紫草油搽劑的制備工藝及質(zhì)量評價

吳 韻 吳 俊 何 頻 洪仕奎 馬麗娟 夏開梅 成 雪

濕疹是臨床上常見的一種反復(fù)發(fā)作的皮膚炎癥變態(tài)反應(yīng)，表現(xiàn)為皮膚瘙癢、疼痛[1-2]。因年輕父母缺乏養(yǎng)育經(jīng)驗，以及非植物纖維尿布的使用，濕疹、尿布疹的發(fā)病率逐年升高，可對新生兒生命健康造成嚴(yán)重影響。紫草油出自清代《瘡瘍大全》，對小兒濕疹、尿布疹治療效果明顯，而紫草油搽劑是在紫草油方的基礎(chǔ)上總結(jié)出的經(jīng)驗方，由紫草、金銀花、地黃、當(dāng)歸、防風(fēng)和冰片組成，具有清熱解毒、涼血止痛、燥濕止癢的功效，用于新生兒濕疹、尿布疹。目前，臨床上使用的紫草油搽劑是由醫(yī)生為患兒開具紫草油處方，由患兒家長自行加入菜籽油浸泡處方，得到的自制紫草油搽劑存在質(zhì)量不穩(wěn)定、療效不確切等問題。本研究對紫草油搽劑制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并初步評價其質(zhì)量，為進(jìn)一步研究紫草的中藥制劑提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

754PC紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），BCD-196SRX冰箱（合肥美的榮事達(dá)電冰箱有限公司），HH-W600數(shù)顯三用恒溫水浴鍋（江蘇金怡科技儀器有限公司），WFH-203B三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司），CQ-120超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠），F(xiàn)A1004電子天平（上海方瑞儀器有限公司）。

1.2 材料

95%乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20200217），三氯甲烷（西隴科技股份有限公司，批號：191005），氫氧化鈉（重慶川東化工有限公司，批號：20180101），鹽酸（廣東汕頭市西隴化工，批號：20190806），紫草（湖北潤康藥姑山中藥飲片有限公司，批號：20220401），金銀花（湖北潤康藥姑山中藥飲片有限公司，批號：210701331），生地（貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司，批號：220401），防風(fēng)（湖北潤康藥姑山中藥飲片有限公司，批號：220701），當(dāng)歸（重慶上藥慧遠(yuǎn)慶龍藥業(yè)有限公司，批號：220600121），冰片（福建青松股份有限公司，批號：220307），左旋紫草素（中國藥品生物制品檢定所，批號：110769-200506），地黃對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：121180-202107），山茶油（湘西沃康油業(yè)科技有限公司，批號：WK0520），環(huán)己烷（西隴科技股份有限公司，批號：20210709），乙酸乙酯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20220412），甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20200318），甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20190803），冰乙酸（羅恩試劑，批號：RH197316），甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20230105）。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素試驗

對浸泡時間、藥材粉碎度、提取次數(shù)、超聲促溶時間進(jìn)行單因素考察。固定其他因素不變，每次改變1種因素，即稱取處方量藥材，用山茶油浸泡，濾過，合并濾液。取3 ml于分液漏斗中，加入1%氫氧化鈉溶液萃取3次，20 ml/次。在萃取液中滴入10%鹽酸溶液直至其變?yōu)榉奂t色，將其轉(zhuǎn)入到分液漏斗中，用三氯甲烷進(jìn)行萃取，萃取3次，所用體積分別為20 ml、20 ml、10 ml。將萃取得到的溶液揮干后用95%乙醇復(fù)溶至50 ml容量瓶中，定容至刻度，即得。結(jié)果表明超聲促溶時間對樣品中羥基萘醌總色素的含量影響較小，而浸泡時間3、4、5 d，藥材為原藥材、粗碎品、細(xì)碎品，提取次數(shù)1、2、3次時，對羥基萘醌總色素的含量影響較大。

2.2 正交試驗

2.2.1正交試驗因素水平根據(jù)單因素考察結(jié)果，以影響制備工藝的三大主要因素提取次數(shù)（A）、藥材粉碎度（B）、浸泡時間（C）為考察因素，以羥基萘醌總色素為指標(biāo)，用L9（34）正交試驗優(yōu)選紫草油搽劑的最佳制備工藝，因素水平見表1。

表1 正交因素水平

2.2.2正交安排及結(jié)果根據(jù)因素水平表，按照L9（34）正交設(shè)計表進(jìn)行實驗。羥基萘醌總色素樣品溶液制備為稱取處方量藥材，根據(jù)正交試驗表1進(jìn)行浸泡后，濾過。取3 ml于分液漏斗中，加入1%氫氧化鈉溶液萃取3次，20 ml/次。在萃取液中滴入10%鹽酸溶液直至其變?yōu)榉奂t色，將其轉(zhuǎn)入到分液漏斗中，用三氯甲烷進(jìn)行萃取，萃取3次，所用體積分別為20 ml、20 ml、10 ml。將萃取得到的溶液揮干后用95%乙醇復(fù)溶至25 ml容量瓶中，定容至刻度，即得。采用評分的方法，對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。見表2。

表2 正交試驗評分

K1、K2、K3分別代表提取次數(shù)、藥材粉碎度及浸泡時間3個水平下的指標(biāo)總和，數(shù)值越大，影響越大；R代表極差，表明提取次數(shù)、藥材粉碎度及浸泡時間對整個工藝的影響，數(shù)值越大，影響越大

2.2.3數(shù)據(jù)處理由極差R可知，對紫草油搽劑制備工藝影響最大的是浸泡時間（C），其次是藥材粉碎度（B）和提取次數(shù)（A）。采用SPSS 26.0對兩組平行數(shù)據(jù)組間誤差進(jìn)行方差估算，結(jié)果表明，因素A、B、C對實驗結(jié)果均有顯著性影響。見表3。因素C3＞C2＞C1，B1=B2＞B3，A2＞A1＞A3，因此紫草油搽劑制備的最佳工藝為225 ml山茶油浸泡原藥材，浸泡兩次，共浸泡5 d。

表3 正交試驗數(shù)據(jù)方差分析

2.3 驗證試驗

稱取處方量藥材，根據(jù)正交試驗結(jié)果，進(jìn)行3份平行試驗。按照正交試驗優(yōu)選出的最佳制備工藝，即加入山茶油浸泡原藥材，每次225 ml浸泡2.5 d，浸泡兩次，共浸泡5 d。按照“2.2.2正交安排及結(jié)果”項下處理樣品，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性較好。見表4。

表4 正交優(yōu)選驗證性試驗結(jié)果

2.4 質(zhì)量評價

2.4.1外觀性狀紫草油搽劑為紫紅色透明油狀液體。

2.4.2含量測定

2.4.2.1對照品溶液制備精密稱取左旋紫草素對照品0.001 1 g于10 ml容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度，超聲使左旋紫草素完全溶解，即得。

2.4.2.2供試品溶液制備稱取處方量藥材，放入帶塞的玻璃瓶中，加入225 ml的山茶油浸泡2.5 d，濾過，再加入225 ml的山茶油浸泡2.5 d，過濾，合并濾液。取濾液3 ml于分液漏斗中，加入1%氫氧化鈉溶液萃取3次，20 ml/次。在萃取液中滴入10%鹽酸溶液直至其變?yōu)榉奂t色，將其轉(zhuǎn)入到分液漏斗中，用三氯甲烷進(jìn)行萃取，萃取3次，所用體積分別為20 ml、20 ml、10 ml。將萃取得到的溶液揮干后用95%乙醇復(fù)溶至25 ml容量瓶中，定容至刻度，即得。

2.4.2.3最大吸收波長[3]精密量取對照品溶液、2.4.2.2項下制備的供試品溶液適量，以空白溶劑為對照，于200～800 nm波長下進(jìn)行掃描，對照品與供試品溶液于522 nm處均有最大吸收，確定522 nm為本實驗的測定波長。見圖1～2。

圖1 左旋紫草素對照品光譜波長

圖2 供試品溶液光譜波長

2.4.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密配制不同濃度的左旋紫草素對照品溶液，分別為0.019、0.038、0.076、0.114、0.19 mg/ml，按2.4.2.3項下操作步驟測定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，左旋紫草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到左旋紫草素回歸方程為Y=4.852 2x+0.048 5，R2=0.999，結(jié)果表明左旋紫草素對照品溶液在0.019～0.19 mg/ml的濃度范圍內(nèi)與吸光度值成良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2.5精密度試驗精密量取左旋紫草素對照品適量，按2.4.2.3項下操作，于522 nm處連續(xù)6次測定其吸光度，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為0.04%（n=6），表明本實驗儀器精密度良好。

2.4.2.6穩(wěn)定性試驗稱取處方量藥材，按照2.4.2.2項下制備供試品溶液，按2.4.2.3項下操作，于522 nm處測定0、10、20、40、80、120 min的吸光度，其RSD值為2.19%（n=6），表明顯色反應(yīng)在120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2.7 重復(fù)性試驗稱取處方量藥材6份，按照2.4.2.2項下制備供試品溶液，按2.4.2.3項下操作，于522 nm 處測定樣品的吸光度，其RSD值為0.96%（n=6），表明重復(fù)性良好。

2.4.2.8加樣回收試驗取已知含量的樣品6份，按照2.4.2.2項下制備供試品溶液，分別加入對照品溶液，按2.4.2.3項下操作，于522 nm處測定樣品的吸光度，計算平均回收率為99.98%，RSD為0.13%（n=6），表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.4.2.9樣品測定稱取處方量藥材3份，按照2.4.2.2項下制備供試品溶液，按2.4.2.3項下操作，于522 nm處測定吸光度，將吸光度代入2.4.2.4項下的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，結(jié)果得到紫草油搽劑中羥基萘醌總色素含量。見表5。

表5 3批紫草油搽劑的含量

2.4.3.1.4 顯色劑制備取5 g氫氧化鉀溶于50 ml甲醇溶液中，得到10%氫氧化鉀甲醇溶液。

2.4.3.1.5 薄層方法依照2020版《中華人民共和國藥典》[3]中TCL，分別吸取2.4.3.1.1、2.4.3.1.2、2.4.3.1.3溶液在同一硅膠G板上點樣，用環(huán)己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）混合液展開，自由揮干后，觀察斑點，再噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液顯色，觀察斑點。

2.4.3.1.6 薄層結(jié)果紫草的TCL鑒別結(jié)果見圖4，從圖中可知，自由揮干后在相同位置出現(xiàn)紫紅色的斑點，顯色后在相同位置出現(xiàn)藍(lán)色斑點。

圖4 紫草的TCL鑒別

2.4.3.2地黃的TCL鑒別

2.4.3.2.1 對照品溶液的制備精密稱定地黃對照藥材1 g，加入20 ml石油醚靜置24 h后，揮干溶液，用1 ml氯仿溶解，即得。

2.4.3薄層色譜法（TLC）鑒別

2.4.3.1 紫草的TLC鑒別

2.4.3.1.1 對照品溶液的制備精密稱定左旋紫草素對照品，加入95%乙醇溶液得到濃度為0.36 mg/ml的對照品溶液。

2.4.3.1.2 樣品溶液的制備按照2.4.2.2項下制備供試品溶液，取5 ml濃縮至1 ml。

2.4.3.1.3 陰性對照品溶液的制備按處方去掉紫草，按照2.4.2.2項下制備。

2.4.3.2.2 樣品溶液的制備按照“2.4.2.2”項下制備供試品溶液，揮干后，用1 ml氯仿溶解，即得。

2.4.3.2.3 陰性對照品溶液的制備按處方去掉地黃，按照2.4.2.2項下制備，用1 ml氯仿溶解，即得。

2.4.3.2.4 薄層方法參考文獻(xiàn)[4]，分別吸取2.4.3.2.1、2.4.3.2.3、2.4.3.2.3溶液在同一硅膠H板上點樣，用環(huán)己烷-氯仿-冰醋酸（7∶2∶1）混合液展開，自由揮干后，觀察斑點。

2.4.3.2.5薄層結(jié)果地黃的TCL鑒別結(jié)果見圖5，由圖5可知，自由揮干后在相同位置出現(xiàn)黃色斑點。

3 討論

紫草作為一味常用的傳統(tǒng)中藥，擁有悠久的藥用歷史，一般在春、秋兩季采收，其味甘、咸，性寒，主歸心、肝二經(jīng)，具有涼血活血、清熱解毒、透疹消斑作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，紫草中的主要化學(xué)成分為醌類、黃酮類、生物堿類、酚酸類及多糖，以醌類為主，藥理作用主要表現(xiàn)為抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等[6-7]，臨床上常用于治療潰瘍、濕疹及燒燙傷等。羥基萘醌總色素是紫草中的主要有效成分，受熱不穩(wěn)定，因此本實驗采用山茶油對紫草進(jìn)行浸泡處理，有利于有效成分的溶出，成功制備紫草油搽劑解決了患兒家長自制藥劑不安全、質(zhì)量不穩(wěn)定、療效得不到保障等問題。

圖5 地黃的TCL鑒別