特色原料發酵酒主要揮發性香氣成分及其感官風味研究

劉秋云，劉睿童，唐東亞，王平剛，程玉鑫，李苑麟，黃永光*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025；2.貴州花酒有限公司，貴州鎮遠 557700）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）屬薔薇科薔薇屬植物[1]，是我國新興的特色果樹資源，廣泛分布于貴州、四川、湖北等省，其中由以貴州省資源最為豐富[2]。2020 年，刺梨在貴州省經濟栽培面積超13 萬hm2，鮮果產量超10 萬t[3]，重點分布在六盤水市、遵義市、畢節市及黔南布依族苗族自治州4 個市州[4]。由于刺梨中的維生素C含量極高（達2585 mg/100 g鮮果）且含超氧化物歧化酶（SOD），被廣泛應用于食品加工產業，如刺梨汁[5]、刺梨茶[6]、刺梨酒[7]、罐頭[8]和糕點[9]等，其中刺梨酒一直是研發熱點[10]。

果酒是以水果或果汁為原料，主要經破碎、榨汁、發酵、調配等工藝制作而成的酒精濃度在7%～18%的飲料酒，根據其釀造工藝的不同大致可分成發酵果酒、蒸餾果酒、配制果酒和起泡果酒4 種[11]。目前對果酒的研究主要集中于保健功能和香氣成分，郭志君等[12]采用離子色譜法和頂空固相微萃取-氣相色譜質譜法對進行蘋果酸-乳酸發酵后的刺梨酒的香氣揮發性物質進行檢測，共檢測到114種揮發性物質，主要包括酯類48種、醇類26種、酸類13 種、烷烴類10 種；洪鎏等[13]通過頂空固相微萃取（Headspace Solid Phase Microextraction,HSSPME）、氣相色譜-嗅聞技術、GC-MS 對櫻桃酒的特征香氣成分進行探究，共測得特征香氣化合物共31 種，其中反-3-己烯酸乙酯、丙醇、苯乙醇、己酸、辛酸、糠醛和苯甲醛是櫻桃酒的主要香氣成分；張新華等[14]通過GC-MS 對玫瑰花酒陳釀過程中的香氣成分變化進行研究，發現其苯乙醇、總酸及總酯的含量不斷增加，而苯甲醇、雜醇油的含量則呈下降趨勢；劉志剛等[15]通過HS-SPME 結合GC-MS 對8 種獼猴桃果酒的香氣成分進行分析，發現不同品種的獼猴桃果酒的揮發性成分均在80 種以上，且酯類物質的種類和含量均占比最多，此外醇類和酸類的種類較多。

在食品及其他一些行業，香氣感知的質量和強度是影響消費者體驗的決定性部分。GC-MS 是探究酒精飲料中香氣成分最常用的檢測技術，通常用于測定低含量揮發性化合物，結合了氣相色譜具有高效分離能力和質譜對未知物具有獨特鑒定能力的優點[16]。基于此，本研究選用以刺梨酒為代表的5 種貴州特色發酵酒，通過GC-MS 和感官評價法分析比較了其主要揮發性香氣成分和感官特性的差異，期望為果酒質量提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 酒樣

選取市面所售的貴州特色發酵酒共5 種，具體信息詳見表1。

表1 5種貴州特色發酵酒信息

1.1.2 試劑與儀器

試劑及耗材：氯化鈉（分析純）、二氯甲烷（色譜級），均購于上海國藥集團；超純水，由超純水機（Labonova Direct Pro S）制備，購于Think-Lab Corporation 公司。

儀器設備：分析天平（FA1104），購于上海舜宇恒平科學儀器有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀（Chromatec Crystal 9000 系），購于Fuli 公司；渦旋振蕩器（Traveller），購于北京華銳捷科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

參考馬宇等[17]方法，吸取10 mL 稀釋至酒精度10%vol 的酒樣，加入3 g 左右NaCl 至飽和，加入20 μL 混合內標仲辛醇（終濃度9.15 mg/L）、乙酸戊酯（終濃度8.95 mg/L）、2-乙基丁酸（終濃度9.39 mg/L），2 mL 二氯甲烷于渦旋振蕩器中振蕩3 min，靜置分層后取有機相。

1.2.2 GC-MS色譜條件

GC條件：采用DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m)；檢測器和進樣口溫度為250 ℃，不分流進樣，氦氣作為載氣，流量2 mL/min，色譜柱初溫40 ℃維持2 min，以3 ℃/min 升溫到110 ℃，再以3.5 ℃/min升溫至250 ℃，并保持該溫度15 min。

MS 條件：電子電離源；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：230 ℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z 25～550。

1.2.3 揮發性成分的定性和定量

本研究中有標樣的化合物用外標法定量，無標樣的化合物采用內標法定量。標準曲線法定量:以體積分數為10%的乙醇溶液為溶劑配制待測物標準液，并進行梯度稀釋，分析條件與酒樣分析條件相同。采用選擇離子法計算各化合物的峰面積，以化合物與內標物的峰面積比為橫坐標，質量濃度之比為縱坐標，建立相關物質標準曲線，進行全定量分析。根據樣品總離子流圖，結合NIST17a.L 譜庫對不同樣本中主要揮發性香氣化合物進行鑒定，篩選匹配度達到85%以上的化合物作為主要香氣成分，同時排除柱流失等干擾性化合物。以仲辛醇、乙酸戊酯、2-乙基丁酸為內標作為峰面積參照，采用內標法半定量計算其余組分含量。

1.2.4 感官分析

根據文獻[18]方法，選取10 人對5 個發酵酒樣品從香氣和滋味兩個維度進行感官評價。品評人員包括研究白酒風味的6 名研究生和具有10 年以上品酒經驗的4 名老師（國家一級品酒師、貴州省白酒評委）。經培訓練習后，感官品評人員對5 款發酵酒樣品的香氣，如發酵香（酒香）、草本/生青、花香、甜香、果香、醋香等香氣和酸味、甜味、苦味、澀味、協調度、澄清度等感官強度進行評定，評定分數范圍為0～5，0 分為未聞/感知到，5 分為聞/感知到的香氣最強。取20 mL 酒樣于白酒品評專用杯中，于室溫下（20 ℃±1 ℃）進行感官評定，取所得分值結果的平均值做感官評價雷達圖。

1.2.5 數據及圖像處理

采用Microsoft Excel 2021 對數據進行分析；采用在線平臺聯川生物云平臺（https://www.omicstudio.cn/）進行偏最小二乘（PLS-DA）分析；采用Origin 2023（學生版）和在線平臺Chiplot（https://www.chiplot.online/）進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同樣品主要揮發性香氣成分分析

在5 個樣品中檢測到主要揮發性香氣物質共計121 種，包括醇類27 種、酯類35 種、酸類23 種、醛酮類14 種及其他類22 種，其中有6 種化合物是5 個樣品所共有的，分別是異丁醇、異戊醇、苯甲醇、苯丙醇、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯。研究結果表明，5個發酵酒樣品中醇類、酸類和酯類的種類差異較大，揮發性成分的總和也存在差異；數量上，酯類、醇類和酸類是揮發性化合物中含量最多的三個類群。

經鑒定的主要揮發性香氣化合物中，酯類成分的種類最多。在蒸餾酒中酯類物質的含量與比例會影響酒體風格[19]，在果酒中，酯類物質是果酒重要的香氣成分，賦予果酒濃郁的花香和果香[20]。乳酸乙酯呈現水果和甜香香氣，在5 個樣品中均以較高濃度存在，且以水果為原料的發酵酒普遍高于以食用花卉為原料的發酵酒：YT(191.42 mg/L±110.96 mg/L)＞CL(101.21 mg/L±58.35 mg/L)＞BXG(85.97 mg/L±20.53 mg/L)＞MGBG(20.02 mg/L±6.87 mg/L)＞MGGH(8.32 mg/L±0.55 mg/L)。琥珀酸單乙酯呈現微弱的水果香氣等令人愉快的氣味，在以水果為原料的發酵酒中表現出了較高的含量，在BXG 樣品中相對含量占比為52.27 %、YT 樣品中為48.22%、CL 樣品中為31.97%，關于琥珀酸單乙酯的香氣描述尚未見報道。丁二酸二乙酯呈現煮熟的蘋果和依蘭香氣和熱帶水果味道，丁二酸二乙酯的含量是區分同年份葡萄酒是否經蘋果酸-乳酸發酵的差異化合物之一[21]，本次在5 款發酵酒樣品均檢測到，其含量濃度排序為BXG(91.98 mg/L±27.30 mg/L)＞YT(16.07 mg/L±2.91 mg/L)＞MGBG(4.45 mg/L±1.19 mg/L)＞CL(3.93 mg/L±0.73 mg/L)＞MGGH(2.02 mg/L±1.19 mg/L)。

在飲料酒工業中，一般碳原子數大于2 的醇稱為高級醇（higher alcohols），如異丁醇、異戊醇、苯乙醇等，其對酒精飲料的質量影響巨大，影響的積極性或消極性取決于高級醇的濃度、香氣強度以及酒精飲料的類型[22]。酵母產生的高級醇可以通過碳源的Harris 途徑合成，也可以通過Ehrlich 途徑降解支鏈氨基酸合成[23]。苯乙醇呈現玫瑰花的香氣，在5 款發酵酒樣品中均有檢出，按含量占比排序為MGBG(48.96 %)＞BXG(23.25 %)＞MGGH(18.28 %)＞CL(17.30 %)＞YT(7.09 %)。異戊醇表現為杏仁、清香和刺激味，在MGGH和BXG樣品中含量占比最高，分別為69.66%和67.74%。(+)-α-松油醇具有紫丁香氣味，是兩款以玫瑰花為原料釀造酒特有的主要揮發性香氣化合物，且(+)-α-松油醇含量在MGBG樣品中(0.42 mg/L±0.15 mg/L)略高于MGGH樣品(0.66 mg/L±0.26 mg/L)。

圖1 5個發酵酒樣品主要揮發性風味物質種類圖

圖2 5個發酵酒樣品主要揮發性風味物質含量圖

有機酸類物質也是經由糖類或氨基酸通過酵母代謝產生的，其既是飲料酒中的呈味化合物，同時對果酒的香氣也起著重要的補充和修飾作用[20]。除MGGH 和CL 樣品外，酸類物質在其余幾款釀造酒樣品中含量甚微。在MGGH和CL樣品的酸類物質中，山梨酸的含量最高且相似，分別為142.80 mg/L±16.92 mg/L 和145.27 mg/L±27.04 mg/L。山梨酸屬于有機酸類防腐劑，具有較好的抗菌性能，通過抑制微生物體內的脫氫酶系統達到抑制微生物的生長作用。乙酸常呈現尖銳的、刺激性的酸味，在MGGH 和MGBG 樣品中含量相似，分別為30.56 mg/L±10.68 mg/L 和35.05 mg/L±10.95 mg/L。苯甲酸呈現油脂香，在YT 樣品中的酸類物質中含量最高，為46.11 mg/L±10.15 mg/L。

2.2 感官評價分析

10 名品評員對8 個樣品的6 個香氣指標和6 個滋味指標進行感官評價并打分，感官評價結果如圖3所示。

圖3 5個發酵酒樣品香氣與滋味感官評價雷達圖

在香氣方面，MGGH 和MGBG 樣品以花香為主，輔以甜香和果香，這與苯乙醇的高含量有關。以水果為原料的發酵酒的香氣層次較食用花卉發酵酒更為豐富，這與水果本身特有的香氣相關，果實本身的香氣成分是形成果酒典型風味的最重要來源[25]。

在滋味方面，MGGH 和MGBG 樣品表現相似，這與兩個樣品發酵用原料相同有關；BXG 與CL 樣品表現相似，推測這與百香果及刺梨酸度和甜度均較大的特點相關[26-27]；YT 樣品在澀味方面表現突出，這是由于氨基酸、有機酸、酚類化合物是櫻桃酒中最重要的不揮發化合物，其對櫻桃酒的酸度、苦味、收斂性（澀味）及澄清度均有重要作用[28]。

2.3 偏最小二乘法分析

從圖4A 可看出，CL、MGBG、MGGH、YT 組樣品分別分布在第一象限、第二象限、第四象限，BXG組樣品分布在原點附近，5 款樣品在PC1 和PC2 兩個方向上均有較好的區分。且同種原料發酵酒的平行實驗樣品聚集在一起，R2為0.7725，說明實驗穩定性較好。有19 種物質的VIP＞1，可以作為區分這5 種發酵酒的主要差異性揮發性香氣化合物，分別為異丁醇、3-己烯-1-醇、(+)-α-松油醇、正己醇、3-甲硫基丙醇、糠醇、琥珀酸單乙酯、煙酸乙酯、富馬酸單乙酯、4-羥基丁酸、山梨酸、苯乙酸、苯甲酸、蘋果酸、糠酸、2H-吡喃-2,6-二酮、3-羥基-2-丁酮、苯酚和2,4-二叔丁基酚。

圖4 基于主要風味物質的PLS-DA得分圖（A）和模型檢驗圖（B）

3 結論

本研究針對5 種貴州特色資源為原料釀制而成的5 款貴州特色發酵酒樣品的主要香氣成分進行研究，共檢測到主要揮發性香氣物質共計121種，包括醇類27 種、酯類35 種、酸類23 種、醛酮類14 種及其他類22 種，其中丁醇、異戊醇、苯甲醇、苯丙醇、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯為5 個樣品所共有。在含量上5 個樣品的主要揮發性香氣化合物均主要由酯類、醇類化合物構成，其次是酸類化合物。琥珀酸單乙酯（呈微弱的水果香氣）在以水果為原料的發酵酒中均有較高的含量，其中BXG 組占比52.27 %、YT 組占比48，22 %、CL 組占比31.97 %。異戊醇（杏仁、清香和刺激味）在MGGH和BXG 樣品中的含量分別高達69.66 % 和67.74 %。(+)-α-松油醇具有紫丁香氣味，是兩款以玫瑰花為原料釀造酒特有的主要揮發性香氣化合物。在感官評價方面，5 個樣品中YT 組在澀味方面的表現較為突出；水果原料發酵酒的香氣層次更為豐富。通過PLS-DA 的變量投影重要度分析確定了能夠區分19 種不同原料發酵酒的主要特征標志物，分別為異丁醇、3-己烯-1-醇、(+)-α-松油醇、正己醇、3-甲硫基丙醇、糠醇、琥珀酸單乙酯、煙酸乙酯、富馬酸單乙酯、4-羥基丁酸、山梨酸、苯乙酸、苯甲酸、蘋果酸、糠酸、2H-吡喃-2,6-二酮、3-羥基-2-丁酮、苯酚和2,4-二叔丁基酚。

表2 5種發酵酒主要差異性揮發性香氣化合物VIP值得分表