他克莫司高產菌株選育及發酵配方優化

王會會 趙建輝 孫術超 劉雨 任風芝 趙建強

摘要：目的 選育他克莫司高產菌株，優化培養基配方，提高發酵產量。方法 采用原生質體融合技術對2株筑波鏈霉菌進行基因組重排，并經響應面設計對發酵培養基配方進行優化。結果 以紫外滅活作為遺傳標記經過4輪基因組重排育種后，搖瓶篩選獲得3株高產菌株，其中菌株FK22-71菌絲球松散、橢圓狀，發酵浸泡液顆粒狀。該菌株穩定高產，采用響應面設計優化后的配方在50 L罐發酵產量平均達1684 mg/L。結論 基因組重排技術應用于他克莫司高產菌株選育，可大幅提高發酵產量，為其工業化發酵生產奠定了基礎。

關鍵詞：基因組重排；他克莫司；響應面設計；培養基優化

中圖分類號：R978文獻標志碼：A

Breeding of tacrolimus high-yield strain and optimization

of fermentation conditions

Abstract Objective Breeding high-yield strains of tacrolimus and optimizing the culture medium formula to improve the fermentation unit. Methods The protoplast fusion technique was used to rearrange the genome of two Streptomyces tsuknbaenis strains， and the fermentation medium was optimized by response surface design. ResultsAfter four rounds of genome shuffling breeding with UV inactivation as genetic marker， three high-yield strains were obtained by shaking flask screening. Among them， the mycelium ball of strain FK22-71 was loose and oval， and the fermentation soaking liquid was granular. In 50 L fermentor， the average production of tacrolimus reached 1684 mg/L under the response surface optimization by the strain FK22-71，which was steady and high-yielding. Conclusion The application of genome shuffling technology in the breeding of high-yielding tacrolimus producing strains can significantly increase production and lay the foundation for industrial fermentation production.

Key words Genome shuffling; Tacrolimus; Response surface design; Medium optimization

他克莫司（tacrolimus）作為第二代免疫抑制劑的代表之一，可以抑制干擾素IFN-r、白細胞介素和抗體的產生，有抗器官移植排異作用，其免疫抑制作用機制與環孢素相似，但在體外抑制T淋巴細胞的強度是環孢素A的10～100倍，臨床使用劑量低，效果良好[1-2]，

據報道，2022年他克莫司全球銷售額為26.55億美元，在自身免疫性疾病中發揮著積極作用。

他克莫司是筑波鏈霉菌（Streptomyces tsukuba-ensis）產生的一種結構復雜的次級代謝產物，其工業化生產受到菌種和發酵過程等因素的制約，影響了他克莫司的成本和應用規模[3]。自他克莫司被發現并應用于臨床以來，有關筑波鏈霉菌和他克莫司生物合成的研究一直在持續進行，研究者們采用不同方法，如：生產菌株選育、發酵工藝優化和代謝工程改造等，來提高他克莫司產量，取得了顯著進步。嚴凌斌等[4]采用60Coγ輻射和亞硝基胍（NTG）復合誘變并結合鏈霉菌和慶大霉素抗性篩選，獲得的高產菌株搖瓶發酵水平較出發菌株提高65%，中試發酵平均水平達1319 mg/L。Ye等[5]采用（常壓室溫等離子體）ARTP和原生質體融合技術對出發菌株S. tsukubaensis No. 9993進行多輪篩選，獲得的突變菌株產量是出發菌株的2.6倍。李蕾[6]對他克莫司產生菌進行多輪紫外（UV）、硫酸二乙酯（DMS）、NTG的誘變選育，發現經同一種方法或同一誘變劑多輪誘變后，產量提升幅度較低。

基因組重排技術（genome shuffling，GS）以含有不同正突變體的突變菌株為起始，利用原生質體融合的方法將不同突變體的基因組重排[7]。GS技術可以大幅度地縮短菌株選育周期，同時采用遞推式重組技術明顯增大菌株的進化幾率，擴大變異范圍，增加獲得高產突變菌株的機會。該技術可在無需了解編碼生物酶基因、基因表達調控、微生物代謝途徑等知識的條件下，對微生物實現定向育種，獲得目的菌株[8-9]。李婧婧等[10]對1株普那霉素產生菌Streptomyces pristinaespiralis LS15 進行 Genome Shuffling 的育種研究，獲得的融合子普那霉素產量比原始菌株提高了91.5%。Song等[11]對Streptomyces diastatochromogenes進行3輪基因組改組篩選，獲得融合菌株豐加霉素產量比野生型提高了10.8倍，比親本菌株提高了2.64倍。

響應面分析法（response surface methodology，RSM）是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法，具有試驗次數少、周期短、精度高等特點，收到越來越多的重視，已被成功用于發酵優化、尋求最佳工藝參數等多個領域。張瀚等[12]利用響應面實驗設計對刺糖多胞菌的發酵培養基進行優化，獲得了最佳植物油脂的添加量，顯著提高了多殺菌素的產量。

本研究采用的2株筑波鏈霉菌出發株為ARTP誘變選育獲得，為進一步提升發酵產量，對2株菌株采用原生質體融合進行多輪基因組重排，最終獲得了適合工業化生產的高產菌株，并應用響應面方法對發酵培養基優化，得到有利于高產菌株的配方，提高了他克莫司發酵產量，促進了其工業化生產成本的降低。

1 材料與儀器

1.1 出發菌株

筑波鏈霉菌（Streptomyces tsukubaensis）FK18-1-56和FK18-1-106[13]，搖瓶發酵單位分別為1147和

1064 mg/L，其中FK18-1-56實驗罐他克莫司發酵產量997 mg/L，本實驗室保藏。

1.2 培養基

固體培養基和液體培養基配方同參考文獻[12]。

再生培養基：固體培養基中加10.3%蔗糖。

緩沖液：蔗糖10.3%，葡萄糖0.1%，CaCl2·2H2O 0.37%，MgCl2·6H2O 0.2%，1 mol/LTris-HCl 0.03%，pH 7.6。

1.3 試驗試劑和儀器

溶菌酶（上海生工生物技術有限公司，酶活力≥20000 U/mg）；UV8AC紫外誘變箱（上海捷鈦儀器設備有限公司）；e2695高效液相色譜儀（Waters有限公司）；恒溫水浴鍋（蘇州國華儀器有限公司）光學顯微鏡（奧林巴斯工業有限公司）。

2 實驗方法

2.1 基因組重排方法

2.1.1 原生質體制備

將固體培養基上生長良好的筑波鏈霉菌菌苔挖塊接種于含有1%甘氨酸的種子培養基中，振蕩培養24 h后取10 mL培養液用離心機3000 r/min離心10 min去掉上清，沉淀中加入10 mL P-buffer反復吹吸洗滌菌絲體，重復洗3次，最后用5 mL P-buffer重懸。混合液中加入溶菌酶混勻，恒溫水浴鍋中30 ℃水浴酶解，期間輕輕振蕩混勻并間隔一定時間取樣，顯微鏡鏡檢觀察原生質體形成情況，血球計數板計數記錄原生質體形成數。酶解結束，用無菌脫脂棉過濾除去菌絲體，濾液離心機1500 r/min離心5 min，去掉上清后用10 mL P-buffer反復洗滌沉淀除去殘留的酶液，最后用5 mL P-buffer重懸后得到原生質體溶液。

2.1.2 原生質體UV處理

將原生質體溶液置于無菌培養皿中，于紫外誘變箱（紫外功率36 W）分別照射10、20、30、40、60和80 s，梯度稀釋后涂布于再生培養基中。培養結束后，統計長出的菌落數，以未經處理的菌落數為對照，計算致死率。

致死率=[（未經UV處理的單菌落數-UV照射處理后的菌落數）/未經UV處理的單菌落數]×100%

2.1.3 原生質體再生

制備的原生質體溶液用P-buffer梯度稀釋后分別 涂布于再生培養基平板和固體培養基平板上培養，統計長出的菌落數（分別記為A和B）。直接以未處理的出發菌液稀釋后培養，統計長出的菌落數（C）。

原生質體再生率（%）=（A-B）/（C-B）×100%。

2.1.4 原生質體融合

將2株親本筑波鏈霉菌制備的原生質體經紫外處理后等體積混合，取1 mL混合溶液，低溫離心機3000 r/min離心10 min，去掉上清，沉淀中加入

1 mL P-buffer用移液器槍頭輕輕吹吸進行混勻，再加入3 mL 40% PEG4000融合液，混合均勻后，30 ℃恒溫水浴進行原生質體融合，融合結束后立即加入3 mL P-buffer終止反應，低溫離心機3000 r/min離心10 min，去掉上清，沉淀用P-buffer反復洗滌2次，最后用5 mL P-buffer重懸后稀釋涂布于再生培養基平皿上。

2.2 菌株篩選

參照文獻[12]方法挑取培養基上生長的單菌落傳至中管斜面培養基上，28 ℃培養。將生長好的斜面挖塊1.5 cm2接種于裝有40 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃，220 r/min震蕩培養24 h，然后以10%的接種量接入40 mL/250 mL的發酵培養基中，28 ℃，220 r/min震蕩培養7 d，檢測他克莫司產量。在搖瓶中進行初篩和復試。

2.3 培養基優化

2.3.1 單因素實驗優化

采用篩選出的高產菌株對發酵配方中的主要碳源和氮源進行單因素分析，考察培養基中各因素糊精（6.0%、8.0%、10.0%）、葡萄糖（1.5%、2.0%、2.5%）、固體玉米漿（0.1%、0.2%、0.3%）、酵母粉（2.0%、2.5%、3.0%）不同含量對他克莫司發酵產量的影響。

2.3.2 響應面設計

對有顯著影響的3個單因素（糊精、酵母粉、葡萄糖）按照Design-Expert 12 Perfect軟件中的 Box-Behnken Design生成的試驗設計表進行試驗。

3 結果與分析

3.1 基因組重排選育他克莫司高產菌株

3.1.1 原生質體制備

放線菌的原生質體制備一般選用溶菌酶，其通過破壞細胞壁使菌體溶解，不同種屬的放線菌所需的最適酶解濃度和反應時間也不同。本實驗分別選用1.5、2、2.5、3.5和5 g/L的濃度對筑波鏈霉菌進行酶解30 min。由圖1可見，隨著酶解濃度的增加，原生質體形成數也逐漸增加，而過高的酶濃度會影響原生質體的再生，當酶解濃度為3.5 g/L時，再生率達30.11%，再生菌落最多。當酶濃度為3.5 g/L時，隨著酶解時間的延長，細胞壁被破壞程度增加，釋放的原生質體也不斷增多，但酶解達到一定時間后，殘存的溶菌酶又會影響原生質體的再生率，如圖2。當酶解40 min時，原生質體再生數量最高。

3.1.2 原生質體UV處理

原生質體由于缺少細胞壁，對紫外照射的敏感度增加，更容易產生突變，因此選用紫外對原生質體進行誘變及親本的滅活處理。以未經照射的再生菌落數為對照，計算原生質體的死亡率。由圖2可見，隨著紫外處理時間的延長，筑波鏈霉菌原生質體死亡率逐漸增加，當紫外照射時間超過40 s后死亡率接近100%。因此，筑波鏈霉菌原生質體紫外處理最佳時間為40 s。

3.1.3 基因組重排篩選融合子

將2株筑波鏈霉菌FK18-1-56和FK18-1-106按照“2.1”方法進行原生質體的制備、滅活，獲得的原生質體溶液等體積混合后進行融合和再生，此過程作為第一輪基因組重排。對再生培養基上長出的菌落，按照“2.2”方法進行初篩和復試，第一輪篩選出他克莫司產量顯著提高的3株菌株，搖瓶發酵產量分別達到1254、1286和1267 mg/L。以第一輪篩選出的3株菌為出發菌株，分別制備原生質體經紫外處理后等體積混合，再次進行原生質體融合和再生，進行第二輪基因組重排。此過程重復進行4次，最終獲得3株高產菌株FK22-35、FK22-71、FK22-89，由圖3可見，他克莫司搖瓶發酵產量分別達到1543、1578、1589 mg/L，較出發菌株提高34.5%、37.6%和38.5%。

3.2 高產菌株性狀考察

3.2.1 高產菌株特征

對基因組重排最終獲得的高產菌株進行菌落形態和顯微形態觀察。結果發現，各菌株在固體培養基上菌落均為白色，產生灰白色的孢子，培養結束后培養基呈暗紅色，相差不大。由圖4可見，菌株FK22-71發酵培養基中顯微形態觀察菌絲基本都呈菌絲球狀，且菌絲球松散、橢圓狀，染色劑著色淺。筑波鏈霉菌經遞推式基因組重排技術育種后，形狀發生了變化。

他克莫司是胞內產物，發酵結束后需要有機溶劑對菌絲進行浸泡處理。本研究采用無水乙醇對高產菌株FK22-71進行浸泡處理，由圖5可見，菌株FK22-71在浸泡液中呈顆粒狀，沉降較好，在實際生產中有利于后續過濾操作。因此，選取高產菌株FK22-71進行后續實驗。

3.2.2 高產菌株穩定性考察

菌株FK22-71進行斜面傳代實驗，連續傳代5次通過搖瓶實驗檢測他克莫司產量。由表1結果可見，以第一代斜面搖瓶發酵產量為100%，第二代至第五代斜面發酵產量波動范圍不超過5%，說明菌株FK22-71傳代穩定性良好，具備工業化生產穩定傳代的能力，可以用于發酵生產。

3.3 發酵配方優化

3.3.1 單因素分析

從現有配方中挑選主要碳源和氮源四個因素進行單因素分析，分別設置低、中、高3個濃度，考察對他克莫司發酵的影響。由圖6結果可見，在不同濃度的固體玉米漿時，他克莫司搖瓶發酵產量波動范圍不超過10%，說明固體玉米漿影響較小。而不同濃度的糊精、酵母粉、葡萄糖時，他克莫司發酵產量波動范圍分別為33.4%、20.9%和18.9%。

3.3.2 響應面優化

根據單因素實驗結果，選取對菌株FK22-71發酵產量影響較大的糊精、酵母粉、葡萄糖進行試驗設計，考察各因素之間的交互作用，按照軟件Design-Expert 12 Perfect 中的 Box-Behnken Design生成的試驗設計表進行試驗，實驗編碼水平和設計見表2～3。

經軟件擬合，糊精、酵母粉和葡萄糖3個因素對他克莫司產量影響的方差分析方程如下：

他克莫司搖瓶發酵產量=1145.4+21.25A-346.125B+126.125C+ 8.5A×B+292A×C-13.75B×C-275.075A?-386.825B?- 164.325C?。

如表4方差分析表中模型的F值為14.628，P＜0.05，說明模型顯著，失擬項P=0.0672＞0.05，不顯著，說明模型可靠。模型的決定系數R2=0.9493，校正決定系數R2Adj=0.8842，這表明模型可以解釋 94.93%響應值的變化；模型測量信噪比Adeq Precision=9.6192＞4，表示信號充足，比較可信。

模型中一次項糊精P值不顯著，但二次項顯著，且糊精和葡萄糖的互作項P值顯著，說明糊精和其他因素存在交互作用。由圖7可見，響應曲面圖均是開口向下的凸面，說明響應值發酵產量在各因素下存在最優解；交叉項AC等高線圖呈橢圓形，說明糊精和葡萄糖之間交互作用顯著，交叉項AB和BC等高線圖接近圓形，說明糊精和葡萄糖、酵母粉和葡萄糖之間交互作用不明顯，等高線圖的趨勢與方差分析表中的P值結果一致。根據軟件預測優化所得結果為：糊精89.2 g/L，酵母粉22.8 g/L，葡萄糖24.0 g/L，

最優解的產量預測值為1281 mg/L。

3.4 優化配方驗證

高產菌株FK22-71采用優化后的發酵培養基配方，在50 L發酵罐進行驗證。將培養24 h后的種子液以5%的接種量接種至10 L種子培養基中，28 ℃，攪拌轉速375 r/min，通氣比1：1 vvm，培養24 h后以10%的接種量接種至35 L發酵培養基中，發酵過程中開攪拌、通氣比1：1.5 vvm通入無菌空氣，控制溶解氧≥25%，48 h開始按照發酵液總體積0.3%的量流加前體異亮氨酸，7 d后檢測他克莫司產量，連續進罐3批，平均放罐產量為1684 mg/L，較出發菌株提高68.9%，結果見表5。

4 結論

僅通過誘變育種的方法得到的突變菌株提高量有限，而基因組重排技術（genome shuffling，GS）可將誘變育種技術同細胞融合技術相互結合，以多個不同突變體為對象，對微生物細胞的基因組隨機重排，從而使微生物細胞正突變頻率及正突變速度均可以大幅提高，快速高效地選育出目的性狀正突變的菌株[8]。篩選融合子需要親本具有標記或者進行原生質體滅活。本研究的出發菌株是經ARTP誘變產生，ARTP等離子體束含有豐富的活性粒子，非常低的UV強度，因此采用紫外處理對親本進行滅活。

本研究獲得的高產菌株FK22-71菌落形態較出發菌株變化不大，但液體培養形態和發酵液狀態均發生了變化。他克莫司是胞內產物，發酵結束后菌絲經浸泡，呈顆粒狀，易沉淀，使過濾工序更順暢，也可以減少雜蛋白的影響。菌株液體培養顯微形態發生變化，對培養基微環境的代謝利用也會隨之發生變化，因此，本研究對發酵培養基進行響應面優化，獲得了適合高產菌株的配方。該高產菌株采用優化后的發酵配方在50 L實驗罐進行驗證，發酵產量平均達

1684 mg/L，較出發菌株提高68.9%。這表明通過選育高產菌株、優化發酵配方可以提高他克莫司產量，對工業化過程降低生產成本具有重要意義。

參 考 文 獻

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