結核病mRNA疫苗的研制策略與展望

楊靜 肖麗娟 方譚瑋

結核病仍然是嚴重危害人類健康的重大傳染病,據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)報告,2022年估算全球約有1060萬例新發結核病患者,達到了WHO在全球范圍監測結核病以來的最高水平;同時,我國估計結核病發病患者數為74.8萬例,位列全球第三[1]。隨著全球結核病合并AIDS患者數的增加和耐藥結核病的出現,結核病防控形勢更加嚴峻[2]。預防傳染性疾病最有效且經濟的手段是接種有效的疫苗。目前,卡介苗(bacillus Calmette-Guérin vaccine, BCG)是唯一廣泛使用的預防結核病疫苗,對預防兒童結核病,尤其是嚴重類型的結核病如結核性腦膜炎、粟粒性肺結核等,具有較好的保護效果,但對成人結核病的保護效果不甚理想[3]。因此,研發結核病新型疫苗對于結核病防控具有重要意義。

目前,全球對結核病新疫苗開展了大量的研究,包括基因重組亞單位疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗、重組BCG疫苗、減毒活疫苗和mRNA疫苗等類型[4],并有16種新型結核病疫苗處于臨床試驗階段[5],但至今仍未能獲得可以替代傳統BCG的更為有效的結核病新型疫苗。其中,mRNA疫苗以其研發周期短、高效、安全和生產成本低等獨特的技術優勢和保護效果,成為新型疫苗研究的熱點[6],在疫苗研發領域得到了廣泛的開展。2023年4月,WHO召集結核病相關領域專家進行了基于mRNA疫苗平臺的結核病新型疫苗研發的討論,認為利用mRNA 疫苗技術平臺開展結核病新型疫苗的研發,可能會加速更為有效的結核病新疫苗的研制成功[7]。但結核病mRNA(TB-mRNA)疫苗的研發目前還處于起步階段,相關研究還較少,因此,筆者主要就mRNA疫苗的技術原理、優勢、制備技術,以及結核病mRNA疫苗的研制策略和現狀等方面,如TB-mRNA疫苗靶抗原的選擇及序列優化、轉錄后的修飾和疫苗的接種途徑等進行綜述,以期為TB-mRNA 疫苗的研制提供新的思路。

一、mRNA疫苗的技術原理和優勢

1990年,Wolff等[8]報道將裸mRNA注射到小鼠骨骼肌內使其表達目的編碼蛋白,開啟了新型mRNA疫苗的研究。隨著mRNA修飾技術和遞送載體的突破,克服了mRNA易被核糖核酸酶降解、固有免疫原性和細胞內遞送效率低等缺點[9],使得mRNA疫苗技術得到了快速發展,展現出強大的應用前景。

mRNA疫苗的主要原理是根據目標靶抗原設計相應的基因序列,在體外轉錄合成特定抗原的mRNA,經修飾、純化、包載后,再由載體遞送系統介導mRNA進入細胞質中,利用機體細胞的蛋白質合成系統翻譯出編碼的目的蛋白抗原,并將其水解成小分子肽,再通過與主要組織相容性復合體Ⅰ類(MHC-Ⅰ)和MHC-Ⅱ類分子結合,誘導機體產生特異性CD8+和CD4+T細胞免疫反應,達到預防和治療特定病原體感染的目的[10]。隨著技術創新的發展,為進一步增強疫苗的免疫效能,在mRNA疫苗設計中,選取某種佐劑蛋白的編碼序列,利用連接多肽(linker polypeptide)將與靶抗原的編碼序列相連接構建mRNA疫苗[11]。其中,最關鍵的是有效免疫保護的靶抗原選擇[12],最核心的技術是mRNA 的分子優化和遞送系統,而佐劑的選擇和免疫途徑等則會影響免疫效果[13]。

目前的mRNA疫苗主要有自我擴增型(self-amplifying)、非復制型(non-replicating)和環狀mRNA疫苗[14]。其中,自我擴增型mRNA編碼靶抗原,并編碼復制酶復合物,使疫苗RNA在細胞內擴增并增強蛋白質表達;而非復制型mRNA疫苗僅編碼靶抗原,含有5′和3′非翻譯區(untranslated region,UTR),可全面刺激適應性和先天免疫[15]。環狀RNA(circRNA)是一類具有頭尾共價連接拓撲結構的單鏈RNA,而結合內部核糖體進入位點(IRES)和開放閱讀框(ORF)的環狀RNA疫苗提供了一種改進的RNA疫苗的接種方法,具有安全性、穩定性、制造簡單性和可擴展性的特點。人工circRNA已成為一類新型疫苗,用于疾病的治療和預防,然而,circRNA疫苗的開發尚處于早期階段,其優化、交付和應用還有待進一步開發和評估[16]。

作為創新技術的mRNA疫苗,具有以下獨特的優勢:(1)可誘導機體產生體液和細胞全面的免疫應答。(2)具有自佐劑效應,一些mRNA本身可刺激免疫細胞分泌某些細胞因子,如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、IL-12、IL-1β和α/β-干擾素(IFN)等,特異性誘導免疫應答發揮其免疫增強作用[17]。(3)安全性好。mRNA無CpG島,僅需進入細胞質中便可發揮作用,避免了DNA核酸疫苗插入細胞基因組而發生潛在生物安全風險[12, 18-19]。(4)mRNA理論上可以編碼所有蛋白,具有廣適性,還可以通過優化mRNA序列增加編碼蛋白的免疫原性[17]。(5)mRNA在體內存留時間短,可通過正常細胞代謝迅速降解,對機體造成的毒性風險相對較小[12, 18-19]。(6)mRNA生產純化過程大體相似,生產流程通用性高。因此,研究一種可用于大多數mRNA疫苗生產的流程,可大量減少生產成本[12]。

二、mRNA疫苗的制備技術

mRNA疫苗的制備技術大致分為4步[19]:(1)根據靶抗原的基因序列進行序列設計。(2)RNA體外轉錄及轉錄后修飾。將靶抗原序列整合到質粒DNA中,利用噬菌體(如T7、T3、Sp6等)的RNA聚合酶在體外轉錄mRNA,對轉錄后的mRNA進行5′端加帽、3′端加尾和去磷酸化。(3)mRNA純化。通過色譜法去除雙鏈RNA、mRNA不完全轉錄本等雜質。(4)包載。用脂質納米顆粒或其他遞送載體包裹純化的mRNA,并通過透析或過濾法進行純化。

三、TB-mRNA疫苗的研制策略

1. TB-mRNA疫苗靶抗原的選擇及序列優化:結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)的蛋白抗原種類多樣,既有大量的分泌性蛋白,也有豐富的菌體蛋白,還有一些傳統疫苗BCG中不含有的差異蛋白[14-15, 20-21]。此外,在體內形成的MTB休眠菌,還會特異性轉錄表達一組休眠相關蛋白抗原[22]。既往結核病疫苗研究結果顯示,只有包含不同階段、不同類別的MTB蛋白抗原,才能夠刺激機體產生全面的抗MTB的保護性免疫[23]。因此,選擇多種有效的抗感染免疫的蛋白抗原組合作為疫苗的靶抗原,并保證多個蛋白的免疫原性和協同增強作用,是TB-mRNA疫苗設計的關鍵。

mRNA技術能夠通過改變核酸序列來不斷優化編碼抗原,從而提高編碼抗原的穩定性或增強其免疫原性[20]。密碼子優化是其中較常用的優化方法。編碼靶抗原的原始密碼子在體內可合成氨基酸,一部分密碼子的翻譯效率不高,可以用宿主細胞中使用頻率高的同義密碼子去替換外源mRNA序列中的密碼子,但需保證外源mRNA序列中的密碼子和宿主細胞的密碼子使用偏向性更加契合,以避免出現稀有密碼子[24]。有研究表明,將第3位是A、U的密碼子替換為G、C的密碼子,發現降低U密碼子的含量可降低mRNA在體內的免疫原性,但可提高所使用密碼子的翻譯水平[25]。

優化靶抗原編碼序列還可以通過突變氨基酸來增強靶抗原的穩定性和免疫原性[20]。MTB是原核生物,其密碼子與人體真核細胞密碼子在使用偏好上有所不同[26],因此,需要TB-mRNA疫苗編碼靶抗原的核酸序列進行優化,提高其在人體細胞中的翻譯和表達效率。

2. mRNA的轉錄后修飾:為保持和發揮同體內自然mRNA一致的效應,且使mRNA更加穩定,應保持體外轉錄(invitrotranscribed, IVT)mRNA(IVT-mRNA)與體內mRNA的結構一致[27]。因此,TB-mRNA疫苗在體外轉錄后,IVT-mRNA應添加5′Cap結構、5′UTR和3′UTR及3′聚腺苷酸(Poly A)尾(圖1),并在此基礎上,對IVT-mRNA進行適當優化,可提高IVT-mRNA的穩定性與翻譯效率,從而獲得更好的免疫效果[28]。

注 5′Cap:5′帽子結構;5′UTR:5′非翻譯區;ORF:開放讀碼框架;3′UTR:3′非翻譯區;Poly(A)tail:聚腺苷酸(A)尾

3. mRNA疫苗的遞送系統:mRNA疫苗必須進入細胞質內才能發揮作用。只有低于1000 Da的分子才能被動擴散進入細胞膜,而細胞膜表面的磷脂雙分子層具有負電荷,mRNA疫苗的裸mRNA也具有負電荷,因此,需要搭配一定的陽離子載體來介導mRNA疫苗進入細胞質[13, 27]。

mRNA的遞送載體可分為病毒載體和非病毒載體[29]。常見的病毒載體有腺病毒、甲型肝炎病毒、麻疹病毒等,在將其毒性和復制能力去除后可以作為遞送mRNA的載體,但由于體內免疫系統會識別進入機體的病原體并進行消滅,從而影響注入機體的mRNA疫苗的翻譯效率,減小其疫苗作用[27]。常見的非病毒載體包括脂質體和陽離子納米乳等。其中,脂質體是目前最先進的遞送系統,其主要由陽離子脂質體和其他輔助脂質體組成,可以將mRNA包封在內核中,避免了mRNA被降解[30];同時,陽離子脂質體與負離子細胞膜靜電吸附后與細胞膜融合,可幫助mRNA進入細胞質,完成mRNA的遞送[13];另外,陽離子肽魚精蛋白和聚合物載體如聚酰胺、聚β氨基酯及聚乙烯亞胺等也可用于mRNA的遞送,但由于這些物質與mRNA的結合比較緊密,影響了mRNA的表達效率,使其使用率較低[13, 31]。目前,也有一些其他載體用于mRNA疫苗的遞送,如膠原蛋白海綿和胞外囊泡等,但均處于初始研究階段[32]。

4. mRNA疫苗的接種途徑:目前,疫苗的接種途徑包括皮內、皮下、肌肉、靜脈和黏膜等方式。幾種一般的生物分布概況和作用機制與特定的給藥途徑有關,不同接種途徑會影響有效的抗原攝取,抗原提呈細胞(APC)的分子活化和獨特的生物分布對于疫苗靶抗原引起的特異性免疫應答的強弱和保護力均會不同[33]。而且,相關研究表明,應根據具體疫苗選擇其有效的免疫接種方式,如新型冠狀病毒感染的兩種mRNA疫苗,成人采用肌肉注射方式,而乙型病毒性肝炎mRNA疫苗則以皮下注射的免疫效果更好[34]。MTB主要通過呼吸道感染,呼吸道黏膜免疫系統是機體抵御MTB感染的第一道防線,黏膜免疫是理想的結核病疫苗的免疫途徑[3]。因此,設計TB-mRNA疫苗是否適合黏膜免疫,是否能夠刺激機體呼吸道黏膜免疫系統產生抗MTB的特異性免疫應答,在很大程度上可以反映TB-mRNA疫苗的高效性。

四、TB-mRNA疫苗的研究現狀

目前,針對TB-mRNA疫苗研究的報道還很少。Shahrear和Islam[11]以MTB PstS1蛋白為目標抗原,設計了一種假想的TB-mRNA疫苗(MT.P495)。通過免疫信息學方法對PstS1蛋白進行T細胞表位[包括輔助T細胞(Th細胞)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)細胞表位]和B細胞表位預測,再采用免疫學方法篩選出免疫顯性表位作為mRNA的靶抗原,利用人β-球蛋白基因的5′UTR和兔β-球蛋白基因的3′UTR進行結構修飾,同時,以MTB的S核糖體蛋白L7/L12蛋白作為佐劑,利用連接多肽將佐劑蛋白與靶抗原的編碼序列相連接(圖2),進一步通過調整GC含量、計算稀有密碼子的翻譯效率和減少不尋常的串聯序列等方法對mRNA的序列進行整合優化,以提高mRNA在宿主細胞內的翻譯效率,并增加mRNA二級結構的穩定性。研究還采用計算機預測和免疫生物學的方法對該假想mRNA疫苗進行評估,結果表明該mRNA 疫苗編碼的T細胞抗原表位能夠較好地與MHC分子相識別并結合,所形成的復合物也具有良好的穩定性;B細胞表位也具有較高的保守性、抗原性、非過敏原和非毒性。二者均具有較強的免疫刺激能力,能夠刺激不同亞類抗體和細胞因子(如IgG1、IgG2和IgM)及IFN-γ的產生。另外,研究也利用C-ImmSim服務器進行免疫模擬,結果表明該mRNA疫苗編碼抗原在初次和第二次免疫后,均可產生強烈的免疫應答,刺激高水平的IgM抗體生成。但在第二次和第三次免疫刺激中,隨著IgM抗體水平的降低,IgG抗體水平逐漸升高,表明該抗原可以刺激免疫記憶的產生,包括Th和細胞毒性T細胞(Tc細胞)的免疫記憶。進一步的抗原暴露預測分析表明,誘生的免疫記憶在再次接觸抗原后,能夠產生高水平的IFN-γ和高比例的Th細胞。綜上,抗原表位多肽疫苗能以最小的抗原編碼序列來獲得足夠的免疫原性,而且還能夠減少靶抗原內其他抗原表位引起免疫抑制等不良免疫應答現象,表明基于抗原表位多肽的mRNA疫苗,其安全性和翻譯效率都能夠得到更好的保障。

注 Cap:帽子結構;ARCA:抗反向帽類似物;5′UTR:5′非翻譯區;5′UTR of HBB:人β-球蛋白基因的5′非翻譯區;Kozak Sequence:Kozak序列;EAAAK Linker:EAAAK連接器;Signal Peptide:信號肽;Signal Peptide from tPA: 來自組織型纖溶酶原激活物(tPA)的信號肽;AAY Linker:AAY連接器;Adjuvant:佐劑;GGGGSEAAAKGGGGS Linker: GGGGSEAAAKGGGGS連接器;rpIL of MTB: 結核分枝桿菌的rpIL(50S核糖體蛋白L7/L12);Gene of Interest: 感興趣基因;Pst1 of MTB:結核分枝桿菌Pst1蛋白;3′UTR:3′非翻譯區;3′UTR of rabbit β globin:兔β-球蛋白基因的3′非翻譯區;Poly(A)tail:聚腺苷酸(A)尾;A120 tail: A120尾

國內夏敏等[34]結合人更常用的密碼子組合、高GC含量和mRNA二級結構等3個因素設計了MTB抗原Ag85B的mRNA序列,利用β球蛋白的UTR、PolyA及假尿苷等修飾方法進行優化,能夠成功地在體外轉錄出穩定的mRNA,優化后的Ag85B-mRNA的半衰期明顯延長。采用魚精蛋白與mRNA 1∶1混合后,免疫小鼠,結果顯示,利用魚精蛋白遞送該mRNA,無論是滴鼻免疫,還是肌肉注射免疫,均可在小鼠體內引起細胞免疫,刺激機體產生IFN-γ,但效果不明顯。該研究也提示,單純優化序列還不能夠使mRNA產生強效的免疫效果,還需進一步優化mRNA的免疫原性及其遞送系統。

近期,WHO報道德國BioNTech公司已研發了兩種TB-mRNA疫苗——BNT164a1和BNT164b1,但目前這兩種疫苗均處于對疫苗的安全性和免疫原性進行評價的臨床Ⅰa期試驗階段[35],作為進展最快的TB-mRNA疫苗,引起極大關注。然而,由于商業原因,目前還難以獲得更多疫苗的相關信息。另外,我國目前也有一些科研團隊在對TB-mRNA疫苗進行研究,且這些研究主要集中在關鍵抗原的選擇上,并在與生物企業密切合作的基礎上積極推進成果轉化。目前,篩選出的保護性抗原配合優化的脂質納米顆粒(LNP)遞送載體制備的TB-mRNA候選疫苗,已取得一定的階段性成果[36]。

五、展望

mRNA疫苗在其他傳染病疫苗研究中已取得良好進展,如呼吸道合胞病毒、寨卡病毒和流感病毒等的mRNA疫苗已進入臨床試驗階段[37]。在當前傳統技術研制新型結核病疫苗的艱難時期,mRNA疫苗的研制技術為結核病新型疫苗的研制帶來了希望。然而,明確有效的結核病疫苗靶抗原和有效免疫保護的評價指標一直是傳統結核病新型疫苗研發的難題,也將是TB-mRNA疫苗的評價和篩選的障礙。此外,雖然現在mRNA的分子優化和遞送系統已經獲得了很大進步,但mRNA疫苗仍然面臨著免疫原性、穩定性和高效遞送等方面的挑戰。所以,如何在mRNA疫苗設計時更好地激發靶抗原的免疫原性、降低mRNA分子的固有免疫、提高mRNA分子的穩定性和翻譯效率等,將是TB-mRNA疫苗研發時需要重點解決的問題。盡管目前TB-mRNA疫苗的研發面臨著巨大的挑戰,但隨著抗結核保護性免疫的深入闡明,mRNA疫苗研發技術的不斷提高,TB-mRNA疫苗終將成為結核病新型疫苗研發的重要方向,并有希望獲得更為有效的新型結核病疫苗,為終結結核病流行,保護人類健康提供新的有效手段。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻楊靜和肖麗娟:文獻檢索和撰寫文章;方譚瑋:設計文章框架、修改和審校