他克莫司的分離提純研究

王圓超 趙輝 王月 谷巖翡 高月麒 李曉露

摘要：目的 開發一種他克莫司的分離提純工藝。方法 采用離子交換樹脂脫色除雜、納濾、結晶等手段得到高質量的他克莫司粗粉，再經反相色譜硅膠層析、復合溶液結晶，得到符合USP標準的他克莫司精粉。結果 優選的脫色樹脂為D002，所得他克莫司粗粉效價大于800 μg/mg，二氫他克莫司含量小于4%；該粗粉經UniSil C8 Ultra Plus層析純化，精粉含量大于99.5%，最大單雜小于0.1%。結論 該工藝操作簡單、能耗低、收率高，適于他克莫司的產業化應用。

關鍵詞：他克莫司；分離提純；離子交換樹脂；層析；結晶

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Studies on the separation and purification of tacrolimus

Abstract Objective ? The purpose of this study is to develop a separation and purification process for tacrolimus. Methods? ? Tacrolimus coarse powder with high purity was obtained by ion exchange resin decolorization， nanofiltration and crystallization， which was further refined by reverse phase chromatography silica gel chromatography and composite solution crystallization to obtain the tacrolimus product that can meet USP standards. Results? ? The optimized decolorizing resin was D002. The titer of the tacrolimus coarse powder was more than 800 μg/mg and the purity of the dihydro-tacrolimus was less than 4%. Then we continued to purify the coarse powder using UniSil C8 Ultra Plus chromatography to obtain the fine powder. And the purity of the tacrolimus fine powder was more than 99.5%; the maximum single impurity substance was less than 0.1%. Conclusion? ? This method had the characteristics of simple operation， low energy consumption and high yield， which were of great significance to the industrial production of tacrolimus.

Key words Tacrolimus; Separation and purification; Ion exchange resin; Chromatography; Crystallization

他克莫司（tacrolimus，又名FK506），是由筑波鏈霉菌發酵產生的一種大環內酯類抗生素，1993年獲批上市，分子式為C44H69NO12，分子量：804.03，結構式如圖1所示，為白色或類白色結晶性粉末[1]。他克莫司是一種強效的新型免疫抑制劑，可用于肝移植、腎移植和骨髓移植等手術術后的排斥反應治療[2]。其免疫抑制作用較環孢素（CsA）強100倍，因此在降低臨床使用劑量的同時，可大大減少不良反應。此外，他克莫司也可用于治療特應性皮炎、系統性紅斑狼瘡和自身免疫性等疾病[3]。

他克莫司可通過微生物發酵進行規模化生產，其發酵液中除目標產物外，還含有油脂、有機色素及他克莫司類似物，包括二氫他克莫司（FK+2）和子囊霉素（FK520）等雜質[4]。工業上高純度的他克莫司主要通過預處理后的粗粉經過柱層析的方法獲得[5-6]，因此粗粉的純度直接影響著他克莫司產品的質量。目前，關于大孔吸附樹脂或改性硅膠吸附分離他克莫司的研究較多[7]，但大多工藝繁瑣，能耗高，粗粉質量低。溫耀明等[8]使用中型高速逆流色譜法，提高了他克莫司粗粉質量，但需要特殊設備，存在著純化收率低和工業化成本高的問題。吳振強等[9]將溶劑萃取和超臨界流體萃取相結合，從發酵菌絲體中提取他克莫司，此法提高了產品收率，但消耗大量溶劑，能耗高，環境污染嚴重。高慶峰等[10]采用復合型活性炭脫色除雜的方法純化他克莫司，避免了吸附解析步驟，減少了溶劑的使用，但未能得到高純度的他克莫司樣品，無法滿足高純度他克莫司產品的需求。因此，本領域亟需一種工藝簡潔、生產周期短、純度及收率高、綠色環保的他克莫司生產工藝。

本研究選用離子交換脫色樹脂，對他克莫司浸提液進行了凈化處理，在去除有機色素的同時，有效降低了發酵副產物雜質的比例，繼而通過納濾、萃取、結晶的方式，制備得到了高質量的他克莫司粗粉；再經反相硅膠色譜層析、結晶等方式，得到顆粒均勻、質量穩定的他克莫司原料，為該產品通過國際高端認證、拓展高端市場奠定了基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

他克莫司發酵液（單位1617 μg/mL）由華北制藥華勝有限公司提供；分析純乙醇、乙腈、正庚烷購自天津市永大化學試劑有限公司；分析純乙酸乙酯、異丙醚購自天津市科密歐化學試劑有限公司；分析純甲醇購自成都市科隆化學品有限公司；90-772型藥用活性炭購自浙江杭木活性炭有限公司；超純水由Rephile純水儀制備。

D002、D290樹脂購自上海遜爾化工科技有限公司；氧化鋁購自國藥集團化學試劑有限公司；UniSil C18、UniSil C8 Ultra Plus、UniSil C8型反相色譜硅膠購自蘇州納微科技股份有限公司。

1.2 儀器

Loborata 4000型旋轉蒸發器（Heidolph公司）；JM1812-1卷式膜小型實驗機（大連屹東膜工程設備有限公司）；LC-2030C 3D型高效液相色譜儀（日本島津公司）；有機膜（天津膜天膜科技股份有限公司）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：B=49：51，流動相A為水：四氫呋喃：磷酸=3000：600：0.8，流動相B為乙腈：四氫呋喃：磷酸=3000：600：0.8；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

2.2 他克莫司粗粉制備

發酵液減壓抽濾，得到菌絲。菌絲中加入1倍發酵液體積的乙醇溶液攪拌浸泡2 h，抽濾得到浸提液。將浸提液調酒精度至45%～50%，上樣于脫色介質除雜，透過液納濾濃縮得到濃縮液。乙酸乙酯萃取濃縮液1次，堿洗乙酸乙酯相2次后，萃取液濃縮至油膏狀，加入異丙醚結晶，結晶液過濾干燥后得到他克莫司粗粉。

2.3 他克莫司精粉制備

他克莫司粗粉用乙醇溶解，上樣于反相色譜硅膠中，使用有機溶液解析，分段收集解析液，合并含二氫他克莫司＜0.1%、子囊霉素＜0.1%的解析液。解析液減壓濃縮后加入乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮干燥后，加入極性溶劑，攪拌結晶，然后過濾、干燥，得到他克莫司精粉。

3 結果與討論

3.1 浸提溶劑的選擇

由于他克莫司為胞內產物，所以要選擇合適的浸提溶劑將他克莫司從胞內提取出來。他克莫司易溶于甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯，微溶于己烷和石油醚，難溶于水[11]。乙醇毒性小，易于放大生產，因此選擇乙醇作為浸提溶劑，考察了乙醇濃度對浸提效果的影響。如圖2所示，當乙醇濃度為90%時，浸提效果最好。

3.2 脫色除雜參數的選擇

3.2.1 脫色介質的優選

他克莫司浸提液為棕褐色，顏色較深，且其中雜質含量（FK+2和FK520，下同）較高。如能在粗粉制備階段除去大部分雜質，則可提高粗粉質量，也可為制備高純度精粉奠定基礎。如表1所示，浸提液通過Al2O3與D290樹脂后，他克莫司濃度降低幅度雖較小，但樹脂對色素、雜質等吸附能力較弱，脫色效果差。活性炭對他克莫司的吸附能力很強，造成了極大損失。而經過D002離子交換樹脂的浸提液中雜質含量明顯降低，且D002離子交換樹脂對他克莫司的吸附性小，脫色液的顏色也較淺，故選擇D002樹脂作為他克莫司浸提液的脫色介質。

3.2.2 洗脫流速的優選

考察不同流速下D002離子交換樹脂對他克莫司浸提液的脫色效果，如表2所示。結果表明，不同流速下透過液中他克莫司濃度變化不大。當流速較低時，雜質含量低，但脫色效率低；而過高的流速會使雜質含量升高。當流速從0.5 BV/h升至1 BV/h時，透過液中雜質含量變化不大；當流速繼續升至1.5 BV/h時，透過液中雜質含量明顯升高，脫色液顏色變深。因此，選擇1 BV/h為最佳上樣速度。

3.3 納濾膜型號的選擇

納濾膜可截留大量亞微粒及大分子物質，改善料液的透光度，降低相對密度，從而提高結晶收率，加快結晶過濾速度[12]。而且采用納濾濃縮取代傳統減壓濃縮，可有效降低能耗，提高濃縮效率。因此對不同截留分子量納濾膜的截留效果及濃縮時間進行了考察，結果如圖3所示。截留分子量為200～300 Da時，截留率高，但濃縮時間較長；截留分子量為700 Da時，濃縮時間短，但截留率低。綜合考慮，選擇截留分子量為500 Da的膜對脫色液進行納濾濃縮。

3.4 層析參數的選擇

他克莫司發酵液經離子交換樹脂脫色除雜、納濾、結晶等方法分離純化后，可以得到效價大于800 μg/mg，最大單雜小于4%的他克莫司粗粉。為獲得高質量的他克莫司精粉，本文采用反相色譜硅膠層析、結晶技術對粗粉進一步提純。

3.4.1 層析介質的優選

考察UniSil C18、UniSil C8 Ultra Plus和UniSil C8? ?3種反相色譜硅膠的分離效果，結果如圖4所示，其中UniSil C8 Ultra Plus型色譜硅膠FK506含量、收率最高，故選擇UniSil C8 Ultra Plus型反相色譜硅膠為層析介質。

3.4.2 洗脫溶劑的優選

乙醇、甲醇、乙腈均可將他克莫司從反相色譜硅膠中洗脫下來，如圖5所示，乙腈洗脫時溶劑用量少，但FK506含量及收率低；而甲醇、乙醇洗脫時，FK506含量、收率、洗脫液體積均相差不大，但考慮到溶劑毒性，工藝放大生產的安全性等因素，綜合評估后選擇乙醇作為洗脫溶劑。

3.4.3 上樣量的優選

考察不同上樣量對于層析效果的影響，結果如圖6所示，其中上樣量為8 mg/mL時FK506含量、收率最高。因此上樣量選擇為8 mg/mL。

3.5結晶溶劑的選擇

藥物的固體形式（結晶形或無定形）對藥物的性質和后續產品的性能有較大影響[13]。在藥物結晶時，溶劑的種類和濃度會影響結晶過程，進而影響其固體形式[14]。因此，本研究選擇不同溶劑進行了結晶實驗。如圖7所示，當單獨使用異丙醚、正庚烷作為結晶溶劑時，結晶粉中FK506含量較低。若使用復合溶劑，結晶粉中FK506含量得到較大提升。其中異丙醚-水、異丙醚-乙酯-水作為結晶溶劑時，FK506含量較高。但異丙醚-乙酯-水作為結晶溶劑時，FK506結晶收率較低。而異丙醚-水作為結晶溶劑時，FK506含量、結晶收率均較高，且結晶粉為片狀結晶，顆粒均勻，如圖8所示。因此，選擇異丙醚-水作為他克莫司的結晶溶劑。

3.6 工藝驗證

按照確定的工藝條件，進行連續3批的重復實驗，如表3～4所示。在本實驗優選工藝參數下可得到效價大于800 μg/mg的他克莫司粗粉，二氫他克莫司小于4%；所得他克莫司精粉含量大于99.5%，最大單雜小于0.1%。本工藝穩定性高、重現性好，可實現產業化應用。

4 結論

他克莫司是繼環孢素后開發的一種大環內酯類抗生素，是目前臨床上最為看好的強效免疫抑制劑之一。本文以他克莫司發酵液為原料，利用離子交換樹脂脫色除雜、納濾濃縮與層析純化技術等，得到了含量大于99.5%，最大單雜小于0.1%的他克莫司精粉。該工藝從源頭上降低了有機色素等雜質的干擾，提升了粗粉質量，進而穩定提高了精制效率，更好保證了產品質量。與現有提取技術相比具有純度及收率高、溶媒用量少、環境污染小等特點，實現了他克莫司的技術指標提高和生產環境優化，對其工業化生產具有重要意義。

參 考 文 獻

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