基于HPLC測定黃柏不同炮制品中黃柏堿與小檗堿的含量

楊永樂 胡振宇 阿麗牙·阿布來提 葉喜德

1萬年縣中醫院質控科，上饒 335500；2江西中醫藥大學藥學院，南昌 330004

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮，樹皮內層經炮制后入藥［1］。依照其來源，可分為川黃柏和關黃柏［2］。黃柏首載于《神農本草經》，又名“檗木”，列為上品，其味苦，寒，無毒，隨后歷代本草均有記載［3］。黃柏具清熱解毒、瀉火燥濕之功效，主要用治火熱毒邪氣、濕熱等證，臨床應用廣泛［4-8］。其主要生物活性成分為生物堿，包括小檗堿、巴馬汀、藥根堿和黃柏堿等［9-12］。其中小檗堿、巴馬汀、藥根堿為抗病原微生物的有效成分，而黃柏堿則具有降壓作用［13-15］。此外，黃柏還具有調節免疫功能、強心、抗潰瘍等作用［16-17］。目前，對黃柏的研究多數集中在成分分析和藥效研究，鮮有基于炮制方法開展其主要有效成分差異性的研究報道［18-22］。黃柏炮制方法較多，主要有鹽炙、酒炙和炒炭等［23-24］。由于不同炮制方法存在輔料、加工方法和炮制程度的差異，這勢必會影響藥材的質量與療效。黃柏堿與小檗堿是黃柏的主要有效成分，也是發揮藥效的關鍵因素。因此，本研究以黃柏為原藥材，采用不同炮制方法制備不同炮制品，建立黃柏堿與小檗堿的含量測定方法，并在同一條件下比較黃柏不同炮制品之間的含量差異，為其深入研究提供參考。

儀器與試藥

1.藥品

黃柏原藥材（產自安徽匯仁堂中藥飲片有限公司）經江西中醫藥大學劉應蛟副教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron amurenseRupr.的干燥樹皮。黃柏堿（批號：wkq21031209，純度≥98%）、小檗堿（產品批號：20233011，純度≥98.96%）均由成都克洛瑪生物科技有限公司提供。

2.儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀（VWD檢測器，安捷倫儀器有限公司），昆山-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），FA1004N 1000000電子天平（上海精密科學儀器有限公司），TDL-80-2C低速離心機（上海安翔科學儀器廠）。

3.試劑

乙腈（色譜純，含量≥99.9%，格瑞斯化工科技有限公司），甲醇（色譜純，格瑞斯化工科技有限公司），甲酸（色譜純，含量≥98.0%，天津市大茂化學試劑廠），雙蒸水（自制）。

方法與結果

1.色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikma）；流動相：乙腈-0.1%甲酸（磷酸調至pH=2.5），梯度洗脫：0～5 min，90%乙腈；6～14 min，79%乙腈；15～22 min，70%乙腈；流速：1.0 ml·min-1；運行時間：22 min；柱溫：25 ℃；檢測波長：284 nm；進樣量：20 μl。理論塔板數根據2020年版《中華人民共和國藥典》［1］計算，黃柏堿峰結果＞6 000，小檗堿峰結果＞4 000。

2.溶液的制備

2.1.對照品儲備液的制備 精密稱量黃柏堿1.09 mg、小檗堿1.07 mg，分別加甲醇10 ml，稀釋，制備成對照品儲備溶液，冷藏，備用。

2.2.混合對照品溶液的制備 精密量取黃柏堿儲備液30 μl、小檗堿儲備液150 μl，加甲醇定容至10 ml，超聲提取15 min，得黃柏堿為0.032 mg·L-1和小檗堿為0.178 mg·L-1的混合對照品溶液，0.22 μm微孔膜過濾，得濾液，待測。

2.3.供試品溶液的制備

2.3.1.黃柏不同炮制品的制備 （1）生黃柏：取原藥材，洗凈，浸潤，待藥材軟化切成絲，即得。（2）鹽黃柏：稱取1.0 g食鹽，加適量純凈水溶解后濾過，放置一旁備用。然后取50.0 g干燥黃柏絲放入濾過后的鹽水中拌勻，稍悶，待鹽水被吸盡后，置入炒制容器內，用文火加熱，不斷翻炒，待表面炒干后取出放涼，篩去碎屑，即得。黃柏與食鹽比例為50∶1。（3）酒黃柏：取黃柏生品50.0 g，于一定比例黃酒浸潤，悶透，置入炒制容器內，用文火加熱至表面棕黃色時，取出放涼，篩去碎屑，即得。黃柏與黃酒的比例為10∶1。（4）黃柏炭：取黃柏生品50.0 g，置熱鍋內，武火加熱至表面焦黑色，內部焦黃色時取出，噴灑少許清水，晾干，篩去碎屑，即得。

2.3.2.黃柏樣品制備 精密稱取生黃柏、鹽黃柏、酒黃柏、黃柏炭粉末各1 g，研磨成細粉，分別裝入15 ml EP 管中，加入5.5 ml 50%甲醇溶液，搖勻，待溶劑被吸收后，超聲提取30 min，取出，3000 r·min-1離心（離心半徑為14.7 cm）10 min，傾取上清液，放入10 ml 容量瓶中，連續反復提取2 次，合并上清溶液，用0.22 μl 微孔濾膜過濾，得黃柏不同炮制品樣品溶液，分別保存在4 ℃冰箱內，待測。

3.方法學考察

3.1.專屬性考察 精密吸取“2.2.”項中混合標準溶液5 μl，根據“1.”項色譜條件進行檢測。黃柏堿和小檗堿色譜峰見圖1，結果表明，黃柏堿和小檗堿分離和峰型良好。

圖1 黃柏不同炮制品中黃柏堿和小檗堿的高效液相色譜法（HPLC）圖

3.2.線性關系考察 精密吸取“2.2.”項中混合對照品溶液5 μl，根據“1.”項色譜條件進行檢測。以峰面積積分值（Y）、注射量（X）進行線性回歸方程，計算得回歸方程，分別得黃柏堿Y=17.65X+35.97，R2=0.999 2，線性范圍0.354～0.760 g·L-1；小檗堿Y=846.54X+18.92，R2=0.999 9，線性范圍3.865～7.530 g·L-1。黃柏堿與小檗堿成分的線性關系考察結果見圖2，結果表明黃柏堿和小檗堿具有良好線性關系。

圖2 混合對照品溶液中黃柏堿（A）與小檗堿（B）線性關系考察結果

3.3.精密度試驗 精密吸取“2.2.”項中混合對照品溶液5 μl，反復取樣6 次，得高效液相色譜法（HPLC）色譜圖。計算得黃柏堿、小檗堿峰面積的相對標準偏差（RSD）值分別為0.90%、0.70%，RSD≤2%，結果表明，該法精密度良好。見表1。

表1 混合對照品溶液中黃柏堿與小檗堿的精密度試驗結果（6份）

3.4.重復性試驗 精密吸取“2.3”項中生黃柏供試品溶液，設為3 組，每組2 份，共6 份，上樣測定，得各樣品HPLC色譜圖。利用出峰時間和峰面積計算可知，黃柏堿、小檗堿峰面積RSD 值分別為2.50%、1.30%，RSD≤3%，說明該法重復性良好。見表2。

表2 生黃柏供試品溶液中黃柏堿與小檗堿重復性試驗結果（6份）

3.5.穩定性試驗 精密吸取“2.3”項中生黃柏供試品溶液常溫下靜置，于0、3、6、9、12、24 h取樣檢測，得HPLC色譜圖，黃柏堿與小檗堿峰面積RSD 值分別為1.50%、0.29%，RSD≤2%，說明生黃柏供試品溶液在常溫環境下靜置24 h穩定性良好。見表3。

表3 常溫下靜置不同時間的生黃柏供試品溶液中黃柏堿與小檗堿穩定性試驗結果

3.6.加樣回收試驗 稱取同一供試品6 份（生黃柏），每份精密稱定1.0 g，將一定量黃柏堿和小檗堿對照品溶液分別加入每份供試品中，按“2.3”項方法制備，測定并計算加樣回收率，黃柏堿和小檗堿的回收率分別為99.84%、99.97%，RSD 分別為0.40%、0.17%，說明該法回收率良好。見表4、表5。

表4 生黃柏供試品黃柏堿加樣回收試驗結果（6份）

表5 生黃柏供試品小檗堿加樣回收率考察結果（6份）

4.樣品測定

精密吸取已制備好的4 種黃柏炮制品供試品溶液，根據“1.”項色譜條件進樣檢測，每組炮制品種進樣3 次，計算黃柏堿與小檗堿的含量，見表6。結果表明黃柏不同炮制品中黃柏堿和小檗堿含量差異較大，黃柏堿含量由低到高順序為：黃柏炭＜黃柏生品＜鹽黃柏＜酒黃柏；小檗堿含量由低到高的順序為黃柏炭＜鹽黃柏＜黃柏生品＜酒黃柏。

表6 4種黃柏炮制品供試品溶液黃柏堿與小檗堿的含量測定結果

討論

黃柏為一味常用中藥，其性寒，味苦，具清熱燥濕、瀉火解毒、除骨蒸之功效，臨床常用治濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢、濕疹濕瘡等證［25］，所含小檗堿、黃柏堿、藥根堿等生物堿類成分具有抗菌、消炎、利尿、抗心律等多種藥效作用［26］，易受外界環境的影響而發生變化［27］。因此，不同炮制方法對其化學成分影響的差異性較大，進而影響藥材質量。從成分研究來看，黃柏藥材中小檗堿含量相對較多，常作為評價藥材質量的關鍵指標［28-29］。但由于許多藥材，如黃連、三顆針等均含有該成分［30-31］，故評價黃柏藥材質量及優選優質的炮制品，常選擇兩種或兩種以上的有效成分進行研究。為此，本研究選用黃柏堿和小檗堿作為檢測指標，以比較黃柏不同炮制品之間的含量差異，目的是探討不同炮制方法對藥材質量的影響。

為確保本研究方法準確、可靠，實驗對流動相條件進行了優化。研究比較了3 種不同系統的分離效果，即乙腈-水溶液、乙腈-50%甲醇溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸調至pH=2.5），結果表明乙腈-水流動相系統洗脫能力不足，樣品分離度不如乙腈-50%甲醇溶液洗脫能力好；甲醇溶液洗脫能力較強，但峰型比乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸調至pH=2.5）差；綜合比較后發現，以乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸調至pH=2.5）為流動相所得樣品峰形及分離程度最好，可有效防止拖尾現象發生［32］。因此，本研究以乙腈-0.1%甲酸溶液（磷酸調至pH=2.5）作為流動相。

對于檢測波長，小檗堿波長常選擇345 nm，雖然其在該波長范圍內靈敏度較高，但對黃柏堿的靈敏度不高［12］。而選擇220 nm 設為檢測波長時，雖然有利于黃柏堿的檢測，但小檗堿的靈敏度較低，吸收波長明顯變短。經過對比發現，兩者在284 nm 波長范圍靈敏度較高，故以284 nm 為檢測波長。本研究結果表明，黃柏經不同方法炮制后，其主要成分黃柏堿和小檗堿含量會發生較大變化，其中酒炙品含量最高，而經炒炭后2 種成分含量均明顯降低，說明黃柏化學成分受加工炮制的影響。推測可能是由于黃酒為弱有機溶劑，黃柏酒炙后能增加生物堿的溶解度而增高其含量。而黃柏炒炭后，經過長時間高溫加熱，黃柏堿和小檗堿發生成分轉化而含量降低。因此，不同炮制方法會對黃柏的主要有效成分黃柏堿和小檗堿含量產生影響，且有可能影響藥效。但這種成分含量的變化，如何影響藥效及其作用機制仍未完全闡明，希望本文能為深入研究黃柏提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明楊永樂：醞釀和設計試驗，實施研究，文章撰寫，獲取研究經費，行政；胡振宇：分析/解釋數據，對文章的知識性內容作批評性審閱，統計分析；阿麗牙·阿布來提：采集數據，起草文章；葉喜德：技術或材料支持，指導，支持性貢獻