脂氧合酶對甜瓜果實后熟軟化生理及相關基因表達的影響

摘要： 為探究甜瓜果實在采后貯藏過程中脂氧合酶對果實后熟軟化生理及相關基因表達的影響，以西州蜜17號為試驗材料，通過對甜瓜果實貯藏期間脂氧合酶活性、乙烯釋放量、果實硬度、呼吸強度、果膠酶活性、淀粉酶活性以及相關基因表達量進行測定，研究甜瓜果實采后脂氧合酶代謝、乙烯產生、后熟軟化生理及相關基因表達的作用關系。分別將甜瓜果實在20 ℃貯藏（對照組）、經1-MCP處理后20 ℃貯藏、2 ℃貯藏，分析甜瓜果實中LOX活性與乙烯釋放量的變化趨勢。結果表明，在甜瓜果實后熟軟化過程中，LOX活性上升先于乙烯釋放量的增加，而在乙烯釋放量與呼吸強度躍變后，LOX活性逐漸下降。同時，果實中果膠酶與淀粉酶活性及其基因表達量在躍變現象發生后顯著增加，果實硬度隨之迅速下降，說明果膠酶與淀粉酶基因表達增強和酶活性升高是甜瓜果實發生軟化的關鍵因素。此外，LOX活性升高能夠啟動乙烯釋放量的增加，促使果實發生呼吸躍變并進入后熟階段，但乙烯對LOX卻沒有調控作用。由此可知，LOX活性對果膠和淀粉的變化沒有直接影響，而是通過啟動乙烯的釋放來調節果膠和淀粉的代謝反應，使果實發生軟化。

關鍵詞： 脂氧合酶；甜瓜；后熟軟化；細胞壁代謝；果膠酶；基因表達

中圖分類號：S652.01 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）01-0128-06

甜瓜（Cucumis melo L.）是重要的園藝特色瓜果，其肉質松脆、風味濃郁，深受消費者青睞。海南是我國重要的甜瓜繁育基地，經多年培育和優化，已形成了諸多風味口感俱佳、果實大小適中、抗病性強、商品性好的優良品種，如西州蜜17號、翠玉、金香玉等。甜瓜屬于呼吸躍變型果實，果實采后貯藏過程中易發生后熟生理，表現為迅速軟化并腐爛［1］，導致甜瓜的貯藏時間普遍較短。

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）是植物體內脂肪酸代謝的重要酶［2］，廣泛參與植物的生長發育、成熟、衰老等生理代謝過程。乙烯是促使果實發生后熟軟化生理的關鍵物質［3］。有研究表明，果實乙烯代謝速率的躍變由LOX的反應產物所啟動。此外，用外源乙烯處理果實，可以使LOX活性增強，加速果實后熟軟化［4］。

細胞壁結構的完整性對維持果實的硬度至關重要，果膠是細胞壁的重要組分，原果膠能夠將纖維素與半纖維素聚合為堅固的細胞壁結構，果實在軟化過程中，原果膠不斷水解，使原細胞壁結構逐漸解聚松散，導致果實變軟，在此過程中，多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠甲酯酶（PME）是果實發生軟化的關鍵酶［5］。

淀粉是果實細胞結構重要的支撐物質，對維持果實硬度有重要作用［6-7］。李馨玥等在研究南果梨果實發育過程中發現，果實在軟化過程中其淀粉不斷被水解，果實硬度不斷下降［8］。

目前，對甜瓜貯藏過程中脂氧合酶與乙烯的作用及其對果實后熟軟化的影響研究還鮮有報道。鑒于此，本研究以西州蜜17號為試驗材料，將甜瓜果實分別在20 ℃常溫貯藏、經1-甲基環丙烯（1-MCP）處理后20 ℃貯藏和2 ℃貯藏， 研究甜瓜在貯藏過程中脂氧合酶活性、乙烯釋放與呼吸代謝、果實軟化生理、果膠酶與淀粉酶活性，闡明脂氧合酶對甜瓜果實乙烯產生及后熟軟化的影響，為甜瓜貯藏保鮮并延緩果實軟化、提高其商品性提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗地點在海南省農業科學院農產品加工設計研究所，試驗時間為2022年6月至2023年5月。西州蜜17號甜瓜果實購自海南省東方市感城鎮甜瓜種植基地。其余試劑與張強等研究所使用的試劑［9］相同。

1.2 儀器與設備

本試驗的儀器設備與張強等研究所使用的設備［9］相同。

1.3 試驗方法

1.3.1 甜瓜果實的處理

試驗樣本的選取和處理參考張強等的方法［9］進行。

對照組：果實在（20±1） ℃貯藏；冷藏（2 ℃）處理：將果實預冷后貯藏于（2±0.5） ℃；1-甲基環丙烯（1-MCP）處理：參照高芳等的方法［10］，處理后在（20±1） ℃條件下貯藏。

每2 d對果實硬度、呼吸強度、乙烯釋放量、果膠酶活性、淀粉酶活性及酶基因表達等指標測定1次，共測9次。

1.3.2 果實硬度測定

參照李響等的方法［11］進行，每個處理果實數為9個，每個處理重復3次，單位：kg/cm2。

1.3.3 呼吸強度與乙烯釋放量的測定

呼吸強度：參照張強等的方法［9，12］測定，單位：mg/（kg·h）。

乙烯釋放量：參照張強等的方法［9，13］測定，每次取9個果實，分3組，每組3個果實，重復3次，單位：μL/（kg·h）。

1.3.4 原果膠與可溶性果膠含量的測定 參照紀淑娟等的方法［14］進行測定，單位均為mg/g FW。

1.3.5 果實淀粉含量的測定 參照謝季云等的方法［15］，稱取2.0 g鮮果肉，研磨后加入80%乙醇 80 ℃ 水浴20 min，離心，取上清液，蒸去乙醇，加 2 mL 水溶解殘留物，經微孔濾膜（0.25 μm）過濾，將殘余物用高氯酸提取，用蒽酮比色法測定生成的葡萄糖含量，根據葡萄糖標準曲線計算淀粉含量，重復3次。

1.3.6 脂氧合酶、果膠酶、淀粉酶活性的測定

脂氧合酶液提取和活性測定參照胡妍蕓等的方法［16］進行，反應酶液在234 nm波長處的吸光度1 min增加0.001為1個酶活力單位，記為：U 234 nm/（g·min）。 多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）活性參照李瑞娟等的方法［17］測定，單位：μg/（g·min）。果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）活性參照吳瓊等的方法［18］測定，單位：mmol/（g·min）。淀粉酶液提取和活性測定參照龐敏等的方法［19］進行，酶活性以D 520 nm表示，單位：U。以失活酶液作空白對照，重復3次。

1.3.7 果實酶基因的定量表達分析

基因的定量表達通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析［20-21］，以Actin為內參基因，所需引物見表1。

1.4 數據統計分析

采用Origin 9.0進行數據分析與作圖，用SPSS 17.0軟件系統進行方差分析，以Plt;0.05作為差異顯著的標準。

2 結果與分析

2.1 不同處理對甜瓜貯藏過程中脂氧合酶活性、乙烯釋放量與呼吸強度的影響

由圖1-A可知，對照組與1-MCP處理甜瓜果實LOX活性在貯藏18 d后差異不顯著（Pgt;0.05），在貯藏初期呈現上升趨勢，并且均在處理 6 d 時達到峰值，隨后下降并長期保持平穩。果實在2 ℃條件下貯藏，果實內LOX被強烈抑制，LOX活性顯著低于照組和1-MCP處理組（Plt;0.05）。由圖1-B、圖1-C可知，對照組與1-MCP處理組果實乙烯釋放量與呼吸強度存在躍變現象，對照組躍變期較早，且峰值較高；1-MCP處理對乙烯釋放有顯著的抑制作用（Plt;0.05），躍變有所延遲，躍變峰值也較小。果實在2 ℃條件下貯藏，乙烯釋放量與呼吸強度均沒有發生躍變現象。

2.2 不同處理對甜瓜果實硬度的影響

圖2顯示，對照組果實硬度下降最為明顯，且在處理8～10 d硬度下降較快，之后下降緩慢；1-MCP處理組果實硬度也不斷下降，但較對照組下降緩慢，3個試驗組中，2 ℃貯藏處理果實硬度下降最為緩慢，至貯藏18 d時僅略有降低。結合圖1分析可知，乙烯釋放、呼吸躍變后，果實硬度下降較為迅速。若躍變受到延遲與抑制，則果實硬度的下降也會發生相應的變化。

2.3 不同處理對果實果膠、淀粉含量的影響

在貯藏過程中，對照組與1-MCP處理組果實原果膠含量均有不同程度下降；可溶性果膠含量則呈相反的變化趨勢，隨著貯藏時間的延長而不斷上升（圖3-A、圖3-B）。其中，對照組的變化速度最快，1-MCP處理組次之，2 ℃組變化最為緩慢（Plt;0.05）。由圖3-C可知，在對照組中，果實中淀粉快速降解，含量迅速下降；1-MCP處理能夠減緩淀粉降解速率，但淀粉含量下降幅度仍然較大；在2 ℃處理下，果實淀粉降解被顯著抑制，下降緩慢。

結合圖1、圖2與圖3分析可知，LOX活性的變化對果膠、淀粉含量不產生影響，但初期LOX活性升高，果實硬度也發生降低。乙烯與果膠、淀粉含量 變化密切相關，乙烯釋放量快速增加，原果膠、淀粉含量則快速減少。1-MCP對乙烯產生具有抑制作用，因此，果實中原果膠、淀粉含量的下降速度變緩。并且，隨著原果膠、淀粉含量的降低，果實硬度下降，而可溶性果膠含量與果實硬度的變化趨勢則相反。低溫下貯藏，果實中的酶活性與生理代謝均受到抑制，果實的硬度能夠長期保持。

2.4 果膠酶活性及其基因表達分析

2.4.1 PG活性與CmPG表達情況分析

由圖4-A、圖4-B可知，果實中PG活性與其基因表達量呈正相關，1-MCP處理與2 ℃貯藏組的果實樣本中PG活性與CmPG表達量均低于對照組樣本，對照組果實PG活性與CmPG表達量在處理8 d時達到最大值，之后快速下降；1-MCP處理組果實在處理 12 d 時出現較小的躍變峰。在 2 ℃條件下，果實PG活性與CmPG表達量水平均很低，且長期保持平穩，未出現躍變現象。

2.4.2 PME活性與CmPME表達情況分析

由圖5-A、圖5-B可知，對照組果實PME活性與CmPME表達量在貯藏前期已有顯著上升，并存在躍變現象，在處理6 d時出現躍變峰，10 d后下降緩慢。1-MCP處理組果實PME活性與CmPME表達量在前期較為平穩，在處理10～12 d有小幅上升，之后緩慢下降。果實在2 ℃條件下貯藏， PME活性與CmPME表達量均受到較強的抑制作用，始終處于較低水平。

2.5 淀粉酶（AM）活性及其基因表達分析

由圖6可知，對照組果實在貯藏前期淀粉酶（AM）活性緩慢上升，6 d后快速升高，CmAM表達量亦迅速增加，8 d時達到峰值，之后下降。1-MCP處理組AM活性與CmAM表達量受到一定程度的抑制，但一直呈緩慢上升趨勢，并在貯藏后期顯著高于對照組（Plt;0.05）。在2 ℃條件下，果實AM活性與CmAM表達量受到較強的抑制作用，且始終穩定在較低水平。

結合圖1分析可知，果膠酶、淀粉酶及其基因表達不受LOX活性的調控，但卻與乙烯釋放量與呼吸強度的變化密切相關。

3 討論與結論

乙烯是果實成熟軟化生理代謝的重要物質，LOX能夠影響乙烯的代謝［22］。LOX能夠直接作用于細胞膜并催化其降解，以促進乙烯合成酶與底物的反應產生乙烯。同時，LOX途徑產生的氫過氧化物與自由基參與乙烯的合成轉化，使乙烯增加，從而加速果實的成熟軟化［23］。此外，誘導香蕉 "MaLOX1 "基因的表達，能夠加快果實的成熟［24］。本研究中發現，LOX活性升高先于乙烯釋放與呼吸躍變的發生，說明LOX活性升高可能啟動了乙烯的生成并發生一系列的后熟生理代謝反應，這驗證了前人的研究結論。

同時，LOX的活性也受乙烯調節。梁馨元的研究顯示，用外源乙烯處理番茄，番茄果實的LOX活性有所升高，促進果實后熟軟化［25］，乙烯抑制劑 1-MCP 處理則能降低香瓜中LOX的活性［26］，還能夠抑制蘋果LOX基因的表達［27］。在本研究中卻發現，乙烯釋放量的變化對LOX活性沒有影響，LOX與乙烯調控作用具有單向性，即LOX能夠啟動乙烯釋放與呼吸躍變，但乙烯對LOX的活性卻沒有調控作用，并且，LOX活性變化不受乙烯抑制劑1-MCP的影響，這與Defilippi等的研究結論［28］相一致，說明不同果實之間LOX與乙烯的相互調控關系存在較大的差異性。

原果膠水解轉化為可溶性果膠，是導致果實硬度下降的重要因素［29-30］。本研究顯示，貯藏初期，LOX活性升高，原果膠、可溶性果膠含量以及果膠酶活性、酶基因表達量變化并不明顯，但果實硬度卻有所下降，說明此階段果實的軟化可能是由于LOX直接作用于細胞膜所致，由于LOX活性升高幅度不大，果實硬度下降也較少，而在乙烯釋放躍變后，果膠酶活性、基因表達均快速升高，果實硬度則迅速下降。因此，乙烯促使果膠酶活性與酶基因表達的升高對甜瓜果實的軟化起更重要的作用。

淀粉是細胞壁重要的支撐物質，對維持果實硬度起重要作用。紅陽獼猴桃果實在軟化階段淀粉酶活性快速上升，淀粉酶引起淀粉水解產生糖，為呼吸躍變提供能源物質，之后乙烯釋放量不斷增加，又促進了淀粉酶基因表達，促使酶活性升高，淀粉水解，果實硬度不斷下降［31］。在對桃的研究中也有類似發現，在桃果實軟化過程中，淀粉酶活性升高，淀粉大量降解，淀粉含量迅速下降［32］。本研究結果表明，LOX與淀粉酶活性的變化存在不同步性，并且在LOX活性的快速升高階段，淀粉酶活性與淀粉含量未發生明顯變化。此外，淀粉酶活性、基因表達量的升高先于乙烯躍變的發生，并且在躍變后長期保持較高活性，淀粉含量不斷降低，果實硬度也隨之下降。這說明LOX與淀粉代謝相對獨立，而淀粉代謝、乙烯釋放以及果實軟化間則存在密切關系。

由于1-MCP對乙烯的抑制作用，果膠酶、淀粉酶活性及其基因表達量均發生相應的變化。此外，由于低溫下果實中各酶活性與生理代謝均受到顯著抑制，果實沒有出現后熟軟化現象，果實硬度能夠較長時間保持不變。

綜上所述，在甜瓜果實貯藏過程中，LOX能夠啟動果實的乙烯生理代謝，促進乙烯的生成，進而引起果實的乙烯釋放量與呼吸躍變；但乙烯對LOX卻沒有明顯的影響。LOX對果實的細胞壁代謝未發現有明顯的調控作用， 對果膠酶和淀粉酶活性的變化不產生影響，乙烯代謝與果膠酶活性、基因表達變化以及淀粉代謝則存在密切關系，對果實的后熟生理代謝有重要的促進作用，并能夠加速果實的軟化。

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收 稿日期：2023-06-20

基金項目：海南省自然科學基金（編號：322QN422）；海南經貿職業技術學院高層次人才科研啟動金項目（編號：hnjmk2022303）。

作者簡介：代文婷（1988—），女，新疆石河子人，碩士，助理研究員，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：1227008228@qq.com。

通信作者：張 強，博士，副教授，主要從事食品科學研究。E-mail：821861127@qq.com。