基于虛擬篩選從中藥中發現高選擇性靶向DDX3X抑制劑

邵 晨 宋 昱 史學偉 王寶珍 武 靖 董志強*

人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1, HIV-1）屬于逆轉錄病毒科，是全球公共衛生領域面臨的最嚴峻挑戰之一，對人類健康構成極大威脅。盡管1996年開始引入抗逆轉錄病毒療法，但據估計，全世界仍有3 670萬HIV-1攜帶者，每年死亡人數超過100萬[1-2]。由于HIV-1潛伏期長且易變異，迄今為止徹底根除這種病原體或開發有效的預防性或治療性疫苗相當困難[3]。隨著醫學技術發展，現有抗病毒藥物的效力提高，HIV-1的復制可以在大多數接受治療的患者中成功地停止[4]。此外，免疫功能低下的患者易受細菌、真菌和病毒感染，這使得治療方案變得復雜，增加了用藥負擔[5]。

為了改善藥物選擇性并解決耐藥性問題，間接作用藥物被提出。HIV-1等病毒在宿主細胞內復制時，需借助宿主細胞的各類分子和生化途徑。這些由宿主細胞提供的輔助因子成為了抑制病毒復制的潛在藥物靶點[6]。DEAD-box家族包含大量已知被不同病毒吸收的人類蛋白質，許多不同的病毒依賴其調節宿主細胞的反應，DEAD-box家族中的ATPase/RNA helicase X-linked DEAD-box polypeptide 3（DDX3X）蛋白被確定為是許多不同的病毒調節宿主細胞的依賴蛋白[7]。近年來，針對DDX3X的ATP和RNA結合位點開發出許多小分子抑制劑，尤其是發現了一種針對DDX3X的核酸結合裂縫的RNA競爭抑制劑，它能夠阻斷HIV-1以及丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）、登革病毒（dengue virus, DENV）和西尼羅河病毒（west nile virus, WNV）的復制[8-10]。同時DDX3X參與不同的細胞途徑（翻譯、轉錄、RNA衰變、核糖體生物發生），參與細胞周期調控、凋亡、癌變、遷移和缺氧，并在大量腫瘤細胞中過度表達，被認為是抗癌治療學發展的新靶點[11-12]。

然而，大多數DEAD-box家族中RNA解旋酶的ATP和RNA結合位點具有顯著的相似性，這對開發具有絕對選擇性的藥物帶來了一定的挑戰，除了所有典型的保守結構域外，DDX3X還被證明在參與ATP結合的基序I（WalkerA）和屬于RNA結合域的基序Ia之間有一段獨特的序列（ALRAMKENGRYGRRK，250～264），該序列被稱為“獨特的基序”[13-14]。值得注意的是，這段序列在DEAD-box家族中的其他蛋白成員中并不存在，而且文獻[15]報道表明，刪除這個短基序會降低DDX3X與核酸的親和力，從而影響DDX3X的RNA解旋酶活性，而用肽封閉這個結構域可以減少感染細胞中的HIV-1復制。因此，靶向這一獨特基序的抑制劑對DDX3X具有高度的選擇性，并可能保留抑制病毒復制的能力。

在本實驗中，針對這一獨特的位點基于中藥化合物數據庫篩選出選擇性較強的化合物，通過分子對接、互作模式分析以及計算自由結合能的方法篩選出具有潛在抑制活力的DDX3X抑制劑，并對活性位點的構效關系進行分析，為DDX3X高選擇性抑制劑設計提供指導方案。

1 資料與方法

本實驗所有分子模擬工作運用Schr?dinger 2019軟件中各模組完成，Discovery Studio 2020用于視圖操作。

1.1 蛋白準備

從PDB數據庫（https://www.rcsb.org）下載DDX3X蛋白晶體結構（PDB ID：2I4I）[16]，使用Schr?dinger將蛋白晶體結構中的水分子刪掉，在“Protein preparation wizard”模塊中，對蛋白進行加氫以及對蛋白晶體結構中非完整氨基酸殘基進行矯正。同時，根據PROPKA的pKa預測，在pH為7.0下實現質子化殘基的氫鍵優化。最后，在OPLS3立場下使蛋白晶體結構能量最小化。

1.2 小分子準備

模擬過程中的全部小分子均利用Schr?dinger中“LigPrep”模組進行處理，將小分子在OPLS3立場下進行結構優化，不考慮異變體的因素下，每個小分子最多只生成一個立體異構體。

1.3 活性位點確定

識別DDX3X上ATP結合的基序I（WalkerA）和屬于RNA結合域的基序Ia之間獨特的序列（ALRAMKENGRYGRRK, 250～264），將該序列內氨基酸構成的口袋定義為選擇性位點，基于此位點進行選擇性抑制劑篩選。利用SiteMap模塊對基序進行識別，將識別后產生的位點定義為選擇性位點。

1.4 分子對接

模擬實驗中分子對接部分由Schr?dinger中“Glide”模組完成。通過對活性位點的確定，在選擇性位點中利用Glide中的HTVS對接完成初期的對接篩選，隨后SP對接進一步確定配體-蛋白的結合效果。對接精度較高的XP對接用來分析篩選得到的化合物與蛋白的互作模式。對接實驗前要評價對接方法的可靠性，將共晶體中的共晶化合物AMP進行重新對接，分析對接前后的RMSD值，RMSD值小于2?認為對接結果具有可靠性。

1.5 自由結合能計算

自由結合能可反映配體-蛋白復合物體系的穩定性，通過Prime MM-GBSA對復合物體系自由結合能進行計算。自由結合能計算遵循以下方程：

ΔG bind=ΔGMM+ΔG solv+ΔG SA

ΔG bind的計算涉及到3個主要方面：氣相自由能（ΔGMM）、溶劑化自由能（ΔG solv）和系統熵變化（ΔG SA）。為了實現這一計算，本研究選擇溶劑模型為VSGB，并采用“層次采樣”以高效而系統的方式對配體-蛋白復合物進行位置、方向和構象的系統采樣，以全面捕捉其結合過程中的各種可能性。同時，在OPLS3力場下，對各個配體-蛋白復合物體系自由結合能進行計算。

2 結果

2.1 選擇性位點分析

目前，大多數DDX3X蛋白解旋酶抑制劑主要瞄準其RNA結合位點，然而，特定位點（250～264）的獨特序列在其他家族蛋白中缺失，為增強對DDX3X的選擇性提供了潛在優勢。利用SiteMap程序對“獨特的基序”進行識別。如圖1所示，定義選擇位點的中心為X=27.6，Y=0.16，Z=5.02。選擇性位點位于蛋白末端，由一小段α螺旋構成，螺旋末端連接著一段loop環。對選擇性位點進行分析，位點內的氨基酸多為親水性氨基酸，這些氨基酸具有與小分子抑制劑形成氫鍵的潛力，此外多數氨基酸殘基在口袋內呈正電性或負電性。

圖1 選擇性位點預測

2.2 分子對接篩選

分子對接實驗前，對分子對接方法進行了評價。采用配體擴張法定義共晶化合物（X=17.2，Y=-23.33，Z=16.36）10?范圍內的氨基酸為活性位點，將共晶化合物AMP重新對接后計算對接前后AMP構象的變化。測得RMSD值為0.293?，表明本實驗分子對接方法具有一定的可靠性。首先基于高通量分子對接篩選方法對化合物數據庫中15萬個小分子進行篩選，結果顯示共有123 199個化合物可以結合在選擇性位點。隨后調整對接精度為SP，將這些化合物與選擇性位點再次對接，隨后對結合分數進行統計，選取結合分數排名前3 000的化合物進一步進行精確度最高的XP對接。設置對接方式為半柔性對接，將這些候選化合物與選擇性位點對接。觀察分析對接后化合物的分子構象，剔除那些與選擇性位點構象不符合的化合物，同時對化合物的結合分數進行分析，最終確定了20個化合物有著可以與選擇性位點相匹配的分子構象，同時有著較好的結合作用。20個化合物理化性質如表1所示。其中化合物1在這些化合物中表現出較強的作用效果，如圖2所示，化合物1分子構象由3個環狀結構構成，三部分結構均勻地分布在選擇性位點中，且3個環狀結構的羥基均與活性位點中的氨基酸形成氫鍵。

表1 化合物理化性質

圖2 化合物1于選擇性位點作用方式

2.3 自由結合能計算

分子對接篩選得到的化合物表現出可與DDX3X蛋白解旋酶形成較強的結合作用，但單純的分子對接實驗并不能證明配體與蛋白可構成穩定的復合物體系，需通過MM-GBSA對分子對接篩選出的化合物與DDX3X蛋白組成的復合物體系自由結合能進行計算，分析蛋白-配體復合物體系的穩定性。在進行自由結合能計算時，設置化合物3?范圍內的氨基酸為柔性構象。20個化合物的自由結合能如表2所示，以ΔGbind=-60 kcal/mol為標準，選擇自由結合能低于該數值的化合物，最終確定了11個化合物。XP精準對接結果顯示化合物1與DDX3D蛋白解旋酶有著較好的結合效果，自由結合能計算結果顯示兩者構成的復合物體系較為穩定，其中庫倫能（ΔGbindCoulomb=-70.239 kcal/mol）以及范德華作用（ΔGbindvdW=-45.423 kcal/mol）提供了主要貢獻。庫倫能表現為靜電作用，選擇性位點上氨基酸Arg、Lys、Asp以及Glu在對接環境下，氨基酸上的羥基與氨基電離形成帶電單位，如圖2所示化合物分子表面電勢圖顯示出較強的負電性，化合物1不同部位的負電性與選擇性位點上帶正電荷氨基酸Lys以及Arg結合形成較強的靜電作用以及氫鍵（ΔGbindHbond=-7.702 kcal/mol）作用，從而提升復合物的穩定性。其他化合物與化合物1相似，庫侖能以及范德華作用為主要貢獻者，其次是氫鍵以及疏水作用。自由結合能計算結果與選擇性位點特征相符，即位點上以帶電荷氨基酸為主，與這些氨基酸發生靜電作用和氫鍵作用可增強化合物在選擇性位點的結合效果。

表2 蛋白-配體自由結合能(kcal/mol)

2.4 互作模式

配體-蛋白間的作用模式決定了復合物體系的穩定性，與關鍵氨基酸存在相互作用可增強化合物對蛋白的作用效果。通過DS可視化工具對這11個化合物與DDX3X蛋白的作用方式進行精確分析。如表3所示，氫鍵和范德華力是11個化合物中保守的兩種作用力。氨基酸Glu249、Glu256、Arg262、Gln265以及Arg315可以與多個化合物形成氫鍵作用，此外化合物1、2、5、6、14和15還可以與Glu256以及Arg262帶正電荷氨基酸形成靜電作用，這進一步加強了這些化合物與DDX3X蛋白解旋酶的結合效果。氨基酸Arg296、Arg315以及Gly316與大部分化合物形成范德華力作用。除氫鍵與范德華力這兩種保守作用力外，化合物2、9、11以及14與氨基酸Arg296、Arg252、His318等殘基上的疏水基團存在疏水作用。見圖3～4。

表3 配體-蛋白作用方式

圖3 XP對接后打分TOP20的分子與受體各氨基酸殘基產生相互作用的數目

圖4 結合能排名前三的化合物與DDX3X蛋白解旋酶選擇性位點作用方式

通過對11個化合物與蛋白的互作模式進行分析，結合自由結合能計算結果，表明在選擇性位點中，與位點上的氨基酸形成氫鍵的同時存在靜電作用可進一步加強化合物與DDX3X蛋白解旋酶的穩定性。氨基酸Glu249、Glu256、Arg262、Gln265以及Arg315作為關鍵氨基酸與化合物形成氫鍵以及靜電相互作用。通過對化合物與DDX3X蛋白解旋酶互作模式分析，認為化合物1、2、5以及14相比于其他化合物可穩定地作用于DDX3X蛋白解旋酶選擇性位點并與蛋白形成更加穩定的復合物體系。

3 討論

本實驗基于DDX3X蛋白解旋酶上一段獨特的基序構建選擇性位點，針對該選擇性位點對中藥數據庫進行虛擬篩選，篩選分析得到強效DDX3X蛋白解旋酶選擇性抑制劑。通過分子對接、自由結合能計算以及互作模式分析的方法確定選擇性位點以親水性氨基酸為主且多數為帶正電荷氨基酸?；衔?、2、5和14（ZINC4096316、ZINC33861462、ZINC67903526、ZINC85530944）可與選擇性位點內的Glu249、Glu256、Arg262、Gln265以及Arg315關鍵氨基酸形成氫鍵以及靜電作用，與氨基酸Arg296、Arg315以及Gly316等形成范德華力。兩種保守的作用力使得這4種化合物可以與DDX3X蛋白解旋酶形成穩定的復合物體系，4種化合物可作為潛在的高選擇性DDX3X蛋白解旋酶抑制劑進一步開發。