植物病原真菌及卵菌SNAREs基因功能研究進展

摘要： 植物病原真菌和卵菌產生的效應蛋白在促進病原菌侵染、操縱寄主免疫方面有關鍵作用，這些效應蛋白在與寄主作用之前必須被分泌出去，SNARE蛋白家族作為真核細胞內囊泡轉運及膜融合的關鍵組分，在分子轉運中有核心調控作用。隨著許多植物絲狀病原菌基因組被破譯，對SNAREs基因參與病原菌致病機制的研究取得了可喜進展。本研究簡要概述了真核生物中SNARE蛋白的組成及分類和植物病原真菌及卵菌中SNARE蛋白基因的功能研究進展，并據此提出進一步開展SNARE蛋白基因功能分析的研究建議，以期為全面、深入研究植物病原真菌和卵菌中SNARE基因的功能、理解病原菌致病、效應蛋白分泌提供新的視野，為植物-病原物互作的分子機制研究提供參考。

關鍵詞： 植物病原菌；真菌；卵菌；效應分子；SNARE蛋白

中圖分類號：S432.4+4 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）01-0001-09

為成功侵染并定殖于寄主植物，植物病絲狀病原菌（真菌和卵菌）通過各種分泌蛋白（效應物）來破壞宿主細胞成分，調節宿主免疫反應并引發寄主壞死［1-2］。根據分泌的效應分子在寄主植物中作用的位置，可以將它們分為質外體效應分子（apoplastic effector）和細胞質效應分子（cytoplasmic effector）2類［1，3］。其中質外體效應分子位于病原菌與寄主之間的界面上，在寄主細胞外發揮作用，而細胞質效應子不同于質外體效應子，它們被分泌并轉移到寄主細胞內發揮作用，其中卵菌中已鑒定出的RXLR、Crinkler（CRN）為細胞質效應物［1］。植物絲狀病原菌分泌的效應分子能以多種方式干擾寄主植物的免疫反應，并在幫助病原菌侵染的過程中發揮毒性。在植物病原細菌中，效應蛋白通過一種保守的Ⅲ型分泌系統（T3SS）直接以注射的方式被送入寄主細胞內［4］。然而，人們對植物絲狀病原菌效應分子的轉運、分泌機制和途徑知之甚少。真核細胞蛋白質在合成后通過傳統分泌途徑轉運，最后階段的分泌涉及胞吐作用。植物絲狀病原菌效應分子的轉運可能也是借助傳統囊泡運輸分泌途徑，最后以可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體蛋白（SNAREs）介導的囊泡與質膜融合分泌運往細胞器或質膜。研究者發現，玉米黑粉病病菌（Ustilago maydis）中的 "Yup1 "可介導早期核內體的內吞循環，對菌絲形態發生和發病機制至關重要［5］。在稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）中，效應蛋白在轉運前被包裝在BIC的動態囊狀膜效應區（MECs）中，網格蛋白介導的內吞作用參與MEC的形成和致病［6］。最近Wang等對致病疫霉（Phytophthora infestans）的研究也證明了RXLR效應蛋白通過網格蛋白介導的內吞作用（CME）被吸收到植物細胞中［7］。

在真核細胞中，蛋白質、脂類在不同細胞器間的運輸由運輸囊泡定向轉運來介導完成，沿著高度有組織的定向路線流動，使細胞能夠分泌、進食和重塑質膜和細胞器。囊泡運輸是一個極復雜的動態過程，主要包括囊泡出芽、運輸、束縛和膜融合4個基本步驟，在最后的融合步驟中，運輸囊泡必須高度準確地識別要與之融合的正確靶膜，離不開核心調控蛋白家族可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白附著蛋白受體蛋白（SNAREs）的介導［8-9］。無論是在酵母中還是人體中，大量SNARE蛋白復合體已被揭示在運輸囊泡靶向和與靶膜融合中發揮重要作用，并有研究發現許多與分泌和內吞途徑密切相關的蛋白。在細胞內，不同功能的SNARE蛋白參與不同的轉運步驟，只有隨著分泌型SNARE蛋白數量的增加，組織內的單個細胞才能將物質輸送到其質膜的不同區域。此外，不同物種間可能重復了許多SNARE蛋白，隨后進一步多樣化［10-11］。SNARE蛋白參與分泌囊泡與質膜融合的機制，及其在調節真核細胞生長發育中的重要作用一直備受關注［9，12］。隨著基因組不斷被破譯，在真菌和卵菌的研究中，不同物種的SNARE蛋白不斷被鑒定出來，但SNARE在病原真菌與卵菌的致病過程中發揮的重要作用還未完全被解析。

近年來，國內外研究人員對植物病原真菌如稻瘟病病菌、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、金黃殼囊孢菌（Cytospora chrysosperma）、炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、番茄枯萎病病菌（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici，Fol）、小麥赤霉病病菌（Gibberella zeae）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、玉米黑粉病病菌和卵菌如大豆疫霉（P. sojae）SNARE蛋白編碼基因 "PsYkt6、PsVamp7、PsTlg1、PsSso1/Sso2 "等開展了研究，并揭示了這些SNARE基因在參與植物病原菌的發育和毒力相關蛋白的運輸中起著重要作用。本研究簡要對真核生物中SNAREs蛋白的組成及結構功能、植物病原真菌及卵菌中SNARE蛋白基因的功能研究進行了綜述，并據此提出了進一步開展SNARE蛋白基因功能分析的建議，以期為全面、深入研究植物病原真菌和卵菌中SNARE基因的功能、理解病原菌致病性、效應蛋白分泌提供新的視野，為寄主-病原物相互作用機制研究提供科學參考。

1 真核生物中SNARE蛋白的組成及結構功能

1.1 SNARE結構與分類

在真核細胞中，內膜系統不同部分之間的定向轉運是由囊泡介導的，這些囊泡從供體細胞器中出芽，然后與受體細胞器融合。目前普遍認為，SNAREs是對接的最后階段和隨后融合的各種囊泡介導的運輸事件的主要參與者，是一個超基因蛋白家族，通常是長度為100～300個氨基酸的小蛋白，參與了運輸小泡與靶膜的錨定并催化了配送中間體，促進其與靶膜相互融合［13-14］。目前，已報道的膜融合過程在所有真核生物中都是高度保守的，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中發現了多達24種已知的SNARE蛋白，在人類中發現36個成員，在構巢曲霉（Aspergillus oryzae）中發現21個成員，在擬南芥中也發現64個成員［15-18］。SNAREs有1個簡單的結構域結構，并具有1個特征的SNAREs基序——1個進化上保守的長度，由60～70個氨基酸組成，以七肽重復的形式排列。在它們的C末端，大多數SNAREs都有1個跨膜結構域，該結構域通過1個短接頭與SNARE基序相連。許多SNAREs具有獨立的折疊結構域，這些結構域位于SNARE基序的N端，并且在SNARE的亞組之間變化［9］。最初，SNARE在功能上被歸類為運輸囊泡相關蛋白或靶膜相關蛋白（分別為v-、t-SNARE），兩者相互配對在細胞內膜融合中起著核心作用［19］。然而，由于需要進一步對SNARE蛋白介導的膜融合機制進行詮釋，且該分類在酵母液泡的同型融合中不適用，因此后來SNARE蛋白形成了更加嚴謹的分類系統［9］。轉運囊泡和靶膜之間的特異性膜融合確保了轉運的準確性，并由SNARE復合體介導，該復合體組裝成1個由4個螺旋組成的緊密簇，該束的中心兼容了16層互作的側鏈［20］。由圖1可見，基于SNARE結構域四螺旋束中“0”層位置的殘基，SNARE在結構上可以分為 Qa-、Qb-、Qc-和R-SNAREs 4個主要亞家族［9，21］。事實上，對釀酒酵母、擬南芥和哺乳動物SNARE序列的系統發育分析發現，這4個SNARE亞家族在真核進化的早期是高度保守和分化的［17］。

1.2 真核生物中SNARE蛋白的分布及保守性

SNAREs似乎在分泌途徑的所有運輸步驟中都介導了膜融合。目前，在內質網、高爾基體膜、液泡/溶酶體和質膜上及從這些膜上衍生的囊泡上都發現了SNARE蛋白，圖2為SNAREs蛋白在真核生物胞內膜運輸途徑中的排布［9］。真核細胞中包含許多SNARE蛋白，為了使 SNARE在特定的細胞內融合步驟中發揮作用，必須確保每個細胞內膜都配備適當的SNARE蛋白組。單個SNARE可以在多個運輸步驟中起作用，也可能需要與幾個不同的SNAREs協同配合［22］。但不同的運輸步驟可能使用不同組合的Q-和T-SNARE來參與，因此有些膜融合過程也可能會有固定的SNARE蛋白組合。如在釀酒酵母中Sso1p、Sso2p在結構及功能上分別屬于Qa-、t-SNARE蛋白，高度同源，不僅參與囊泡運輸中后期分泌小泡與質膜的相互融合，而且介導了產孢時期的囊泡與囊泡間的融合［23-24］。禾谷鐮刀菌中FgVam7-FgVps39-FgSso1作為一個蛋白復合體，在囊泡運輸、內吞和自噬過程中發揮作用，從而控制植物的發育、植物感染和脫氧雪腐菌醇（DON）的產生［25］。

在過去的幾十年中，研究者已經在各種不同真核生物中分析了分泌和內吞途徑的組織，發現內膜系統的主要組織結構和參與囊泡運輸的分子機制是保守的。與其他真核生物一樣，絲狀病原菌依賴于傳統的運輸途徑，利用SNAREs促進蛋白質分選到它們最終的細胞內或細胞外位置。單細胞朝著多細胞生物的變化，一般認為SNARE家族會跟隨著大量增加，如綠色植物與后生動物［10］。只有隨著分泌型SNARE蛋白數量的增加，組織內的單個細胞才能將物質輸送到其質膜的不同區域。在真菌中通常包含1組相對簡單的SNARE蛋白，主要由原真核細胞的SNAREs組成，而所有真菌都含有一種新的可溶性SNARE蛋白Vam7［26］。在大量真菌基因組的分泌途徑和內吞途徑中存在的 SNARE家族成員，與廣泛研究的釀酒酵母比較，這些家族的大多數成員（包括參與胞吐作用的成員）都是保守的，出現特殊的SNARE蛋白可能表明，在這些真菌中發生了特殊的步驟［27］。

1.3 SNARE通常的作用模式

首先，新合成的所有SNAREs蛋白需由分泌途徑轉運到特定的膜區室。v-SNARE與需轉運的貨物蛋白一起裝配在剛出芽的分泌囊泡中，產生的配送中間體促進與靶膜相互融合。同時，運輸囊泡的形成可能也與SNAREs蛋白和包被蛋白的直接互作密切相關，如運輸小泡在內質網膜上的形成，這需要SNAREs與COPⅡ的相互作用［28-29］。類似的，Vti1b與epsinR的互作也介導了晚期內涵體和跨高爾基體間來回運輸囊泡的形成。此外研究發現，Vamp2在快速內吞作用中可以作用于動態囊泡中，這也證明SNARE蛋白對促進轉運小泡的形成有功能作用［30］。

其次，由許多栓系因子參與的停靠過程中，運輸囊泡可以精準定位于含有t-SNARE的靶膜上。栓系因子可作用于囊泡與靶膜并長距離的往返，有利于相同v-SNARE和t-SNARE之間的正確而有效的配對。如在早期分泌途徑中，栓系因子 nbsp;P115 "可促進2個SNARE蛋白復合體的形成［31］。

再次，隨著反式高爾基體的快速形成，位于相對應的v-SNARE（運輸囊泡相關）和t-SNARE（靶膜相關）互作，它們形成了1個非常穩定的四聚體復合物并在2個膜之間形成合適的連接［32］。四螺旋復合物裝配前，SNAREs模體可以被認為是沒有結構的。SNARE復合體在組裝時ATP水解產生的能量，被用于抵消磷脂雙分子層的磷脂基團負電荷斥力，跨膜結構的產生促進囊泡與靶膜的相互融合。伴隨著融合的完成，反式復合體在靶膜上松弛形成順式SBARE復合體（cis-complex）結構。

最后，cis-SNARE復合體需要被拆散，以便后續的轉運。該過程有3個a-SNAP、六聚體形式的NSF，它們與cis-SBARE復合體相互作用促進20S的瞬時復合體的形成。cis-SBARE復合體在NSF水解ATP提供能量的情況下發生解離，分離后的SNARE推動后續循環的錨定和膜融合［33］。

2 植物病原真菌中SNARE蛋白基因的功能研究

目前，研究者已經從植物病原菌真菌稻瘟病病菌、禾谷鐮刀菌、大麗輪枝菌、金黃殼囊孢菌、炭疽病菌、番茄枯萎病病菌、粗糙脈孢菌、小麥赤霉病病菌、玉米黑粉病病菌中鑒定出大量SNARE蛋白編碼基因，并對定位于不同分泌途徑中的SNARE蛋白采用遺傳操作技術進行功能分析。

2.1 定位于內質網和高爾基體的SNARE蛋白

在模式真核生物釀酒酵母中，Qa-SNARE蛋白Sed5p在內質網向早期高爾基體的順運輸中，與其他幾種SNARE蛋白裝配，至少參與組裝了6種預測的SNARE復合物，一個復合體與Qb-SNARE Bos1p、Qc-SNARE Bet1p及R-SNARE Sec22p共同組成［34］。定位于高爾基體的Sed5p可以與內質網衍生膜泡上的所有SNARE形成復合物，促進膜泡與早期的高爾基器融合［35］。逆向運輸中定位于內質網膜的Qa-SNARE蛋白是必要的， 但這個運輸過程還需R-SNARE （Sec22p）、Qc-SNARE（Bet1p） 和Tip20p/Sec20p蛋白的參與［36-37］。而Ufe1p也被證明通過不涉及其他SNARE 的寡聚相互作用介導ER膜的同型融合［38］。

Sec22是參與真核生物膜融合的重要R-SNARE，定位于內質網和高爾基體，有助于囊泡的順行和逆行運輸。在釀酒酵母中Sec22是內質網和高爾基體復合體之間囊泡運輸所必需的，人們普遍認為， "Sec22 "突變在順行轉運和逆行轉運中都會導致缺陷［36，39-40］。然而，后來的研究證明， "Sec22 "突變不能影響順行轉運，只能延緩逆行轉運。 "Ykt6 "也是酵母分泌途徑內質網-高爾基體運輸過程中囊泡相關SNARE蛋白的必需基因， "Ykt6p "的缺失會導致液泡酶羧肽酶Y的p1前體（內質網形式）的積累，以及與分泌缺陷一致的形態異常［41］。在稻瘟病病菌中，通過基因敲除/置換的方法獲得 "ΔMosec22及ΔMotlg2基因敲除突變體，MoSec22 "的缺失導致分生孢子和附著胞形成減少，無法產生分生孢子，菌絲側壁有異常的幾丁質沉積。此外，對氧化應激的超敏性與細胞外酶、過氧化物酶和漆酶的表達降低有關［42］。 "Motlg2 "基因對于頂端的形成和幾丁質的極地分布是重要的， "Motlg2 "基因的缺失會導致營養生長減慢、分生孢子減少，但毒力與野生型相同［43］。在絲狀子囊菌中，使用同源重組的方法敲除 "Sec22 "后，突變體的子囊孢子數量不僅減少，而且存在著色、萌發缺陷，但營養生長正常［44］。在大麗輪枝菌中，靶向基因缺失 "VdSec22 "，突變體對棉花的毒力顯著降低， "VdSec22 "基因參與了碳水化合物水解酶的調節及胞外蛋白分泌［45］。在禾谷鐮刀菌中， "FgSec22 "基因的丟失會影響正常分生孢子形成和發病機制，與野生型相比顯著減少了與致病相關的DON毒素的產生［46］。在金黃殼囊孢菌中敲除 "CcSec22基因后，ΔCcSec22 "突變體的生長速率顯著減慢，且菌絲分枝數量增多，對楊樹枝條的致病力顯著下降，熒光增白劑（CFW）與剛果紅（CR）脅迫表現出更強的耐受性［47］。在炭疽病病菌中， "Sec22 "基因的替換減少了效應子DN3向生物營養界面（BIC）的輸送［48］。以上所有研究結果表明， "Sec22 "在內質網毒力相關蛋白的運輸中起著重要作用，并在植物病原體的生長、發育和致病性中發揮著重要作用。

2.2 定位于質膜的SNARE蛋白

在釀酒酵母中，高爾基器衍生的分泌囊泡與質膜的錨定和融合過程需要1個三元SNARE復合物，該復合物由1個來自重復的SNARE Sso1p和Sso2p（Qa 螺旋）中的1個螺旋組成，1個來自Snc1p和Snc2p中的1個螺旋（R螺旋）和來自Sec9p的2個螺旋（同時包含Qb和Qc螺旋）。一般而言，Sso1p/2p和Sec9穩定的定位在質膜上，但Snc1p/2p則遍布質膜到高爾基器間，并參與分泌性和胞吞性膜泡轉運［49-50］。

在釀酒酵母中，定位在高爾基體和質膜之間的Q-SNARE Sso1可以促進運輸小泡與質膜的相互融合，過表達Sso1或Sso2蛋白，發現增加了分泌蛋白的數量［23，51］。此外，這2種SNAREs蛋白對釀酒酵母正常生長發育至關重要［52-53］。Sso1p在釀酒酵母孢子的形成過程中起著重要作用，218位的谷氨酸殘基對于Sso1產孢功能是至關重要的［54］。粗糙脈孢菌中作用于菌絲頂端及囊泡極化外分泌過程中的 "SSO同源基因NSYN1、NSYN2，NSYN1的缺失突變會導致生長緩慢，菌絲直徑和極性異常，分生孢子缺陷，并且雄性不育。當NSYN2 "菌絲生長緩慢、形態和分枝異常時，不會產生子囊孢子或會萌發不良的子囊孢子［55］。在白色念珠菌中也得出相似的結果， "Sso2 "在四環素調控下，突變株的分泌囊泡大量積累，出現異常加寬的芽頸細胞，天冬氨酰蛋白酶和脂肪酶的分泌存在缺陷，當存在DOX時，生長表現出明顯的絲狀缺陷，菌絲尖端發育成球狀酵母樣結構［56］。在小麥赤霉病病菌中，靶向基因缺失 "SSO同源基因GzSYN1、GzSYN2，ΔGzSYN1突變體菌絲生長嚴重減慢，能產生子囊孢子正常的子囊壁。而GzSYN2突變體自身及雌性的可育性受到嚴重影響，菌絲能正常生長，ΔGzSYN1、ΔGzSYN2 "對大麥的毒力下降。GFP：：GzSYN1融合蛋白定位于囊泡、液泡、質膜和間隔中，而GFP：：GzSYN2融合蛋白僅存在于質膜和間隔中［57］。在稻瘟病病菌中，麥角固醇生物合成缺陷破壞了PM中脂筏的形成，導致MoSso1異常分布，抑制了其與v-SNARE蛋白MoSnc1的相互作用，而MoSso1-MoSnc1相互作用對生物營養界面復合體（BIC）的發育和細胞質效應蛋白的分泌是重要的［58］。用基因敲除技術對 "MoSso1、MoSso2功能進行分析發現，MoSso1 "的缺失導致BIC發育缺陷，與野生型菌株相比，致病性顯著下降，細胞質效應子分泌異常［59］。 "MoSso2 "缺失突變體致病性與野生型一致，但 "MoSso2 "參與菌絲生長、分生孢子和附著胞形成等過程［60］。在禾谷鐮刀菌中分別敲除 "FgSso1與FgSso2基因，發現FgSso1突變體菌株的菌落變小且不能正常產生茂盛的菌絲，產孢量也出現一定程度下降。FgSso1 "突變體對鹽脅迫更加耐受，滲透脅迫、氧化脅迫和剛果紅細胞壁脅迫更加敏感，DON毒素含量降低，相關基因的表達量顯著降低［61］。 "ΔFgSso2 "缺失突變體生長改變、對異生物質的敏感性增加、基因表達譜改變及DON在體外、體內的積累減少，降低了小麥赤霉病的癥狀［62］。在大麗輪枝菌中， "VdSso1 "缺失突變體會減弱多種碳源的分解代謝，并使致病力下降，同時使得棉花葉片上的外蛋白體細胞毒活性喪失［45］。在番茄枯萎病病菌中，敲除 "FolSso1基因后，ΔFolSso1缺失突變體生長速率降低，產孢數量減少，致病性無顯著變化，另外，ΔFolSso1 "缺失突變體對細胞壁和細胞膜壓力更加敏感［63］。在金黃殼囊孢菌中敲除 "CcSso1 "基因后，突變體顯著降低了對楊樹枝條的致病力，使其生長發育產生缺陷，對H 2O 2耐受力顯著增強［47］。

在釀酒酵母中，Sec9p穩定定位于質膜上，在營養生長和孢子形成期間參與蛋白的分泌［26］。Novick等通過同源重組分離到攜帶釀酒酵母 "SEC9 "突變的菌株，發現這些溫度敏感菌株在蔗糖酶分泌和積累膜結合分泌細胞器方面存在缺陷［64］。在四環素調控下，白色念珠菌 "SEC9 "突變株在DOX存在下生長，積累了晚期分泌囊泡，并且芽頸變寬，菌絲生長速率降低，在天冬氨酰蛋白酶和脂肪酶分泌方面存在缺陷［56］。上述結果表明，突觸融合蛋白（syntaxins）在真菌的發育和毒力中起到關鍵作用。

2.3 胞吞作用通路上的SNARE蛋白

在釀酒酵母中，定位于液泡的SNARE不但介導晚期高爾基體、胞內體和自噬體等物質輸送到液泡進行降解的過程［37，65-66］，而且干預同型液泡的融合，需要Q-SNAREs Vam3p（Qa）、Vam7p（Qc）、Vti1p（Qb）和R-SNARE Nyv1p的參與。然而，在高爾基體衍生物的膜泡、胞內體或自噬體與液泡的融合過程中，需要相同的Q-SNARE和另一種R-SNARE、Ykt6p［67-69］。SNARE蛋白Tlg1p參與對于酵母生長位點幾丁質合成酶的盤活及對維持反面高爾基體網的居家蛋白是重要的，而Sft1p則參與了早期高爾基體的嵴與晚期高爾基體蛋白膜泡的融合［70］。

在酵母中， "Vam3 "基因缺失突變體在多個液泡蛋白的成熟過程中表現出缺陷，并包含大量異常膜封閉腔室［37］。Vam7p蛋白在液泡隔膜與胞漿之間來回運輸，啤酒酵母中 "Vam7p "突變體不能產孢，含有許多不規則、形態多樣的液泡，另外， "Vam7p "突變體在酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養基上生長的菌絲分叉更少［71-72］。玉米黑粉菌Vam7的同源蛋白Yup1定位于液泡和快速移動的內含體，溫度敏感突變體細胞壁成分的極性分布存在缺陷，并表現出異常形態［5］。在小麥赤霉病病菌中，基于同源重組敲除 "GzVam7基因后，GzVam7 "對液泡的維持和胞吞作用存在缺陷，并影響了赤霉病菌的營養生長和發育，對小麥麥穗的致病性顯著下降［73］。在稻瘟病病菌中采用基因敲除/置換、插入突變等方法獲得 "ΔMoVam7、ΔMosyn8、ΔMotom/Stor7、ΔMonyv1和ΔMosnc突變體。ΔMoVam7 "敲除突變體存在異常碎裂的空泡，營養生長減慢，分生孢子不良，不能產生侵染結構附著胞，細胞壁變弱，與野生型相比菌絲頂端的活性氧（ROS）積累減少，不會在水稻上引起病害［74］。 "ΔMosyn8突變體在內吞作用、組織、附著胞膨壓產生和寄主穿透等方面存在缺陷，在未受傷的葉片中表現出較低的致病性。此外，ΔMosyn8 "突變體不能闡明對感病寄主的生物營養入侵，也不能分泌無毒因子［75］。 "ΔMosnc突變體的產孢量顯著下降，附著胞的產生異常，然而Monyv1、Motom "基因的缺失對稻瘟病菌生長發育和致病性無明顯影響［60］。稻瘟病菌中的 "MoRab7 "基因可以將逆轉錄復合體招募到液泡膜上，能夠識別一批SNARE蛋白，其中MoSnc1的含量最高，MoSnc1被證明主要積累在菌絲生長區和亞頂端BIC相關的細胞中［59］。對 "ΔMosnc1 "突變體的營養生長、分生孢子形成和附著胞形成的表型分析表明，與野生型（WT）相比沒有任何重大差異，但 "MoSnc1 "對于通過細胞質和質外體界面（分別為BIC和EIHM）有效分泌囊泡/效應物是關鍵的，對稻瘟病病菌的致病也是必不可少的［76］。在禾谷鐮刀菌中，利用基因敲除技術獲得 "ΔFgpep12、ΔFgVAM7缺失突變體，FgPep12 "基因的缺失會導致營養生長、分生孢子發生、子囊形成和致病力的缺陷［77］。 "FgVAM7 "的缺失顯著影響了無性發育及有性繁殖，并降低了禾谷鐮刀菌的毒力。 "Fgvam7 "突變體在液泡維持和延遲內吞方面也表現出缺陷，對鹽脅迫和滲透脅迫不敏感，對細胞壁應激敏感。并且 "FgVam7 "被證明能積極調控脫氧雪腐菌醇（DON）生物合成基因 "TRI5、 TRI6和TRI101 "的表達和DON的產生［78］。FgVam7- FgVps39-FgSso1作為1個蛋白復合體在禾谷鐮刀菌的囊泡運輸、內吞和自噬過程中發揮作用，控制植物發育、植物感染和脫氧雪腐菌醇（DON）的產生［25］。 "FgSnc1在禾谷鐮刀菌中參與調節分泌囊泡與質膜的融合，在不存在FgSnx41或FgSnx4的情況下，FgSnc1 "在液泡中錯誤分選和降解，并且任一組分的無效缺失會造成真菌極化生長和毒力方面的缺陷［79］。番茄枯萎病病菌中的靶向基因 "FolVam7缺失，表型分析表明，FolVam7 "對植物營養生長、無性發育、分生孢子形態和植物侵染具有重要作用。此外， "Folvam7 "突變體對鹽和滲透脅迫不敏感，對細胞壁應激源高度敏感［80］。同樣的，在炭疽病病菌中，敲除 "CfVam7基因后發現，CfVam7在生長、致病性和對內質網相關脅迫的反應中具有重要作用，是附著胞形成和同型空泡融合所必需的，對病原菌的入侵至關重要。CfVam7 "的Phox同源（Px）和SNARE結構域對于正常的細胞定位和生物學功能是必不可少的［81］。綜上所述， "Vam7 "介導的液泡膜融合促進了病原菌的生長、脅迫反應和致病性。

3 植物病原卵菌中SNARE蛋白基因的功能研究

目前，研究者在植物病原菌卵菌中開展SNARE蛋白編碼基因研究的只有大豆疫霉，由于疫霉菌同源重組概率較低， 因此傳統同源重組基因敲除技術在疫霉菌中的應用不成功。在基于CRISPR-Cas 系統的基因編輯技術出現之前，對疫霉病病菌基因功能的研究均采用RNA干擾技術。目前報道的植物病原卵菌中的SNARE蛋白編碼基因的功能研究均基于RNA干擾技術開展。

定位于質膜的SNARE蛋白編碼基因 "PsSso1/Sso2 "的沉默顯著降低了大豆疫霉的致病性，表型分析發現，卵孢子的產生數量明顯下降，菌絲的生長速率減慢并出現“雞爪”狀分枝，細胞壁的完整性及肌動蛋白的分布異常，液泡的維持及內吞作用無顯著影響。滲透脅迫、氧化脅迫、溫度與野生型相比影響各有不同。另外，胞外分泌的漆酶顯著降低，突變體的RXLR效應蛋白PsAvr1b分泌也明顯減少［82］。

胞吞作用通路上的SNARE蛋白編碼基因 "Ykt6p、PsVamp7、PsTlg1， "采用基因沉默遺傳操作技術處理，可以系統研究這些基因在大豆疫霉生長、發育和致病過程中的作用。 "PsYkt6 "沉默突變體表現出營養生長遲緩和形態異常，生長嚴重抑制，幾乎不產生孢子或形成極少數畸形孢子囊，卵孢子產量明顯減少，突變體毒性喪失［83］。 "PsVamp7 "基因的突變顯著降低了致病性，對無性生長發育無明顯影響，但突變體的卵孢子數量減少，對維持液泡的大小、內吞作用、細胞壁完整性及肌動蛋白分布存在明顯的缺陷，對氧化脅迫和高溫脅迫的反應異常。另外 "PsVamp7 "與胞外漆酶、果膠酶等的分泌密切相關［82］。 "PsTlg1沉默突變體顯著降低了菌株的致病性，表型分析發現，PsTlg1沉默突變影響了菌絲無性生長發育和有性生殖，使得肌動蛋白分布異常，液泡的維持及內吞作用有明顯缺陷。另外，有研究發現，PsTlg1突變體中PsLac4和PsLac5基因顯著下調表達，進一步證明PsTlg1 "與另外1個SNAREs蛋白 "PsTlg2 "直接互作［82］。

4 展望

相對于酵母菌等真核生物的經典分泌途徑，絲狀真菌頂端小泡的高度極化胞吐在一定程度上決定其高效分泌［84］。植物病原菌分泌的效應蛋白在幫助病原菌侵染、干擾寄主免疫方面發揮了關鍵作用，但產生的所有效應分子在與寄主作用之前必須被分泌出去。與許多植物病原細菌效應蛋白通過Ⅲ型或Ⅳ型分泌系統的方式不同，關于植物絲狀病原菌效應蛋白分泌機制的研究尚不清晰［4，85］。SNARE蛋白家族有助于運輸囊泡與靶器官的有效和可控融合，作為膜融合的關鍵組分，某些關鍵的SNARE蛋白在傳遞與致病性相關的分泌蛋白中起重要作用，對功能的全面剖析、對寄主-病原菌相互作用機制及生物藥劑的創制等有很大幫助。目前，雖然從不同植物絲狀病原菌中鑒定出了許多SNARE蛋白，但已知其具體功能的蛋白所占比例卻還是很低。目前，遺傳轉化體系與基因編輯體系的不完善，對基因功能的研究比較困難。另一方面，絲狀病原菌的DNA轉化效率低且難挑選問題嚴重限制了致病機制的功能研究。但是，隨著基因組學、外泌蛋白質組學及囊泡蛋白質組學等先進技術的發展，改良和完善的CRISPR/Cas、RNAi和HIGS等分子工具將極大地促進和加速真菌與卵菌功能基因組的研究，對于更深入地闡明植物病原真菌及卵菌的致病機制、新藥物靶標篩選及病害綠色防控技術的發展具有重要的意義和價值。

為了完全解析植物病原真菌和卵菌效應蛋白分子轉運機制、病原菌致病機制，還需要進一步開展以下3個方面的研究：（1）結合基因組學、蛋白質組學及生物信息學分析鑒定病原真菌與卵菌中各物種的SNARE蛋白家族組成，對在囊泡轉運不同階段發揮作用的SNAREs蛋白進行深入挖掘，全面分析SNAREs的定位及作用。（2）結合轉錄組、蛋白質組學分析篩選出參與效應蛋白分泌的關鍵SNARE蛋白基因，通過基因敲除或沉默的方法分析SNARE蛋白基因參與效應蛋白分泌的作用和程度，進一步解析SNARE蛋白調控病原菌致病的生物學機制，為后續關鍵藥物靶標的挖掘和篩選奠定重要基礎。（3）目前還對SNARE蛋白如何介導囊泡運輸和液泡融合，以及哪些蛋白質共同起作用了解得很少，因此在研究單個蛋白的基礎上深入組學研究，深入研究運輸囊泡過程中與SNARE蛋白協調作用的蛋白，有助于闡明它們在不同植物絲狀病原菌效應蛋白分泌途徑中的主次關系，進而揭示病原菌分泌效應蛋白的全景機制。

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收 稿日期：2023-02-07

基金項目：國家重點研發計劃 （編號：2021YFE0109600）；云南省農業基礎研究聯合專項重點基金（編號：2018FG001-001）。

作者簡介：楊明王（1997—），男，云南昭通人，碩士研究生，主要從事疫霉菌功能基因組學研究。 E-mail：2411313669@qq.com。

通信作者：趙志堅，博士，研究員，主要從事疫霉菌災變機制及病害精準防控研究，E-mail：zhaozj@yaas.org.cn；吳德喜，博士，教授，主要從事植保及微生物資源利用研究，E-mail：163wdx@163.com。