醬香型白酒中2,3-丁二酮氣相色譜檢測方法研究

彭禹熙，樊雙喜，張 婭，李細芬，尹學(xué)忠，王國江，楊禮紅，侯玉祥，盧 君*，李長文

（1.貴州國臺酒業(yè)集團股份有限公司，貴州仁懷 564501；2.貴州國臺酒業(yè)集團研究院，天津 300410）

2,3-丁二酮（2,3-butanedione，C4H6O2）又稱雙乙酰，稀溶液呈現(xiàn)出奶油、酸奶的氣味。適量的2,3-丁二酮對白酒具有重要的風(fēng)味作用，有助于進口噴香，增強香味感知，但當(dāng)酒體中2,3-丁二酮含量失調(diào)時，會使酒體在感官上呈現(xiàn)出“餿飯味”“發(fā)悶”的感受，顯著影響白酒品質(zhì)[1-5]。因此，迫切需要建立一套快速、方便、準確定量檢測白酒中2,3-丁二酮的方法。

目前食品中的2,3-丁二酮的檢測方法主要包括紫外分光光度法[6-7]、熒光分光光度法[8]、高效液相色譜法[9-10]以及氣相色譜法等[5，11，12，14]。其中，分光光度法是最常用的方法，如GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中規(guī)定采用鄰苯二胺比色法測定啤酒中2,3-丁二酮的含量，然而，該方法不能排除結(jié)構(gòu)類似產(chǎn)物的測定干擾，會使檢測結(jié)果偏高。液相色譜法測定2,3-丁二酮需要進行化學(xué)衍生，過程費時費力，會造成結(jié)果誤差[13]。氣相色譜法主要包括直接進樣-氣相色譜法（direct injection-gas chromatography-flame ion detector,DI-GC-FID）、頂空進樣氣相色譜法（headspace sampling-gas chromatographyflame ion detector,HS-GC-FID）和固相微萃取結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜法（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GCMS）。MACCIOLA 等[11]建立了氣相色譜法（GC）測定乳制品中2,3-丁二酮的新方法，該方法只需丙酮作為溶劑，樣品的制備簡單、快速、節(jié)省成本。TIAN 等[12]建立了一種基于HS-GC-FID 快速定量分析啤酒中2,3-丁二酮含量的方法，該方法具有良好的準確性和精密度。王莉等[5]采用靜態(tài)頂空與氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）相結(jié)合建立了一種定量分析白酒中2,3-丁二酮的方法，該方法實現(xiàn)了對不同香型白酒中2,3-丁二酮的定量分析。CHEN 等[14]基于SPME 與GC-MS 技術(shù)，建立了定量測定黃油和空氣樣品中的雙乙酰的方法，該方法操作簡單，結(jié)果準確可靠。以上方法采用HS 或SPME 作為樣品前處理方式，樣品之間的氣液平衡可能會受到基質(zhì)成分的影響，影響測定結(jié)果的重復(fù)性和回收率。如不選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標物作為對照，采用HS 或SPME 測定2,3-丁二酮的結(jié)果也可能不夠準確[15]。此外，直接進樣相對于HS、SPME 而言，無需進行揮發(fā)性成分的提取和濃縮，大大減少了物質(zhì)提取過程中的損耗，同時對比MS 檢測器，F(xiàn)ID 能夠滿足白酒樣品直接進樣的需求[16]。

本研究采用直接進樣結(jié)合GC 技術(shù)，通過優(yōu)化檢測方法條件，研究建立了GC 外標法定量分析檢測醬香型白酒中2,3-丁二酮的方法，為醬香型白酒質(zhì)量控制提供了檢測技術(shù)及方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：33 款醬香型白酒成品酒，分別編號為J1—J33，市售。

試劑及耗材：2,3-丁二酮（色譜級，＞99%），麥克林；乙醇（色譜級），科密歐化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：Agilent 8890 氣相色譜儀，Agilent；ME204T 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Gen Pure xCAD Plus 純水機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；0.22 μ m有機濾膜，比克曼生物科技有限公司；1 mL 一次性注射器，康城醫(yī)療器械。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備

（1）53%vol 乙醇溶液：量取265 mL 乙醇（色譜級）加二純水定容于500 ml 容量瓶中，搖勻，即得53%vol乙醇溶液。

（2）2,3-丁二酮儲備液：精確稱取2,3-丁二酮標準品23.50 mg 于100 mL 容量瓶中，用53%vol 乙醇溶液定容，得到濃度為235 mg/L 2,3-丁二酮儲備液。

（3）2,3-丁二酮工作液：用移液管精確移取2,3-丁二酮儲備液0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用53%乙醇溶液定容，混合均勻，配制成不同梯度2,3-丁二酮工作液，各濃度分別為7.05 mg/L、11.75 mg/L、23.50 mg/L、35.25 mg/L、47.00 mg/L、70.50 mg/L、94.00 mg/L、117.50 mg/L。

1.2.2 樣品前處理

采用直接進樣的前處理方法，樣品需過膜去除雜質(zhì)。取酒樣搖勻后放置磨口玻璃瓶內(nèi)待用，取適量樣品過0.22 μ m 濾膜后置于進樣小瓶，供GC分析。

1.2.3 儀器檢測條件

GC條件：采用HP-FFAP色譜柱（50 m×0.2 mm，0.33 μ m，型號：19091F-105）；進樣口溫度為200 ℃，檢測器溫度220 ℃；程序升溫為初始柱溫40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至90 ℃，再以15 ℃/min 升溫至230 ℃，保持20 min；載氣為高純氮氣（純度＞99.999 %），流量控制方式為恒流模式，流量1 mL/min；進樣方式為分流進樣，分流比1∶20；進樣量為1 μ L。

1.2.4 定性定量方法

利用2,3-丁二酮標準品的保留時間，對目標物進行定性。將不同濃度的2,3-丁二酮工作液按照上述樣品處理方法處理后進行儀器分析，以2,3-丁二酮峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化

2.1.1 柱流量

柱流量會影響樣品譜圖色譜峰形狀，流速過小會導(dǎo)致譜圖呈現(xiàn)矮寬峰，流速過大則會造成色譜柱中固定相物質(zhì)的流出，本實驗研究對比了柱流量分別為0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min 時氣相色譜對2,3-丁二酮的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱流量對其分離效果影響不大。因此，結(jié)合色譜柱常用柱流速，最后選擇1 mL/min為本研究柱流量檢測條件。

2.1.2 分流比

分流比較大，會造成溶劑拖尾對目標峰產(chǎn)生遮掩；分流比較小，會造成目標峰峰型較差或者被基線噪聲掩蓋[17]。本實驗對比了分離比分別為1∶10、1∶20、1∶30 時2,3-丁二酮的分離效果，當(dāng)分流比為1∶10時，會出現(xiàn)目標峰2,3-丁二酮與左邊干擾峰乙酸丙酯共流出的現(xiàn)象，2,3-丁二酮不能得到很好的分離；提高分流比到1∶20 時，目標峰2,3-丁二酮可以與乙酸丙酯得到很好的分離且峰型良好（詳見圖1）；當(dāng)分流比為1∶30 時，雖然目標峰2,3-丁二酮可以得到分離但其峰型較差。因此，選擇分流比1∶20作為最佳分流比。

圖1 白酒氣相色譜圖（分流比1∶20）

2.1.3 升溫程序

升溫程序影響分配系數(shù)、分配比，從而影響分離度和分析時間。升溫速度慢，峰型扁平，分析時間長；升溫速度快，分配系數(shù)小，不能達到有效分離[18]。本實驗選擇優(yōu)化40 ℃升至90 ℃這段升溫速率，對比了升溫速率分別為2 ℃/min、3 ℃/min、4 ℃/min時氣相色譜對2,3-丁二酮的分離效果。當(dāng)升溫速率分別為2 ℃/min、3 ℃/min 時，2,3-丁二酮都可以得到很好的分離效果；當(dāng)升溫速率為4 ℃/min 時，部分實驗樣品會出現(xiàn)2,3-丁二酮與左邊干擾峰乙酸丙酯共流出的現(xiàn)象。綜合考慮時間和分離效果，優(yōu)化后柱溫箱的升溫程序為：初始柱溫箱40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至90 ℃，再以15 ℃/min升溫至230 ℃，保持20 min。

2.2 方法的線性范圍、檢出限與定量限

通過優(yōu)化檢測條件（柱流量、柱溫箱升溫速率和分流比），得到最終的GC 檢測方法為：柱流速為1 mL/min，分流比1∶20，柱溫箱的升溫程序為：初始柱溫箱40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至90 ℃，再以15 ℃/min升溫至230 ℃，保持20 min。后續(xù)將展開直接進樣-氣相色譜檢測2,3-丁二酮的方法學(xué)驗證。

按1.2.1 進行2,3-丁二酮工作液的配制，各吸取1 μ L 注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，以目標峰的質(zhì)量濃度為橫坐標（x），以目標峰的峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸，繪制標準曲線。2,3-丁二酮的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限，詳見表1。由表1 可知，該方法在質(zhì)量濃度7.05～117.50 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.998。利用2,3-丁二酮工作液的最低濃度水平為依據(jù)，3 倍信噪比計算檢出限，10 倍信噪比計算定量限，得到2,3-丁二酮的檢出限為0.67 mg/L（S/N=3），定量限為2.24 mg/L（S/N=10），結(jié)果表明，該方法能夠滿足醬香型白酒中2,3-丁二酮的定量檢測需求。

表1 方法線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量限

2.3 精密度試驗與加標回收率試驗

2.3.1 精密度試驗

精密度試驗可分為分析重復(fù)性測試、進樣重復(fù)性測試以及中間精密度測試。

分析重復(fù)性測試：對同一待測樣品，按照1.2.2要求進行前處理，同時制備6 份測試溶液，上機檢測，計算分析目標物含量的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

進樣重復(fù)性測試：取任一制備好的樣品，按照1.2.2要求進行樣品前處理，重復(fù)進樣6 次，上機檢測，計算分析目標物含量的RSD值。

中間精密度測試：按照上述前處理方法和儀器條件，隨機取一份供試樣品，分別由同一人員在不同天數(shù)進行測定，計算不同天數(shù)檢測目標物含量的RSD值。

精密度試驗具體結(jié)果，詳見表2。由表2 可以看出，2,3-丁二酮分析重復(fù)性測試結(jié)果RSD 為0.85 %，進樣重復(fù)性測試結(jié)果RSD 為0.41 %，中間精密度測試結(jié)果RSD 為1.44 %，表明該方法精密度良好，符合分析精密度要求。

表2 方法精密度

2.3.2 加標回收率試驗

取同一批白酒樣品適量，按照上述前處理方法和儀器分析條件進行分析。根據(jù)該樣品中2,3-丁二酮的實際濃度，按50 %、100 %、150 %三個水平分別添加，每個水平平行六份，以標準曲線法計算供試樣品及加標樣品中2,3-丁二酮的含量，考察該方法的加標回收率。加標回收率=（加標樣品平均測得量-樣品平均測得量）/加標量*100%。2,3-丁二酮的加標回收率測試結(jié)果，如表3 所示。由表3可知，2,3-丁二酮的加標回收率在82.77 %～112.61 %之間，均在允許回收率限度范圍內(nèi)，結(jié)果表明該方法回收率良好，符合分析加標回收率要求。

表3 方法加標回收率

2.4 酒樣檢測

利用本實驗所建立的分析方法，對市售33 款醬香型白酒樣品的2,3-丁二酮含量進行檢測，每個樣品平行測定2 次，計算平均值，檢測結(jié)果見表4。由表4 可知，32 款白酒樣品中均檢測出了2,3-丁二酮，含量在3.97～29.49 mg/L 之間，32 款醬香白酒樣品的2,3-丁二酮含量的平均值為9.99 mg/L，標準偏差為5.42 mg/L。2,3-丁二酮在醬香白酒中普遍存在且含量差異明顯，醬香白酒的風(fēng)味協(xié)調(diào)與穩(wěn)定性是由各種風(fēng)味物質(zhì)共同作用的結(jié)果，某種成分含量過高或過低都會影響醬香型白酒的香氣協(xié)調(diào)，感官上會造成不愉悅的感受。

表4 33款醬香型白酒中2,3-丁二酮測定結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗建立了直接進樣-氣相色譜（DI-GC）外標法定量分析醬香白酒中2,3-丁二酮的方法。通過對方法參數(shù)（柱流速、分流比和柱溫箱升溫程序）進行優(yōu)化及確認，驗證及考察了該方法的線性范圍、檢出限、定量限、精密度和準確性。結(jié)果表明，該方法在質(zhì)量濃度7.05～117.50 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998）；檢出限為0.67 mg/L（S/N=3），定量限為2.24 mg/L（S/N=10）；加標回收率范圍在82.77 %～112.61 %之間；日內(nèi)與日間RSD 分別為0.41 %和1.44 %。對市售33 款醬香白酒中的2,3-丁二酮含量進行測定，結(jié)果表明，32 款醬香白酒中含量范圍在3.97～29.49 mg/L 之間，平均值為9.99 mg/L，標準偏差SD=5.43 mg/L。2,3-丁二酮在醬香型白酒中普遍存在，不同醬香白酒樣品中2,3-丁二酮的含量表現(xiàn)出一定的差異。2,3-丁二酮是醬香白酒風(fēng)味相關(guān)的重要指標，其含量過高或過低會造成白酒感官風(fēng)味的不協(xié)調(diào)，影響酒體品質(zhì)。本研究建立的基于GC-FID 檢測醬香型白酒中2,3-丁二酮的測定方法，具有操作簡單、準確性高、重復(fù)性好等特點，可以廣泛推廣應(yīng)用于醬香型白酒中2,3-丁二酮含量測定。