應用低溫等離子技術滅活體外結核分枝桿菌效果的初步研究

薛蓮 劇猛 黃毅 趙國連 張語豪 王思翰 雷穎 黨麗云 左蕾

結核病仍然是當前嚴重危害人類健康的主要傳染病之一,殺滅結核分枝桿菌是預防及控制結核病的重要內容之一[1-2]。結核分枝桿菌生命力頑強,且不易被控制[3],特別是發生在肺部及皮下組織內的局限性結核病灶不易治療,隨著耐藥結核病的傳播,此類局限性結核病灶的治療尤為困難[4]。有研究報道,采用抗結核藥物配合局部消融治療具有一定的效果[5-6],但僅局限于微波、射頻及激光等消融方法,而低溫等離子消融技術相較于其他消融方法具有低溫、反應輕、療程短及無明顯疼痛等優點,目前已應用于咽喉部疾病及椎間盤突出等疾病的治療[7-10]。但低溫等離子技術對于不同結核分枝桿菌是否具有殺滅作用、殺滅所需時間及殺滅效果等鮮有報道。本研究通過體外實驗探討低溫等離子技術對不同耐藥類型結核分枝桿菌的殺滅效果,旨在為結核分枝桿菌的殺滅提供新的技術方法。

材料和方法

一、實驗材料

1.菌株:結核分枝桿菌標準株(H37Rv;來源于中國疾病預防控制中心室間質評下發菌株)、廣泛耐藥結核分枝桿菌(extensive drug-resistantMycobacteriumtuberculosis,XDR-MTB)菌株、耐多藥結核分枝桿菌(multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis,MDR-MTB)菌株。XDR-MTB與MDR-MTB菌株來源于臨床患者,采用中和基因法由BACTEC MGIT 960系統(美國BD公司)進行分枝桿菌液體培養,再用膠體金標記的MPB64蛋白(杭州創新生物檢控技術有限公司)單克隆抗體試劑進行抗原檢測為MTB復合群,使用微孔板MIC法進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)最終確定。

2.試劑:分枝桿菌培養液(美國BD公司)、分枝桿菌營養添加劑(美國BD公司)、羅氏固體培養基(珠海市銀科醫學工程股份有限公司)。

3.儀器:PLA-600等離子體手術系統及MC247等離子刀頭(直徑0.9 mm/長度20 cm;成都美創電子科技有限公司);5 ml無菌試管;10 μl接種環(型號:65-0010,美國Biologix公司);PhoenixSpec比濁儀(美國BD公司);微生物培養箱(型號:SPX-250C;常州中誠儀器制造有限公司);生物安全柜(型號:BSC-1500∥A2-X,中國Biobase公司)。

二、研究方法

1.菌懸液的制備:取多個羅氏固體培養基培養3周以內的H37Rv、XDR-MTB(臨床分離株)、MDR-MTB(臨床分離株)新鮮菌落,經超聲分散儀分散后配置0.5麥氏濃度的菌懸液,后倍比稀釋為3×104菌落形成單位(colony forming units,CFU)/ml試驗用菌懸液備用。

2.等離子體手術系統調節:將低溫等離子系統檔位調節至9檔(平均功率9 W),安裝等離子刀頭,采用PLACOAG(止血、凝固)模式,此模式平均輸出功率范圍為0～350 W,其通過100 kHz的射頻電場,激發電解液在電極周圍形成含大量帶電粒子的等離子體薄層,產生能量打開靶組織細胞的分子鍵。

3.試劑分組:將實驗用菌懸液分為6組,1個對照組和5個實驗組,為減少實驗誤差,每組設計2份平行樣本,實際試驗樣本量為對照組2份樣本量,實驗組10份樣本量。

4.低溫等離子實驗方法:于生物潔凈安全柜內,分別取2.0 ml 3×104CFU/ml菌懸液樣品置于無菌試管中,調節等離子刀頭約距離試管底部10 mm后對其進行處理。將刀頭垂直放入裝有菌懸液的5組實驗組試管中央,作用時間分別為3、6、9、12、15 s,每次刀頭在試管內作用后,均經過含有75%酒精的無菌紗布擦拭充分滅菌。為防止氣溶膠的產生,實驗開機前需于試管口等離子刀頭旁使用棉球防止氣溶膠逸散。

5.菌落培養:低溫等離子實驗完畢后,即將實驗組及對照組試驗用菌懸液吸取10 μl接種于羅氏培養基上,置37 ℃培養箱培養21 d后計算菌落數。各時間點重復上述操作等離子體處理,處理后取樣測定菌落數量。

三、觀察指標

分別計算上述3種結核分枝桿菌菌懸液在低溫等離子不同作用時間點的菌落數,分別計算并比較3組結核分枝桿菌菌懸液在不同作用時間點的各組殺菌對數值及殺菌率。殺菌對數值=對照組平均活菌量對數值―實驗組平均活菌量對數值;殺菌率=(對照組平均活菌量―實驗組平均活菌量)/對照組平均活菌量×100%。

四、統計學處理

結 果

一、3種菌株行低溫等離子不同作用時間的殺菌對數值比較

H37Rv菌株(F=20.313,P=0.003)、XDR-MTB菌株(F=13.956,P=0.006)及MDR-MTB菌株(F=20.355,P=0.006)不同作用時間殺菌對數值差異均有統計學意義;3種菌株均于作用15 s時殺菌對數值達到最大值。3種菌株在作用9 s時殺菌對數值比較差異有統計學意義(F=61.603,P=0.004),其中XDR-MTB菌株最低,H37Rv菌株居中,MDR-MTB菌株最高;在作用12 s及15 s時3種菌株比較殺菌對數值差異均無統計學意義(F=1.383,P=0.375;F=8.301,P=0.060)。見表1。

表1 3種不同結核分枝桿菌行低溫等離子消融不同處理時間的殺菌對數值比較

二、3種菌株行低溫等離子不同作用時間的殺菌率比較

H37Rv菌株(F=10.458,P=0.012)、XDR-MTB菌株(F=10.945,P=0.011)及MDR-MTB菌株(F=9.424,P=0.015)不同作用時間殺菌率差異均有統計學意義;3種菌株均于作用15 s時殺菌率達到最大值。3種菌株在作用9 s時殺菌率差異有統計學意義(F=287.890,P<0.001),其中XDR-MTB菌株最低,H37Rv菌株居中,MDR-MTB菌株最高;3種菌株于作用12 s和15 s比較,殺菌率差異均無統計學意義(F=1.264,P=0.400;F=0.805,P=0.525)。見表2,圖1。

注 XDR-MTB:廣泛耐藥結核分枝桿菌;MDR-MTB:耐多藥結核分枝桿菌

表2 3種不同結核分枝桿菌行低溫等離子消融不同處理時間的殺菌率比較

討 論

由于結核分枝桿菌特有的細胞壁成分,其生命力持久,不易被消滅[11],發生在肺部及皮下組織內局限結核病灶的治療尤為困難。化學消毒劑對皮膚黏膜具有強烈的刺激性,不宜用于臨床治療[12];而藥物配合局部微波或射頻消融治療具有一定療效,但消融區產生的局部高溫具有明顯灼熱疼痛感[13-14]。因此,尋找一種有效、無明顯疼痛的治療方法已成為臨床研究的重要方向。

本研究通過體外實驗證實了低溫等離子技術對H37Rv、XDR-MTB及MDR-MTB均具有快速且明顯的滅活效果。H37Rv、MDR-MTB從作用3 s時菌落數均明顯減少,在作用15 s時殺菌率可分別達到99.26%和100.00%。而XDR-MTB于作用9 s時菌落數明顯減少,與H37Rv、MDR-MTB菌組比較,XDR-MTB殺菌率在作用12 s、15 s時明顯升高,在作用12 s以后差異無統計學意義,在作用15 s可達到96.35%,意味著對于XDR-MTB,需要更長的作用時間方能提高殺菌率。

結核分枝桿菌對高溫具有一定的耐受力[15],且微波和射頻等熱消融會引起患者不同程度的疼痛感[16-17],冷凍消融最低溫度為―196 ℃,單個循環時間為5～15 min[18],患者會出現冷休克風險。低溫等離子消融是將射頻刀頭與組織之間的電解液轉化成50～100 μm厚度的等離子薄層,強大的電場使等離子薄層中的帶電粒子獲得足夠動能,從而打斷靶組織分子鍵,使靶組織細胞裂解、萎縮、破壞,繼而脫落[7-10],其單個循環持續時間一般為15 s,并可將溫度精確控制在40～70 ℃,其熱損傷深度為0.5 mm,對正常鄰近組織的創傷很小[10],因此更適用于鄰近重要組織臟器、血管、神經及位于淺表的病灶,患者的治療時間短,疼痛感輕,且不易發生皮膚灼傷。本研究通過體外實驗表明,低溫等離子消融技術對上述3種結核分枝桿菌僅需要15 s就能達到顯著的殺滅效果,通常情況下結核分枝桿菌對高溫具有一定的耐受能力,在62～63 ℃高溫需持續15 min,或100 ℃需要5 min才能殺滅[19]。因此,考慮低溫等離子消融對結核分枝桿菌的殺滅作用為高速運動的離子動能打斷靶組織的分子鍵,從而快速引起病菌結構的破壞和損傷,達到殺滅病菌的目的,而非完全依賴于溫度的改變,其具體的作用機制還有待于進一步的研究。

本研究結果表明,低溫等離子技術對3種常見結核分枝桿菌均具有快速且有效的殺滅作用,并且隨著作用時間的延長,其殺菌率也逐漸升高,且3種不同結核分枝桿菌的殺滅效果在不同作用時間有所不同,因此需要制定個體化的策略。

本研究存在一定局限性,本次研究僅是通過體外試驗證實了低溫等離子技術對3種類型結核分枝桿菌具有快速、明顯的殺滅效果,但還缺乏相應的殺菌原理的實驗驗證,其他的影響因素,以及其在在體實驗是否具有相同的殺滅效果等。因此,下一步將考慮行局部結核分枝桿菌感染性病灶的低溫等離子在體動物實驗,探討其治療效果、影響因素及治療機制,以期為結核性病變的臨床研究及治療提供一種新的技術方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻薛蓮和劇猛:醞釀和實驗設計、實施研究、采集數據、起草文章、支持性貢獻;趙國連、張語豪、王思翰和雷穎:采集數據、實施研究、協助整理數據;黃毅、黨麗云和左蕾:醞釀和實驗設計、獲取研究經費、行政/技術或材料支持、分析/解釋數據、對文章的知識性內容作評價性審閱、指導、支持性貢獻