金耳總黃酮的體外抗氧化作用

殷金玲 馬 亮

金耳是一種金黃色、體態(tài)如腦狀、柔軟鮮嫩、具有彈性和韌性的可食用菌種，別名腦耳、腦形銀耳、金黃銀耳等。從1815年起菌物學(xué)家對其特異性開展了深入研究，發(fā)現(xiàn)金耳與傳統(tǒng)食用菌木耳、香菇等不同，需正式建立一個全新菌種。金耳實體是由外層的金耳與內(nèi)側(cè)的革菌組成的一種異質(zhì)復(fù)合體，因此引種馴化十分困難。直至20世紀(jì)80年代初，我國才開始進(jìn)行人工栽培研究。金耳具有喜光、好氣、耐干旱、抗寒冷等特點，故主要生長在云南、四川、貴州等高海拔山區(qū)，產(chǎn)量稀少。金耳是優(yōu)質(zhì)的食藥兼用菌，其潤滑爽口，富含活性多糖及多種生物堿、黃酮等成分，具有抗氧化、降血糖、調(diào)節(jié)免疫力、補益身心、延年益壽等作用。近年來對金耳的保健功效研究逐漸增多，如李元偉等[1]利用氣相質(zhì)譜對金耳實體石油醚層提取物進(jìn)行體外抗氧化研究。馮冰等[2]則發(fā)現(xiàn)金耳多糖降解產(chǎn)物可影響角質(zhì)細(xì)胞保濕相關(guān)蛋白的表達(dá)。蔣益等[3]則通過響應(yīng)面對超聲波輔助提取金耳多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化和探究。鄧云霞和瞿偉菁[4]則發(fā)現(xiàn)金耳胞外多糖能夠明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血，降低肝細(xì)胞的自氧化。

黃酮是一類廣泛存在于蔬菜、水果、食用菌等植物及菌類中的天然多酚類化合物。現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)表明，黃酮具有抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤、清除體內(nèi)自由基等廣泛、優(yōu)良的生物學(xué)效應(yīng)，擁有良好的開發(fā)前景。由于金耳中多糖含量明顯高于其他可食用菌種，因此目前對金耳的研究主要以提取多糖、氨基酸等成分及其相關(guān)生物活性物質(zhì)為主，而對黃酮作用的研究極其有限。本實驗以金耳為原料，通過微波輔助萃取總黃酮，研究其對自由基的清除能力及體外還原能力，進(jìn)而確定金耳總黃酮的體外抗氧化作用，以期為今后金耳精深加工提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

金耳鮮品采購于四川廣元；蘆丁對照品（江西佰草源生物科技有限公司）；無水乙醇、Tris-HCl緩沖液、鹽酸、H2O2、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、抗壞血酸、鄰苯三酚，分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津天泰儀器有限公司）；DZKW-2型電熱恒溫水浴鍋（天津天泰儀器有限公司）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AR224CN型電子分析天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；80-2型臺式離心機(jī)（常州潤華電器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鄭州予華儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1微波萃取金耳總黃酮將新鮮金耳清洗干凈，切成塊狀，放入65 ℃烘箱烘干。粉碎，過100目篩。稱取適量金耳細(xì)粉，在料液比1:20，微波時間4 min，微波功率400 W，乙醇濃度60%條件下，在微波中浸提。過濾，得到金耳萃取液，備用。

1.2.2繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取4.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 ml容量瓶中，用70%乙醇定容，配制成0.4 mg/ml濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。搖勻，用移液槍分別在比色管中吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml，然后加入70%乙醇，使總體積達(dá)1.2 ml，搖勻備用。再加入0.2 ml 5.0%亞硝酸鈉溶液及0.2 ml 10.0%硝酸鋁溶液，兩次混合后各靜置6 min。最后再加入2 ml 4%氫氧化鈉溶液，混合后靜置15 min。在波長510 nm處測定吸光值。設(shè)橫坐標(biāo)為蘆丁濃度，縱坐標(biāo)為吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程[5]。

1.2.3金耳總黃酮萃取率的測定準(zhǔn)確稱取5.00 ml萃取液置于50 ml容量瓶中，稀釋10倍，作為待測樣品，根據(jù)萃取液的吸光值和回歸方程計算實際萃取率。將測得的吸光度值代入蘆丁回歸方程公式中，可以測得萃取液中總黃酮濃度（C），再計算出樣品中的金耳總黃酮萃取率，公式如下：

金耳總黃酮萃取率（%）=C×V×N×100/M

C為萃取液中金耳總黃酮的濃度，mg/ml；V為萃取液體積，ml；N為稀釋倍數(shù)；M為金耳細(xì)粉樣品質(zhì)量，g。

1.2.4金耳總黃酮清除羥基自由基的測定取2 ml 7.5 mmol/L鄰二氮菲試劑，加入4 ml 0.2 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，以及2 ml不同濃度的被測樣品，經(jīng)搖勻后，再加入2 ml 0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2 ml 0.01%的H2O2，再次充分搖勻，在37 ℃條件下水浴1 h。在536 nm處測定吸光度，得到A1；用去離子水替代H2O2，得到吸光值A(chǔ)2；用去離子水代替被測樣液得到空白參照，得到吸光值A(chǔ)空白[6]。計算公式如下：

羥基自由基清除率（%）=（A1-A空白）/（A2-A空白）×100

1.2.5金耳總黃酮清除超氧陰離子自由基的測定取6只已編號的試管，分別加入4.5 ml pH8.2的Tris-HCl緩沖液，再依次加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml的總黃酮萃取液，然后逐一加入去離子水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 ml，充分混合，在恒溫水浴箱中用25 ℃保溫20 min，再迅速加入已預(yù)熱的0.3 ml 3 mmol/L鄰苯三酚溶液開始反應(yīng)，5 min后立即用10 mol/L鹽酸溶液2滴終止反應(yīng)。參照上述步驟，另取6只編號試管，依次加入Tris-HCl緩沖溶液、總黃酮萃取液、去離子水，用0.3 ml 3 mmol/L鄰苯三酚溶液啟動反應(yīng)，用10 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)。在420 nm處測定各試管的吸光度值，管0的吸光度為A1，加樣的吸光度為A2，然后按照下列公式計算超氧陰離子自由基的清除率：

超氧陰離子自由基清除率（%）=（A1-A2）/A1×100

1.2.6金耳總黃酮清除DPPH自由基的測定首先制備0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，分別吸取DPPH溶液4 ml加入不同的試管中，然后加入0.2 ml不同濃度的被測樣品，均勻混合，放在暗室內(nèi)反應(yīng)0.5 h，然后在波長517 nm下測定其吸光度，設(shè)為A1；以DPPH溶液4 ml中加入70%乙醇0.2 ml的吸光度作為A0，無水乙醇4 ml中加入0.2 ml萃取液的吸光度作為A2；根據(jù)下式計算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100[7]

1.2.7 金耳總黃酮相對還原能力的測定在不同體積的樣品溶液中依次加入pH6.6、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液2.5 ml，再加入1%鐵氰化鉀溶液2.5 ml，充分混合后，放置于50 ℃水浴箱中反應(yīng)20 min，然后取出再急速冷卻，隨后加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml進(jìn)行定容[8]，用離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min。取離心上清液5 ml，加去離子水4 ml，再加0.1% FeCl3溶液0.5 ml，均勻混合10 min后，在700 nm處測定吸光值，以相同濃度的乙醇溶液作為空白對照，平行測定3次。吸光值越大則表明其還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為A=9.616 1x+0.044 3（R2=0.999 3）。

2.2 金耳總黃酮萃取含量的測定

在波長510 nm處測定金耳萃取液吸光度，然后通過回歸方程計算出金耳中總黃酮的含量為0.683 2%。

2.3 羥基自由基的清除能力

以維生素C（VC）作為參照對象，當(dāng)金耳總黃酮濃度小于0.05 mg/ml時，兩者對于羥基自由基的清除作用基本相近，無明顯差距。當(dāng)逐漸增加雙方濃度時，金耳總黃酮的羥基自由基清除速率快速上升，VC上升過程呈平緩狀態(tài)。當(dāng)濃度上升到0.14 mg/ml時，VC對羥基自由基的清除率僅為58%，而金耳總黃酮對羥基自由基的清除率則高達(dá)84%。見圖1。

圖1 金耳總黃酮和VC對羥基自由基的清除能力

2.4 超氧陰離子自由基的清除能力

與VC清除效果比較，在同等濃度條件下均顯著優(yōu)于VC的清除效率。當(dāng)金耳總黃酮濃度為0.07 mg/ml時，超氧陰離子自由基的清除率達(dá)91%。見圖2。

圖2 金耳總黃酮和VC對超氧陰離子自由基的清除能力

2.5 DPPH自由基的清除能力

從圖3可以看出，金耳總黃酮對DPPH自由基的清除率與加樣濃度成明顯的線性關(guān)系，當(dāng)樣品濃度達(dá)0.12 mg/ml時，其對DPPH自由基的清除率維持在90%上下，同等條件下VC對DPPH自由基的清除率接近85%。

圖3 金耳總黃酮和VC對DPPH自由基的清除能力

2.6 相對還原能力

通過圖4可以看出，金耳總黃酮的相對還原能力與加樣濃度成較好的線性關(guān)系，還原能力隨著樣品濃度增加，逐漸增強(qiáng)。VC具有較強(qiáng)的還原能力，金耳總黃酮的還原能力低于同濃度VC。

圖4 金耳總黃酮和VC的還原能力比較

3 討論

超氧陰離子自由基是由基態(tài)氧結(jié)合了一個電子而形成的氧自由基，其廣泛存在于生物體內(nèi)，當(dāng)其與羥基結(jié)合后，會破壞人體細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜相系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，加速細(xì)胞裂變凋亡。故清除體內(nèi)超氧陰離子自由基可起到緩解細(xì)胞損傷，維持體內(nèi)代謝平衡，延緩衰老等作用。DPPH自由基是目前廣泛使用的用于評價抗氧化性的檢驗指標(biāo)。其在有機(jī)溶劑中有良好的穩(wěn)定性，自由基清除劑能夠使其顏色變淺，進(jìn)而根據(jù)吸光度的變化，來判斷清除自由基的能力[9-10]。以新鮮金耳為原料，利用微波萃取其總黃酮成分，得到總黃酮含量為0.683 2%。金耳總黃酮具有優(yōu)良的體外抗氧化作用，可以作為天然抗氧化劑使用。當(dāng)濃度為0.14 mg/ml時，金耳總黃酮對羥基自由基的清除率為84%；當(dāng)濃度為0.07 mg/ml時，金耳總黃酮對超氧陰離子自由基的清除率為91%；當(dāng)樣品濃度為0.12 mg/ml時，其對DPPH自由基的清除率達(dá)90%上下。同時金耳總黃酮還有較強(qiáng)的還原能力，但相對還原能力不如VC。金耳作為一種新型食藥用菌，具有廣闊的市場開發(fā)前景，本研究對金耳總黃酮的體外抗氧化作用進(jìn)行了研究，可為后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)新產(chǎn)品提供理論依據(jù)。