基于網絡藥理學和分子對接技術分析柴胡-白芍藥對治療肝損傷的作用機制

陶純立 馮春艷

肝損傷（liver injury, LI）是一種由于酒精刺激、病毒性肝炎、藥物性肝炎、化學污染等導致肝臟細胞凋亡、壞死和纖維化損傷的疾病[1]。LI是多種肝病的起始階段，隨著病情進展嚴重者則會發生肝臟纖維化、肝硬化、肝衰竭等[2-3]。因此，阻止LI的發生和發展具有重要意義。

中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，在疾病的治療中具有獨特優勢。柴胡-白芍作為中醫疏肝氣常用藥對，在臨床中常用于治療肝臟損傷性疾病[4]。柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根，具有和解表里，疏肝升陽之功效[5]。白芍本品為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有養血柔肝之功效[6]。有研究報道，柴胡-白芍配伍后可減輕肝臟炎癥反應，提高細胞色素CYP2E1酶活性，減輕氧化應激反應，發揮治療LI作用[7-9]。

網絡藥理學可用于創建基于靶分子、生物學功能和生物活性化合物的復雜作用網絡，系統地反映中醫藥多成分、多靶點、多途徑的疾病干預機制[10]。本研究基于網絡藥理學和分子對接技術，篩選出柴胡-白芍藥對的活性成分，以及治療LI的作用靶點和信號通路，以探究柴胡-白芍藥對抗LI的作用機制，為柴胡-白芍藥對治療LI的進一步研究，以及中醫藥治療LI提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 柴胡-白芍藥對活性成分及靶點篩選

運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥0.30且類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18為條件篩選得到柴胡-白芍藥對的活性成分化合物及對應靶點，運用Pubchem平臺（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取靶點Canonical SMILES號，通過SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）及TargetNet數據庫（http://targetnet.scbdd.com/）預測并獲取有效靶點。

1.2 疾病靶點篩選

運用GeneCards（https://www.genecards.org/）及OMIM數據庫（https://www.omim.org/）以“liver injury”為關鍵詞，篩選獲取LI疾病基因靶點，以相關性分數＞4為標準，去除重復基因，整理導入Excle表。運用Venn 2.1平臺，將柴胡-白芍藥對靶點與LI疾病基因靶點進行分析取交集，得到韋恩圖，即柴胡-白芍藥對治療LI的潛在靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction, PPI）網絡構建

將柴胡-白芍藥對抗LI的潛在靶點導入String數據庫（https://cn.string-db.org/），靶點網絡以PPI閾值0.9為標準，隱藏游離靶點，獲取PPI網絡，下載PPI可視化圖和潛在靶點.TSV文件。將潛在靶點.TSV文件使用Cytoscape 3.9軟件打開，進行Network analyze分析，根據Degree值，繪制可視化PPI圖。

1.4 “藥物-活性成分-靶點”網絡

將柴胡-白芍藥對治療LI的活性成分和潛在靶點進行整理，運用Excel建立“藥物-活性成分-靶點”表，導入Cytoscape 3.9軟件構建關系網絡，并進行可視化處理。

1.5 基因本體（gene ontology, GO）功能及京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

運用DAVID數據庫將柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點進行GO功能及KEGG富集分析，獲取數據，選擇GO功能分析前10的結果和KEGG富集分析前20的結果，運用微生信數據可視化平臺（https://www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化處理。

1.6 分子對接

將活性成分和潛在靶點進行分子對接，使用PDB數據庫（https://www1.rcsb.org/）獲取受體蛋白的結構文件。使用PyMOL 2.3.0軟件對下載的受體蛋白進行刪除水分子和原配體等操作。使用PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載Inositol小分子結構文件并使用Chem3D軟件對配體分子進行計算，得到能量最小化的配體分子最優結構。使用Auto Dock Vina v.1.2.0軟件將靶點蛋白和小分子進行分子模擬對接，得到對接結合能以及對接結果文件。結合能越高，結合構象越穩定，受體與配體之間結合的可能性越大。

2 結果

2.1 柴胡-白芍藥對活性成分及靶點

共篩選得到柴胡-白芍藥對的活性成分27個，包含1個共有活性成分，為山柰酚（Kaempferol），見圖1。通過SwissTargetPrediction及TargetNet數據庫預測并獲取有效靶點，去除重復后，得到480個藥物靶基因。

圖1 柴胡-白芍藥對的活性成分

2.2 柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點

通過GeneCards及OMIM數據庫獲取LI疾病基因靶點，得到疾病靶點2 692個。將2 692個疾病靶點與柴胡-白芍藥對480個藥物靶點在Venn 2.1中生成韋恩圖，映射出216個共有靶點，即柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點。見圖2。

圖2 柴胡-白芍藥對抗LI的潛在靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡

將柴胡-白芍藥對治療LI的潛在靶點導入String數據庫，獲得PPI網絡，包括239條邊，216個節點。將String數據庫下載的潛在靶點.TSV文件使用Cytoscape 3.9軟件打開，進行Network analyze分析，根據Degree值，選取排名前30的靶點繪制可視化PPI圖，其中靶點Degree值越大，則節點越大，顏色越深。排名前5的靶點分別為蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素6（IL6）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）。見圖3。

圖3 PPI網絡

2.4 “藥物-活性成分-靶點”網絡

將柴胡-白芍藥對、活性成分、交集靶點建立“藥物-活性成分-靶點”Excel表，導入Cytoscape 3.9軟件構建關系網絡，獲得“藥物-活性成分-靶點”網絡。其中紅色V字形代表藥物，紫色圓形代表活性成分，綠色方形代表靶點。見圖4。

圖4 “藥物-活性成分-靶點”網絡

2.5 GO功能分析

DAVID數據庫將柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點進行GO功能分析，富集結果按照P值排序，將前10條結果在微生信數據可視化平臺進行可視化。其中，生物過程（biological process, BP），包括對細菌來源的反應、對脂多糖的反應、藥物反應、節律反應、肽基酪氨酸修飾等。細胞組分（cellular components, CC），包括細胞膜、膜筏、膜微區、質膜、質膜凹腔等。分子功能（molecular function, MF），包括核受體活性、配體活化轉錄因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結合、藥物結合等。見圖5。

圖5 GO功能分析

2.6 KEGG富集分析

分析柴胡-白芍藥對治療LI的KEGG富集分析，結果按照P值排序，將前20條結果在微生信數據可視化平臺進行可視化。通過分析氣泡圖結果并結合LI相關通路可知，柴胡-白芍藥對治療LI的信號通路主要有PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等，見圖6。

圖6 KEGG富集分析

2.7 分子對接

根據PPI分析結果，運用Auto Dock Vina v.1.2.0軟件將度值排名前5的核心作用靶點AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR與柴胡-白芍藥對的7個核心活性成分進行分子對接，獲得蛋白結合能熱圖。結果顯示，柴胡-白芍藥對中活性成分與關鍵靶點均對接穩定，其中β-谷甾醇與TNF結合能力最強，結合能為-11.4 kcal/mol；山柰酚與TNF結合能力較強，結合能為-10.2 kcal/mol，見圖7。將結合能最強的以上兩個結果用PyMOL和Discovery Studio 2019進行可視化作圖。見圖8～9。

圖7 活性成分與核心靶點的對接結合能

圖8 山柰酚與TNF對接

圖9 β-谷甾醇與TNF對接

3 討論

肝臟作為重要的代謝和解毒器官，尤其是受到炎癥、酒精、病毒、藥物、化學污染等刺激，肝臟對有害化學物質解毒的能力將超負荷，易導致肝臟細胞及功能損傷[11]。研究發現，LI作為急重癥肝病的前驅階段，是臨床上危重病癥的第五大常見誘因，因此，及時阻止LI的發生與發展具有重要意義[12]。LI在中醫認為其病位在肝，多因肝氣郁結、肝絡失養所致。葉天士《臨證指南》提到“七情之郁居多，并大都是悒郁傷肝”，《素問·六元正紀大論》提到“郁之甚者，治之奈何？木郁達之……然調其氣”，在治療上多用疏肝理氣，解郁和絡之法。故臨床常用柴胡、白芍等疏肝類中藥治療。

本研究基于網絡藥理學探討柴胡-白芍藥對治療LI的作用靶點及信號通路，研究其潛在機制，篩選得到柴胡-白芍藥對活性成分27個，包括山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、槲皮素等；PPI分析得到柴胡-白芍藥對治療LI的核心靶點216個，其中排名前5的靶點分為AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR。其中Akt是治療LI的高頻分子，AKT1作為Akt的同源基因，與LI關系密切[13]。研究發現，調節Akt蛋白能夠改善肝細胞損傷[14]。TNF、IL6作為炎癥因子，在LI的發生和發展中發揮重要作用，當肝臟受到炎癥因子刺激，可導致肝細胞受損，招募肝臟中NK等巨噬細胞來分泌炎癥因子，以起到調節免疫功能作用。而炎癥因子過量分泌會加重LI，從而產生一系列聯級反應[15-16]。大量研究表明，抑制TNF、IL6能夠有效改善LI情況[17-18]。VEGFA、EGFR與細胞的增殖、血管生成、炎癥及細胞凋亡的抑制有關[19-20]，研究表明，調節VEGFA、EGFR能夠有效改善肝臟纖維化損傷[21-23]。

GO功能分析結果顯示，BP涉及對細菌來源的反應、對脂多糖的反應、藥物反應、節律反應、肽基酪氨酸修飾等，CC涉及細胞膜、膜筏、膜微區、質膜、質膜凹腔等，MF涉及核受體活性、配體活化轉錄因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結合、藥物結合等。KEGG富集分析結果顯示，柴胡-白芍藥對治療LI主要涉及PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等。其中，磷脂酰肌醇激酶PI3K激活，通過質膜的第二信與細胞內含有PH結構域的Akt結合，發揮改變細胞膜構象作用[24]。MAPK信號通路是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞通路，調節著細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理/病理過程[25]。研究表明，通過下調PI3K/AKT信號通路與MAPK信號通路，能夠減輕肝臟炎癥反應，起到防治LI的作用[26-28]。

運用分子對接技術，將柴胡-白芍藥對活性成分與治療LI的核心靶點AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR進行對接，發現分子對接結合構象穩定。其中山柰酚、β-谷甾醇與TNF結合能力最強，結合能分別為-11.4 kcal/mol、-10.2 kcal/mol。研究發現，山柰酚能用于多種LI類疾病的防治，通過調節PI3K/AKT信號通路，下調炎癥因子TNF、白細胞介素的表達水平來防治LI[29-30]。β-谷甾醇能夠通過下調炎癥因子TNF的表達，改善肝功能水平來減輕肝纖維化損傷[31-33]。以上提示山柰酚、β-谷甾醇等成分與AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR核心靶點，可能為柴胡-白芍藥對治療LI的關鍵成分和靶點。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學、分子對接技術證明了柴胡-白芍藥對能夠通過多通路、多靶點治療LI，其機制可能通過作用于AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR等核心靶點，調控PI3K/AKT、MAPK等信號通路有關。柴胡-白芍藥對治療LI的機制復雜，本研究缺少一定的體內外實驗驗證以進一步確定網絡藥理分析結果的準確性。后期將運用體內外實驗來進一步探究柴胡-白芍治療LI的機制，以期為中醫藥臨床應用提供理論依據和新的方向。