的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ""CqCHS1 "基因的克隆

本研究首先對(duì)藜麥 "CqCHS1 "基因的CDS進(jìn)行了擴(kuò)增。用設(shè)計(jì)的基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，擴(kuò)增出的片段大小符合預(yù)期（圖1）。隨后對(duì)該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后證實(shí)了該片段是大小為1 179 bp的 "CqCHS1 "基因的CDS片段（圖2）。

2.2 CqCHS1蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

本研究對(duì)藜麥 "CqCHS1 "基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。ProtParam在線預(yù)測(cè)分析的結(jié)果（表2）表明，CqCHS1蛋白質(zhì)的分子量為43.06 ku，分子式為C 1 913H 3 055N 513O 566S 24，總原子數(shù)6 071，包含392個(gè)氨基酸殘基。總的帶正電殘基（Asp+Glu）為44，帶負(fù)電殘基（Arg+Lys）為48。在 "CqCHS1 "編碼的蛋白質(zhì)中，不含Pyl（O）和Sec（U），含量最高的是Leu（L），占10.5%（表3）。CqCHS1蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)為6.12，顯酸性；不穩(wěn)定系數(shù)為38.95，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂溶指數(shù)為88.32，親水性評(píng)估分值為 -0.085，因此CqCHS1為親水蛋白質(zhì)。

2.2.2 CqCHS1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

利用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL和SOPMA對(duì)CqCHS1蛋白質(zhì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模與分析。預(yù)測(cè)及分析結(jié)果顯示，CqCHS1蛋白質(zhì)氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈（表4，圖3），各部分所占比例不同，最大量的結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋，占比為44.90%，接著是無規(guī)則卷曲，占比為32.14%。對(duì)CqCHS1蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，根據(jù)建模情況匹配到的最佳模型見圖4，相似度達(dá)到84.79%。

2.2.3 CqCHS1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位分析及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用TMHMM在線工具對(duì)藜麥CqCHS1蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)不存在跨膜結(jié)構(gòu)域（圖5）。隨后對(duì) CqCHS1進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明CqCHS1 蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)。用 SigalP 5.1 對(duì)CqCHS1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，由圖6可知，藜麥CqCHS1蛋白質(zhì)中無信號(hào)肽存在的可能，屬于非分泌蛋白。

2.2.4 藜麥 "CqCHS1 "基因結(jié)構(gòu)、CqCHS1蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域及模體分析

利用TBtools對(duì) "CqCHS1 "的基 因結(jié)構(gòu)作圖（圖7-A），結(jié)果表明， "CqCHS1 "基因編碼區(qū)包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，在其5′和3′端都存在非翻譯區(qū)（UTR）。接著對(duì) nbsp;CqCHS1 "基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CqCHS1屬于PLN03170超家族（圖7-B、7-C），藜麥 "CqCHS1 "基因編碼的蛋白質(zhì)具有ACP_syn_Ⅲ_C保守結(jié)構(gòu)域，位于第 296～387個(gè)氨基酸，該結(jié)構(gòu)域中包含了查爾酮合酶基因家族的特征氨基酸序列WGVLFGFGPGL。接著對(duì)CqCHS1蛋白質(zhì)包含的模體進(jìn)行分析，結(jié)果（圖7-D）顯示，CqCHS1蛋白質(zhì)共存在10類包含不同氨基酸序列的模體，值得注意的是，10類模體的2個(gè)或3個(gè)重復(fù)并不是串聯(lián)存在，而是分布在CqCHS1蛋白的不同位置。

2.2.5 藜麥CqCHS1蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA 6.0 軟件，對(duì)包括藜麥在內(nèi)的9個(gè)物種的CHS蛋白質(zhì)序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，藜麥CqCHS1與擬南芥AtCHS1、玉米ZmCHS1和水稻OsCHS1有較近的親緣關(guān)系，其中與擬南芥AtCHS1的親緣關(guān)系最近，二者處在同一進(jìn)化分支上（圖8）。

2.2.6 藜麥 "CqCHS1 "基因啟動(dòng)子上順式轉(zhuǎn)錄元件分析

轉(zhuǎn)錄因子通過與基因啟動(dòng)子中的順式作用元件結(jié)合以調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)是植物參與環(huán)境變化響應(yīng)的重要機(jī)制。本研究對(duì)藜麥 "CqCHS1 "基因編碼區(qū)上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)該區(qū)域存在的可能與不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件。結(jié)果（圖9）表明，在藜麥 "CqCHS1 "啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，包括MYB、G-Box及ARE等。同時(shí)鑒定到了與植物激素ABA、生長素和水楊酸響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件ABRE、AuxRR_core、TCA-element等。此外，該啟動(dòng)子區(qū)域還存在與種子發(fā)育相關(guān)的順式作用元件RY-element，這些結(jié)果表明， "CqCHS1 "可能參與了藜麥對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)及種子的形成和發(fā)育。

2.3 藜麥 "CqCHS1 "基因在逆境脅迫下的表達(dá)

在藜麥 "CqCHS1 "上游啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到了多個(gè)與脅迫響應(yīng)及植物激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，表明 "CqCHS1 "基因可能參與了藜麥對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。本研究利用qRT-PCR對(duì)該基因在不同脅迫下響應(yīng)的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，在外源施加ABA之后，藜麥葉片中 "CqCHS1 "基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)；而在低溫脅迫下， "CqCHS1 "基因被誘導(dǎo)表達(dá)，與對(duì)照相比其相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為極顯著上調(diào)；在干旱脅迫下，藜麥葉片中 "CqCHS1 "基因的表達(dá)量與對(duì)照相比沒有顯著變化（圖10）。這些結(jié)果表明， "CqCHS1 "確實(shí)參與了藜麥對(duì)植物激素以及非生物脅迫的響應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

查爾酮合成酶（CHS）屬于植物聚酮合酶超家族成員，是植物類黃酮合成路徑中的1個(gè)關(guān)鍵限速酶，參與植物體中黃酮和類黃酮類化合物的生成。作為植物類黃酮類物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因，CHS基因參與了植物中包括花青素合成在內(nèi)的多個(gè)合成代謝途徑。研究表明，CHS參與了花青苷的起始合成過程，并最終影響植物中花青素的積累［11］。CHS基因在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)CHS基因功能的鑒定及其對(duì)參與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析已成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)［12］。

本試驗(yàn)以藜麥的CHS基因?yàn)檠芯繉?duì)象，成功克隆出了 "CqCHS1 "的全長cDNA序列，之后對(duì) "CqCHS1 "的基因結(jié)構(gòu)和對(duì)編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。之前的研究表明，植物中CHS基因的編碼區(qū)序列是比較保守的，除金魚草等少數(shù)物種外，已經(jīng)鑒定及克隆的多種植物的CHS基因編碼區(qū)都包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子［13］，本研究關(guān)注的藜麥CHS基因編碼區(qū)同樣由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成。保守結(jié)構(gòu)域是指在生物進(jìn)化或者一個(gè)蛋白質(zhì)家族中具有的相同的結(jié)構(gòu)域。保守結(jié)構(gòu)域通常具有重要的功能，并且與蛋白質(zhì)完成生理功能有著密切的關(guān)系。對(duì)藜麥CHS編碼的蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果表明，CqCHS1蛋白質(zhì)屬于PLN03170超家族，其蛋白質(zhì)序列中包含查爾酮合酶基因家族特征氨基酸序列WGVLFGFGPGL，這與之前研究得出的CHS基因編碼的蛋白具有較強(qiáng)的保守性的結(jié)果是一致的。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，藜麥CqCHS1與擬南芥、水稻和玉米中的CHS蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較近，可以推測(cè) "CqCHS1基因的功能與AtCHS1、OsCHS1和ZmCHS1 "可能也具有相似性。

多種植物CHS基因都會(huì)參與對(duì)植物激素和非生物脅迫的響應(yīng)。鹽脅迫、低溫脅迫及干旱脅迫都能顯著誘導(dǎo)葡萄根中VvCHS基因的表達(dá)，其表達(dá)量相比于對(duì)照顯著上調(diào)［14］。在桑葚中，CHS基因能夠參與調(diào)控植株對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性［15］。向日葵HaCHS基因的表達(dá)受低溫和茉莉酸（JA）等的調(diào)控［16］。紫莖澤蘭查爾酮合成酶 "EaCHS1 "通過維持ROS穩(wěn)態(tài)在植物對(duì)鹽脅迫的耐受性中發(fā)揮作用［17］。面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)，植物細(xì)胞通過多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑傳遞脅迫信號(hào)，進(jìn)而對(duì)脅迫做出應(yīng)答。其中刺激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)是植物參與對(duì)環(huán)境變化響應(yīng)的重要機(jī)制。本研究在 "CqCHS1 "基因的啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到了多個(gè)與激素和脅迫響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，這為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并進(jìn)一步影響下游基因表達(dá)機(jī)制的存在提供了依據(jù)。基于這一結(jié)果，對(duì) "CqCHS1 "基因的表達(dá)受脅迫處理的影響情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，外源ABA處理能極顯著下調(diào)藜麥幼苗中 "CqCHS1 "基因的表達(dá)水平，相反，冷脅迫下 "CqCHS1 "基因的表達(dá)水平能被顯著誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明，與其他植物中的CHS編碼基因一樣，藜麥 "CqCHS1 "基因在調(diào)控花青素合成的同時(shí)也參與了植株對(duì)外界環(huán)境和激素的響應(yīng)。后續(xù)可以通過酵母單雜交篩庫等試驗(yàn)篩選與 "CqCHS1 "啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，探索該基因參與脅迫響應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)可以利用基因編輯和基因過表達(dá)等方式對(duì)基因功能進(jìn)行深入的研究。

花青素的累積決定著花色的形成及果實(shí)的著色，CHS也參與了植物中花青素的合成，之前研究表明，CHS在其他物種中參與了對(duì)病原體的防御和花色素的形成［18-20］。本研究沒有涉及到藜麥 "CqCHS1 "基因?qū)ㄇ嗨睾铣捎绊懙难芯浚P(guān)于 "CqCHS1 "基因如何影響花青素的含量及其在花色改良方面的應(yīng)用潛力還有待研究。

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收 稿日期：2023-03-22

基金項(xiàng)目：江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系推廣示范項(xiàng)目［編號(hào)：JATS（2022）210］；淮安市農(nóng)科院科研發(fā)展基金（編號(hào)：HNY202126）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號(hào)：CX（22）3188］。

作者簡(jiǎn)介：尹 航（1996—），男，江蘇淮安人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事藜麥育種研究。E-mail：2568572715@qq.com。

通信作者：吳傳萬，博士，研究員，主要從事作物生理與調(diào)控及植物生長調(diào)節(jié)劑研發(fā)。E-mail：hacwwu@163.com。