溫度脅迫下濃香型白酒酒醅理化性質、有機酸和揮發性風味物質的變化研究

蔣永春，雷學俊，鄭 佳，，3，覃鳳陽，張建敏，彭志云，趙 東，，3*

(1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644005；2.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000；3.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000)

濃香型白酒是中國一種傳統的白酒類型，也是中國白酒的一個重要品類。它以其獨特的風味和濃郁的香氣而聞名于世，主要產地是四川、貴州、湖南等地。其主要原料是高粱，采用以小麥制成的大曲為糖化生香劑，通過續糟配料、混蒸混燒、泥窖固態發酵的方式釀造而成。濃香型白酒具有獨特的香氣和風格特點，其香氣主要來源于酒中產生的各類風味物質，例如酯類、醇類、酮類等化合物[1]。濃香型白酒發酵過程中會產生一系列復雜的生化反應，發酵溫度、水分、酸度等條件會對發酵產生影響。有研究表明，溫度是影響發酵的主要因素之一[2-3]，會對白酒產量與質量、微生物種類與數量與香氣成分產生影響。羅冰和張鑫通過研究發現，溫度會影響白酒質量[2，4]；張超[5]通過調節發酵過程中升溫和降溫的速率發現，溫度會影響發酵過程中各類微生物的變化；陳丙友[6]發現酒醅溫度變化會對清香型白酒酒醅微生物群落生長和代謝產生影響；杜連起[7]通過研究入窖條件與濃香型白酒己酸乙酯的生成量發現，溫度對白酒香味物質形成有著重要影響。由此可見，研究發酵溫度對濃香型白酒的生產有著重要意義，本試驗通過研究溫度對白酒酒醅發酵理化性質、有機酸和揮發性風味物質的影響，以期為濃香型白酒釀造提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：酒醅樣品由五糧液股份有限公司提供，為入窖酒醅。

試劑及耗材：丙三醇、硫酸銅、葡萄糖、次甲基藍、鹽酸、氫氧化鈉、基準苯二甲酸氫鉀、鹽酸、丙三醇等，均為市售分析純。

儀器設備：電子天平、酒度計、電熱鼓風干燥箱、AVC-4D1 垂直流超凈工作臺、生化培養箱（BPC-250F），上海一恒科學儀器有限公司；萬分之一分析天平（AE200）、色譜儀（Agilent 8890），美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗方案設計（圖1）

圖1 實驗方案

將從車間取回的入窖酒醅裝入已經消毒的塑料罐，每罐裝1.7 kg 酒醅，并分為三組放入恒溫培養箱,按以下方案進行發酵。

第一組：恒溫培養箱起始溫度設置為15 ℃，每天升溫1 ℃，20 d 后升溫至35 ℃，取樣為第一階段；隨后在35 ℃下穩定7 d，取樣為第二階段；再每天降溫1 ℃，3 d 后降溫至32 ℃發酵結束，取樣為第三階段。

第二組：恒溫培養箱起始溫度設置為20 ℃，每天升溫1 ℃，15 d 后升溫至35 ℃，取樣為第一階段；隨后在35 ℃下穩定7 d，取樣為第二階段；再每天降溫1 ℃，3 d 后降溫至32 ℃發酵結束，取樣為第三階段。

第三組：恒溫培養箱起始溫度設置為25 ℃，每天升溫1 ℃，10 d 后升溫至35 ℃，取樣為第一階段；隨后在35 ℃下穩定7 d，取樣為第二階段；再每天降溫1 ℃，3 d 后降溫至32 ℃發酵結束，取樣為第三階段。

每個階段取三個平行樣品進行后續分析。

1.2.2 理化性質測定

1.2.2.1 水分的檢測[8]

稱取10 g 均勻酒醅放入烘干至恒重的坩堝，105～110 ℃烘3 h，取出放入干燥器冷卻30 min，稱量，記為w1。含水量計算公式：f=(10-w1)／10×l00%。

1.2.2.2 酸度的檢測[8]

稱取均勻酒醅20 g 放入250 mL 燒杯中，加入200 mL 水攪勻，室溫浸泡30 min，前15 min 勤攪拌，后15 min 靜置。取20 mL 上清液于250 mL 三角瓶，加入25 mL 水，酚酞指示劑2 滴，以0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色為其終點，平行試驗滴定允許誤差不得超過0.1 mL。

1.2.2.3 淀粉的檢測[8]

①水解：稱取試樣10 g 于250 mL 三角瓶中，加入1∶4 鹽酸溶液，輕輕搖動三角瓶，在瓶口裝上回流管，于電爐上回流水解30 min，取出，迅速冷卻，并用20 %氫氧化鈉溶液中和至微酸性，用脫脂棉過濾，濾液定容至250 mL。

②定糖：用斐林試劑滴定糖液，平行試驗滴定允許誤差不超過0.1 mL。

1.2.2.4 殘糖的測定[8]

吸取5 mL 已測酸度的酒醅液于三角瓶中，用斐林試劑滴定，平行試驗滴定允許誤差不超過0.1 mL，同時做平行空白試驗。

1.2.2.5 酒精度的測定

稱取酒醅100 g，加入10 %的乙醇200 mL，蒸餾出100 mL的酒樣，測定酒精度。

1.2.3 有機酸測定

1.2.3.1 糟醅中有機酸的提取

稱取酒醅樣品10 g，加入100 mL 30 %的乙醇溶液，置于搖床150 r/min搖30 min，隨后靜置過夜，然后用0.45 μm濾膜過濾，制成有機酸提取液。

1.2.3.2 有機酸等微量成分的測定

色譜條件：Venusil ASB C18色譜柱（4.6×250 mm×5 μm）；流動相：0.12% H3PO4溶液，0.2 μm 濾膜過濾，流動相流速1 mL/min；檢測波長214 nm，柱溫箱30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.3.3 揮發性風味物質檢測

稱取酒醅100 g，加入10 %的乙醇200 mL，蒸餾出100 mL 的酒樣，運用GC-MS 對酒醅中的重要有機酸及醇酯進行分析。

1.2.4 數據處理與分析

使用origin 2021軟件作折線圖和PCA圖。

2 結果與分析

2.1 溫度脅迫下不同起始溫度酒醅理化性質變化規律

2.1.1 發酵過程中酒醅理化性質隨時間的變化規律

不同起始溫度下酒醅理化性質隨時間的變化規律如圖2所示。

圖2 不同起始溫度下理化性質變化規律

水分在發酵過程中總體呈現先上升后緩慢下降的趨勢，起始溫度15 ℃和25 ℃水分均在發酵第一階段達到最大值，分別為60.73%和60.35%。發酵第一階段水分均快速上升，說明發酵第一階段淀粉快速下降產生酒精，因此酒醅水分快速增加，發酵第三階段由于進入酯化期，水分下降，此結果與前人研究結果一致[9]。酸度總體呈現上升趨勢，發酵結束后達到最大值。發酵第一階段酸度緩慢上升，說明此時酵母菌生長代謝旺盛抑制了細菌生長，因此酸度上升緩慢；發酵第二階段開始，酒醅內細菌開始生長繁殖，因此酸度快速上升。pH 值總體呈現先上升后下降的趨勢。淀粉呈現持續下降的趨勢，發酵第一階段快速下降，因此發酵第一階段水分、酒精度快速上升，此結果與前人的研究結果一致[10]。殘糖除起始溫度15 ℃的酒醅呈現先下降后上升的趨勢外，均呈現持續下降的趨勢。酒精度發酵第一階段快速增長，第二階段平穩，第三階段下降。發酵剛開始酒醅內氧氣含量豐富，益于酵母菌生長繁殖，此時酒精度迅速上升并達到最高值，隨后進入生酸期，產生的酒精與消耗的酒精基本持平，酒精度基本持平，最后進入酯化期，部分酒精用于酯化反應，因此酒精度下降。此結果與前人研究結果一致[11]。

發酵結束后，起始溫度15 ℃下殘糖、殘淀均最高，分別為1.55%、13.07%，酸度最低，為3.34°；起始溫度20 ℃下水分和酒精度含量最高，分別為60.1 %、6.83 %vol；起始溫度25 ℃下酸度最高，為3.68 °，pH 值、殘糖、殘淀、酒精度均最低，分別為3.41 °、1.27 %、10.98 %、6.49 %vol。起始溫度15 ℃、20 ℃、25 ℃淀粉利用率分別為4.48 %、5.61 %、6.57 %，酒精度增加量分別為4.93 %vol、4.96%vol、4.63%vol，可知起始溫度15 ℃下淀粉利用率最高。

2.2 溫度脅迫下酒醅有機酸含量變化

有機酸是濃香型白酒的重要呈味物質，乳酸、乙酸、丁酸、己酸在有機酸中占比最高，其總和占有機酸總含量的90 %以上，被稱之為四大酸[12]。乳酸、乙酸、丁酸、己酸分別是乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的前體物質[13-14]。乳酸、乙酸、丁酸、己酸是影響白酒酸度的主要因素。不同起始溫度下酒醅有機酸隨時間的變化規律如圖3所示。

圖3 不同起始溫度下有機酸變化規律

乳酸在濃香型白酒酒醅酸類物質中含量最高，適量的乳酸可以抑制雜菌生長，調節酸度；過量的乳酸會造成淀粉糖化率低，酒醅殘糖高，出酒率低[15]。乳酸可以溶解其他香氣成分，具有定香作用，酒中乳酸和乳酸乙酯含量過高會降低酒的放香，使酒體香氣淡雅。因此生產過程中應降低乳酸在酒中的含量[16]。發酵過程中乳酸含量在發酵第一階段下降，在發酵二階段、三階段呈上升趨勢，這可能是因為發酵第一階段窖內氧氣充足，微生物生長繁殖快，酒醅內能源物質供應不足，乳酸作為反應物被消耗，因此乳酸下降，發酵第二階段、三階段酒醅內細菌含量增多，產生大量乳酸，因此乳酸呈現持續上升趨勢。此結果與前人研究結果一致[12]。

乙酸是白酒四大酸之一，其主要由醋桿菌生成，具有刺鼻的醋香味，揮發性很強。在白酒呈味有機酸中地位僅次于己酸，乙酸含量高會抑制微生物生長，因此在白酒生產中應將乙酸的含量控制在較低水平[17]。乙酸含量在發酵第一階段緩慢上升，發酵二階段、三階段快速上升。發酵第一階段酒醅內氧氣和營養物質充足，足夠醋酸菌生長代謝，醋酸菌作為優勢菌種產生乙酸，部分酵母菌在無氧呼吸的情況下生成酒精的同時伴隨著乙酸的生成，因此乙酸含量上升。此結果與前人研究結果一致[12]。

丁酸是濃香型白酒中重要的不揮發性有機酸，適量的丁酸使濃香型白酒帶有微甜的窖香味，有助于白酒呈味助香；過量的丁酸會使白酒窖泥臭明顯，降低白酒品質[18]。丁酸含量在發酵第一階段呈上升趨勢，發酵二階段、三階段除起始溫度15 ℃的酒醅丁酸呈上升趨勢，起始溫度20 ℃、25 ℃酒醅丁酸均緩慢下降。發酵進入產酸期后，窖內呈厭氧環境，丁酸菌、異性乳酸菌生長旺盛，這些細菌利用酒醅中的還原糖、乙醇和乙酸等物質生成丁酸，發酵后期由于部分丁酸酯化生成丁酸乙酯，因此丁酸含量下降[15]。

己酸作為己酸乙酯的前體物質，同時也是白酒中一種重要的呈香呈味物質。發酵過程中己酸呈先下降后上升的趨勢，均在第一階段下降到最低值，在第三階段達到最高值。

起始溫度15 ℃發酵結束后，酒醅丁酸含量最高，為246.41 mg/L，乳酸、乙酸、己酸含量最低，分別為5250.74 mg/L、294.90 mg/L、29.09 mg/L。起始溫度20 ℃發酵結束后有機酸含量均處于起始溫度15 ℃和20 ℃之間。起始溫度25 ℃發酵結束后，酒醅乳酸、乙酸、己酸含量最高，分別為5958.57 mg/L、323.71 mg/L、33.88 mg/L，丁酸最低，為233.95 mg/L。發酵結束后，起始溫度越高，乳酸含量越高，可能是因為入窖溫度高不利于酵母菌充分發酵，導致其快速衰亡，細菌在整個發酵進程中占優勢，因此乳酸含量高[12]。

2.3 溫度脅迫下酒醅酯類物質含量變化

酯類物質是白酒中一類重要的風味成分，它們組成了白酒的各種香型，其絕對含量占濃香型白酒風味組分第一。不同起始溫度下酒醅酯類物質隨時間的變化規律如圖4所示。

圖4 不同起始溫度下酯類物質變化規律

乳酸乙酯香氣稍弱、微甜，是濃香型白酒重要的呈味物質。發酵過程中乳酸乙酯呈不斷上升的趨勢，發酵結束后達到最大值，此結果與周新虎研究結果一致[19]。乙酸乙酯主要呈現水果香和甜香，香氣稍弱、微甜,是濃香型白酒重要的呈味物質。乙酸乙酯在發酵過程中呈不斷上升的趨勢，發酵結束后達到最大值。己酸乙酯是判定濃香型白優劣的重要因素，有菠蘿的香味和辛辣的味道。己酸乙酯除起始溫度為25 ℃的酒醅呈先下降后上升的趨勢外，起始溫度15 ℃和25 ℃的酒醅己酸乙酯都呈上升趨勢，均在發酵結束后達到最大值。

發酵結束時，起始溫度15 ℃下己酸乙酯生成量最大，為0.84 mg/100 mL，乳酸乙酯、乙酸乙酯生成量最小，分別為36.25 mg/100 mL、7.80 mg/100 mL；起始溫度20 ℃下乙酸乙酯生成量最大，為8.27 mg/100 mL；起始溫度25 ℃下乳酸乙酯生成量最大，為49.23 mg/100 mL，己酸乙酯生成量最小，為0.7 mg/100 mL。由結果可知，起始溫度15 ℃下，乙酸乙酯生成量最低，己酸乙酯生成量最高，符合濃香型白酒“增己降乳”的行業標準。

2.4 溫度脅迫下酒醅醇類物質含量變化

醇類化合物是酒醅中占比最高的一類風味物質，具有沸點低、易揮發、口感刺激的特點。異戊醇、正丙醇、異丁醇和正丁醇是白酒的主要高級醇，適宜濃度的高級醇對白酒風味有重要作用，濃度過高會有異味感[20-21]。不同起始溫度下酒醅醇類物質隨時間的變化規律如圖5所示。

圖5 不同起始溫度下醇類物質變化規律

發酵過程中甲醇含量呈持續上升的趨勢。正丙醇呈先上升再平穩再上升的趨勢。正丁醇是白酒中的高級醇，口感苦，含量過高會導致酒體味辣苦澀[22]，除起始溫度15 ℃的呈先上升再下降再上升的趨勢外，其余入窖溫度下酒醅正丁醇含量皆呈上升趨勢。異丁醇除起始溫度15 ℃呈持續上升的趨勢外，其余皆呈先上升再平穩最后上升的趨勢；異戊醇除起始溫度15 ℃呈現先上升再下降的趨勢外，其余起始溫度發酵下皆呈先上升再下降再上升的趨勢。

發酵結束后，起始溫度15 ℃下，正丙醇、異戊醇生成量最大，分別為3.49 mg/100 mL、1.10 mg/100 mL，甲醇生成量最小，為1.05 mg/100 mL；起始溫度20 ℃下，異戊醇生成量最大，為3.49 mg/100 mL，正丙醇、正丁醇、異丁醇生成量最低，分別為1.04 mg/100 mL、0.31 mg/100 mL、0.77 mg/100 mL；起始溫度25 ℃下，甲醇、正丁醇、異丁醇生成量最大，分別為1.18 mg/100 mL、0.42 mg/100 mL、0.8mg/100 mL，異戊醇生成量最低，為3.33 mg/100 mL。

2.5 理化、有機酸及揮發性風味主成分分析

不同起始溫度發酵下，理化、有機酸及風味主成分分析如圖6所示。

圖6 理化性質、有機酸、風味物質PCA圖

如圖6 所示，第1 主成分PC1 和第2 主成分PC2可以解釋90.4%的原變量信息，3 種發酵溫度不同發酵時間的酒醅可以在PCA 雙標圖的PCA 1 上明顯區分。不同發酵階段下的酒醅樣品能明顯分開，因此發酵階段對酒醅有著重要影響。起始溫度15 ℃的酒醅與pH 值、丁酸、正丁醇、甲醇、己酸呈正相關；起始溫度20 ℃的酒醅與pH 值、己酸、正丁醇、甲醇呈正相關；起始溫度25 ℃的酒醅與pH 值、乙酸、己酸乙酯呈正相關。

3 結論

本研究通過設置不同的起始溫度對濃香型酒醅發酵的理化性質、有機酸和主要風味物質的生成開展研究，結果表明不同入窖起始溫度對酒醅發酵有明顯影響。其中，起始溫度為15 ℃的實驗組出窖糟醅結果為最優，其淀粉利用率最高，乙酸乙酯生成量最低，己酸乙酯生成量最高。

本研究進一步明確了入窖溫度對濃香型白酒酒醅的影響，為濃香型白酒釀造工藝的優化提供了一定的理論指導和技術支撐。