乳酸菌發酵對花生衣抗糖化緩解皮膚衰老功能的影響

摘要：糖化會導致晚期糖基化終末產物（AGEs）形成并在體內積累，引起皮膚衰老。體外實驗表明花生衣具有抗糖化作用，乳酸菌發酵能否提升花生衣的抗糖能力尚不清楚。本研究采用體外AGEs 生成模型和丙酮醛損傷皮膚成纖維細胞（HSF）模型，從10 株乳酸菌中篩出植物乳植桿菌CCFM1354，該菌具有很好的抑制AGEs 生成能力，能緩解HSF 細胞的糖化損傷。高糖細胞模型實驗發現，CCFM1354 發酵花生衣能顯著降低HSF 細胞中BAX 和NFKB1 的 mRNA 的相對表達量；D?半乳糖誘導的衰老小鼠實驗結果表明，口服植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣能顯著降低小鼠血清AGEs 含量，提高小鼠皮膚彈性，改善小鼠皮膚萎縮狀況，且效果優于未發酵花生衣。由此可見，植物乳植桿菌CCFM1354 發酵能顯著提升花生衣的抗糖化功能，緩解皮膚衰老。

關鍵詞：抗糖化；晚期糖基化終末產物（AGEs）；乳酸菌發酵；花生衣；皮膚衰老

中圖分類號：Q 815 文獻標志碼：A

糖化反應是還原糖的羰基和蛋白質、核酸等生物大分子的游離氨基，在非酶促的合適條件下，經過一系列復雜的分子重排反應生成穩定、不可逆的共價聚合物的過程，最終生成晚期糖基化終末產物（ advanced glycation end products，AGEs）[1]。AGEs 隨著外源攝入或隨著年齡增長內源產生后會在血液和多組織中積累，它通過與特異性受體（receptor for AGEs， RAGE）結合激活下游級聯反應，以及與蛋白質交聯破壞其正常功能特性這兩大主要途徑引發后續的糖化損傷[2]。許多器官病變已被報道受AGEs 的影響[3]，皮膚作為人體最大的器官直觀反映糖化損傷下皮膚衰老加劇的問題：糖化反應使AGEs 在皮膚積累、促進皮膚細胞凋亡、激活RAGE 并加強與AGEs 的結合、刺激NF-κB 等下游級聯通路造成皮膚炎癥、氧化損傷加劇，并且刺激基質金屬蛋白酶活性上調、減少皮膚成纖維細胞正常的膠原蛋白合成功能，造成皮膚狀態惡化[4]，這些證據引起人們對基于抗糖化的對抗皮膚衰老研究有了更多的關注。現階段被提出的常見抗糖化途徑包括抑制AGEs 的生成、阻斷AGE-RAGE 結合、破壞蛋白質交聯和抑制AGE-RAGE 結合后的信號激活[2]。

花生是世界范圍內重要的油料植物，不僅富有營養，而且分布廣泛。相關數據顯示，全球每年的花生總產量約2 900 萬t[5]。花生油在加工過程中會產生花生衣、花生殼、花生粕等大量副產品，花生衣受到較多的關注。在食品及藥劑配方中應用的花生酚類（主要是原花青素）被證實具有較好的抗氧化、抗糖尿病、抗癌、抗菌等功效[6]。現有報道顯示，紅花生的花生衣中最主要的酚類化合物是兒茶素和阿魏酸，約占總酚類化合物的85%；一些被認為是有效抗氧化劑的酚酸（包括香豆酸和綠原酸）和類黃酮（包括表兒茶素、白藜蘆醇），在紅花生的花生衣中也被檢測到[7]。近年來，報道指出花生衣具有抗糖化的功能，能減弱早期糖化加合物（阿瑪多里產物）的形成以及捕獲反應性二羰基化合物，抑制體外AGEs 的生成[5]。此外，也有報道稱花生的酚類物質能抑制AGEs 的前體物質丙酮醛（MGO）所誘導的人臍靜脈內皮細胞的細胞死亡[8]。

乳酸菌是一類常見的有益細菌，其培養過程中產生的胞外酶破壞植物細胞細胞壁，常促進植物提取物或中藥有效成分的酮類、酚類等物質含量增加[9]。應用乳酸菌發酵天然植物類提取物，使其原有生物活性提升已成為食品和化妝品原料研究的一大新趨勢。一些研究證實，植物乳植桿菌能通過發酵果蔬汁提升其原有的抗氧化功能特性[10-11]；也有報道稱植物乳植桿菌Kinko-SU4 發酵花生牛奶能提升產品在體外牛血清蛋白?果糖（BSA-Fru）體系中的AGEs 生成抑制率[12]。針對花生衣中主要酚類成分兒茶素，有糞菌發酵實驗顯示，發酵后含3'，4'?二羥基化結構的代謝物增多，從而提高了發酵兒茶素的抗氧化活性。因此，通過微生物發酵，打開花生衣中兒茶素的C 環并增加3'，4'?二羥基化結構的代謝物，有可能會提升花生衣的抗糖化功能[13]。此外，也有研究發現，乳酸菌會利用阿魏酰酯酶、單寧酶、脫羧酶、β?葡萄糖苷酶、β?半乳糖苷酶等將共軛酚類物質釋放或轉化為游離的可同化形式[14]。因此，花生衣中其他酚酸和類黃酮物質也有可能在乳酸菌發酵過程中發生代謝與轉化。目前，體外發酵對花生衣各方面抗糖化能力影響的研究并不完善，口服花生衣或花生衣發酵液的體內抗糖化效果仍缺乏報道。此外，口服抗糖化物質能否緩解糖損傷造成的皮膚衰老這一問題也亟待回答。

本研究使用乳酸菌發酵花生衣提取物，利用體外BSA-Fru 模型和人源皮膚成纖維細胞（ HSF）糖損傷模型篩選出能發酵提升花生衣抗糖化效果的乳酸菌，并體外評估該乳酸菌的花生衣發酵液在皮膚層面的抗糖化能力。本研究利用動物實驗，評價花生衣及其發酵物在體內的抗糖化抗衰老能力，主要關注它在緩解皮膚衰老方面的效果，希望為花生衣及其發酵產物在功能性食品或化妝品原料領域的開發應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

植物乳植桿菌CCFM1354、植物乳植桿菌FXJCJ22M3、植物乳植桿菌FSCDJY93L1、植物乳植桿菌FJLHD2M9、發酵乳桿菌FBJSY361、發酵乳桿菌JSWX3L1、副干酪乳酪桿菌DQHXNQ19M18、副干酪乳酪桿菌DQHXNQ38M3、鼠李糖乳桿菌FZJHZ14L3、鼠李糖乳桿菌FNMGHLBE18L5，均來自于江南大學食品微生物保藏中心（ CultureCollection of Food Microorganisms）（江蘇無錫）。

人源皮膚成纖維細胞（ human skin fibroblasts，HSF），購于中國科學院昆明細胞庫。雄性BABL/c小鼠（SPF 級，8 周齡）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

花生衣提取物， 陜西盛恒生物科技有限公司，批次號SH20220328；MTT 試劑，上海碧云天生物技術有限公司；二甲亞砜、果糖、PBS 磷酸鹽緩沖液速溶顆粒，國藥集團化學試劑有限公司；丙酮醛（MGO），北京普西唐生物科技有限公司；qPCR 相關引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、染料法熒光定量試劑盒，南京諾維贊生物科技股份有限公司；D?半乳糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；通用型組織固定液（中性），武漢賽維爾生物科技有限公司；牛血清蛋白（BSA）、小鼠晚期糖基化終末產物（AGEs）試劑盒、人源III 型膠原蛋白（Col III） 試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；脫毛膏，薇婷官方旗艦店。

隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；超凈工作臺，中科美菱低溫科技股份有限公司； 酶標儀， 美國Thermo 公司； 熒光定量PCR 儀， 美國Bio-Rad 公司； 皮膚彈性測試儀MPA580，德國Courage+Khazaka 公司；數字切片掃描儀，匈牙利3DHISTECH 公司。

1.2 乳酸菌的活化與菌液制備

將植物乳植桿菌CCFM1354、植物乳植桿菌FXJCJ22M3、植物乳植桿菌FSCDJY93L1、植物乳植桿菌FJLHD2M9、發酵乳桿菌FBJSY361、發酵乳桿菌JSWX3L1、副干酪乳酪桿菌DQHXNQ19M18、副干酪乳酪桿菌DQHXNQ38M3、鼠李糖乳桿菌FZJHZ14L3、鼠李糖乳桿菌FNMGHLBE18L5 于MRS 固體培養基劃線活化后，挑單菌落接種于液體MRS 培養基中，37 ℃ 培養，每培養24 h 以體積分數2% 的接種量傳代，活化2 代，得到乳酸菌菌液。

1.3 花生衣發酵液的制備

配制花生衣發酵培養基（記為Hsp）：5% 花生衣提取物、4 g/L 葡萄糖、5 g/L 酵母粉、4 g/L 碳酸鈣以去離子水混合，在115 ℃ 滅菌20 min。在花生衣發酵培養基中接入2×106 CFU/mL 的乳酸菌菌液，在37 ℃ 培養48 h，發酵終點離心取上清液得到菌株發酵花生衣上清液。

1.4 體外AGEs 抑制實驗

在文獻基礎上稍加修改制備牛血清蛋白?果糖（BSA-Fru）體系[15-17]，建立體外熒光AGEs 生成抑制的評估模型。用0.2 mol/L、pH 7.40 的磷酸緩沖液（PBS）溶解牛血清蛋白和D?果糖，使最終體系中BSA 濃度為10 mg/mL， Fru 濃度為0.5 mol/L，混合均勻的反應溶液體系過0.22 μm 水系濾膜得到反應液。空白調零組：4 mL 的PBS 溶液；空白對照組： 2 mL 的PBS 溶液與2 mL 反應液均勻混合；2 mL 反應液與2 mL 實驗待測樣品溶液。上述組別于37 ℃ 下避光孵化14 d，用酶標儀測定其在激發波長370 nm、發射波長440 nm 處的熒光強度，發射狹縫5 nm。

Hsp 由PBS 稀釋成100 μg/mL 的最終濃度并過0.22 μm 水系濾膜得花生衣待測樣品溶液。菌株發酵花生衣上清液由PBS 稀釋成100 μg/mL，過0.22 μm 水系濾膜后得實驗待測樣品。

AGEs 生成抑制率的計算公式如下：

R = [1-（F1 - F2）=（F3 - F2）]×100%

式中： F1為樣品組熒光值； F2為空白調零組熒光值； F3為空白對照組熒光值。

1.5 細胞抗糖化實驗

1.5.1 細胞培養和細胞毒性篩選

人源皮膚成纖維細胞（HSF）培養于DMEM 完全培養基中（胎牛血清和雙抗的體積分數分別為10% 和1%），在37 ℃、CO2 體積分數為5% 的恒溫培養箱培養，每隔2 d 以體積分數為0.25% 胰酶消化，并以1∶4 傳代。

MTT 法是測定細胞活力的常用方法，可評估藥物在細胞的最大安全劑量。當HSF 細胞生長到對數期時，以胰酶消化制備細胞懸液，計算細胞數使HSF 細胞以3 000 個/孔的最終密度接種在96 孔板中培養24 h。將Hsp 和不同菌株的花生衣發酵液分別過0.22 μm 水系濾膜后，用DMEM 基礎培養基（體積分數1% 雙抗，無胎牛血清）稀釋成不同濃度梯度（12.5～1 000 μg/mL），替換96 孔板中原本的培養基繼續培養24 h。每孔加入10 μLMTT 溶液（5 mg/mL），避光繼續培養4 h；終止培養時吸取孔內培養基，每孔加入100 μL 二甲亞砜（DMSO），用酶標儀在490 nm 處測試吸光度，得到OD490 [18]。

1.5.2 MGO 誘導的HSF 細胞活力損傷測定

以Park 等的方法為基礎[8]， 采用MGO 誘導HSF 細胞， 建立糖損傷模型。將HSF 細胞以3 000 個/孔的最終密度接種在96 孔板中培養24 h，之后分成不同組別進行操作。對照組：將培養液換成基礎培養基，過24 h 重復換一次液并繼續培養24 h。模型組： 將培養液換成基礎培養基，過24 h 去除培養基并用400 μM MGO 繼續培養24 h。實驗組：去除培養液，加入由基礎培養基稀釋的Hsp 或菌株發酵花生衣上清液（使各組花生衣提取物終濃度為100 μg/mL）培養24 h，再更換為含400 μM MGO 的基礎培養基培養24 h。各組培養終點以1.5.1 中的方法測試細胞活力，得到各實驗組對丙酮醛損傷的預防效果。

1.5.3 高糖培養下HSF 細胞的功能測定

a. HSF 細胞的高糖模型建立。

將Pang 等[19] 的方法稍加修改，建立HSF 細胞高糖模型。以葡萄糖含量為35 mmol/L 的DMEM完全培養基（ 記為HG） 為高糖培養基， 建立HSF 細胞高糖模型。將HSF 細胞以1×104 個/mL的濃度接種至六孔板中培養24 h，分成不同組別進行以下操作。對照組：除去原有培養液后，以完全培養基（葡萄糖含量為5.5 mmol/L）培養24 h，重復48 h。HG 組：以完全培養基正常換液培養24 h，再以高糖培養基培養24 h。實驗組：除去培養基后，加入由完全培養基稀釋的100 μg/mL 的Hsp 或100 μg/mL 的植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣上清液培養24 h，再以高糖培養基培養24 h。

b. HSF 細胞基因表達的測定。

培養終點收獲細胞，根據RNA 提取試劑盒操作說明，從HSF 中提取總RNA，并根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA 備用。用實時定量聚合酶鏈反應 （RT-qPCR） 確定HSF 細胞中DDOST、MMP9、BAX 和NFKB1 的mRNA 的表達。將準備好的cDNA 根據Liu 等[20] 描述的方法，使用熒光定量試劑盒在CFX96 系統（Bio-Rad）上進行實時熒光定量。基因序列在美國國家生物技術信息中心（NCBI）檢索，由生工生物工程（上海）股份有限公司設計引物，使用β-actin 作為內參基因。具體引物序列如表1 所示。

c. HSF 細胞III 型膠原蛋白含量的測定。

高糖模型培養結束，收集對照組、模型組、實驗組細胞培養液于無菌離心管中， 于4℃ 、3 000 r/min 離心20 min，保存上清液，用ELISA 試劑盒檢測其中III 型膠原蛋白含量。

1.6 動物抗糖化抗衰老實驗

1.6.1 動物實驗設計

將20 只實驗小鼠隨機分為對照組、模型組、花生衣發酵培養基組（ 記為Hsp） 、植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣上清液組（ 記為HCCFM1354），每組5 只。進鼠適應1 周后，除對照組外，其余小鼠每天皮下注射生理鹽水配置的D?半乳糖（500 mg/kg），造模6 周[21]。造模期間，Hsp 組小鼠每只每天分別灌胃80 mg/kg 花生衣發酵培養基，CCFM1354 組小鼠每只每天分別灌胃80 mg/kg 植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣上清液，灌胃量都為0.1 mL/20 g 小鼠；對照組和模型組的小鼠每天灌胃等體積的生理鹽水。實驗過程中，每周固定時間對所有小鼠的體重進行測量并記錄。最后一次干預造模24 h 后處死小鼠，立即取樣。動物實驗方案獲得江南大學實驗動物實驗倫理委員會批準（ 倫理編號： JN.No20230415b1430621[132]）。

1.6.2 小鼠皮膚彈性性能測定

造模6 周后，用脫毛膏脫去小鼠背部毛發，以皮膚彈性測試儀檢測每只小鼠背部皮膚彈性性能參數R2，測定時固定小鼠，確保儀器表面與待測皮膚始終保持垂直[22]。

1.6.3 小鼠血清糖化衰老標志物測定

采用眼眶靜脈叢采集小鼠血液，靜置1 h，以3 000 r/min 低溫離心15 min，取上清液分裝。采用ELISA 試劑盒測定血清中糖化標志物AGEs 含量。

1.6.4 小鼠皮膚組織病理觀察及分析

收獲約1 cm2 皮膚組織塊在10% 多聚甲醛溶液中固定48 h。將上述組織送武漢賽維爾生物科技有限公司進行Hamp;E 染色，使用數字切片掃描儀掃描切片，以Image J 軟件對切片結果中皮膚組織表皮厚度進行測量。

1.7 數據統計分析

采用GraphPad Prism 9.0.0 軟件進行作圖和對顯著性差異完成統計分析，實驗結果以平均值±標準差（Mean±SD）表示，組間比較使用單因素方差分析（ One-Way ANOVA） 。P lt; 0.05 記為*， P lt;0.01 記為**，P lt; 0.001 記為***，P lt; 0.000 1 記為****；“ns”表示無顯著差異。

2 結果與討論

2.1 能夠提升花生衣抗糖功能的乳酸菌篩選

2.1.1 不同菌株的花生衣發酵液抑制AGEs 生成能力檢測

如圖1 所示，在100 μg/mL 濃度下，Hsp 的熒光AGEs 生成抑制率為56.89%，與之前的抗糖化研究結果相符；由于前期研究已證實花生衣的體外抑制AGEs 生成能力與添加濃度成正相關[8]，為了凸顯發酵對花生衣抗糖化能力的提升，本研究選擇100 μg/mL 的低Hsp 添加濃度進行實驗。結果發現，不同菌株發酵液的AGEs 抑制率有差異變化，植物乳植桿菌CCFM1354 發酵Hsp 顯著提高其AGEs 生成抑制率， 達到76.74%（ Plt;0.000 1） ；植物乳植桿菌FSCDJY93L1 和副干酪乳酪桿菌DQHXNQ38M3 發酵后，AGEs 抑制率也分別顯著上升至65.81% 和64.05%（Plt;0.001 和P lt;0.01）。

2.1.2 不同菌株的花生衣發酵液對MGO 誘導的HSF 細胞活力的影響

a. Hsp 對HSF 細胞活力的影響。

HSF 細胞是皮膚真皮層重要的細胞。為確定合適的花生衣發酵液濃度，首先測試了不同濃度花生衣發酵培養基（ Hsp）對HSF 細胞活力的影響。

由圖2 可知，12.5～100 μg/mL 的Hsp 與HSF共孵育24 h 后均未見明顯的細胞毒性， 但當Hsp 濃度升高至500 μg/mL 后HSF 細胞活力明顯下降。因此，選定100 μg/mL 為后續Hsp 以及各組別花生衣發酵上清液的給藥濃度。在同類研究中，花生衣提取物對于RAW 264.7 細胞的最大濃度設置為150 μg/mL，與本實驗結果一致[23]。

b. 預防細胞丙酮醛損傷的能力。

丙酮醛（MGO）是種高活性的二羰基化合物，是AGEs 生成過程中常見的高反應中間體。MGO不僅會加劇細胞糖酵解過程中AGEs 生成、引發后續糖化損傷，也具有抑制與炎癥反應、細胞周期、細胞凋亡相關的基因的細胞毒性，常被用作糖化損傷相關的實驗造模劑[24]。

由圖3 可知，與對照組（100%）相比，模型組經過MGO 處理會造成細胞活力顯著下降至52.84%，證實MGO 造成細胞損傷。實驗組用100 μg/mL 的Hsp預處理后能使細胞活力提高到62.48%；100 μg/mL不同菌株的花生衣發酵上清液預防給藥后，細胞活力與出現不同程度的上調或下降，其中植物乳植桿菌CCFM1354 組的細胞活力顯著提高至76.07%（Plt;0.000 1），發酵乳桿菌JSWX3L1 組顯著提升至68.52%（Plt;0.05）。

與未發酵的花生衣相比，乳酸菌發酵花生衣可能有兩部分成分變化：第一種是花生衣中部分功效物質在乳酸菌作用下發生了轉化；第二種是在花生衣原有物質的基礎上增加了乳酸菌的某些代謝產物。這兩部分成分變化共同造成發酵花生衣在抑制AGEs 生成能力和預防細胞丙酮醛損傷能力上的變化。針對第一種可能性，乳酸菌發酵會產生不同的催化酶，如木聚糖酶、蛋白酶和單寧酶，可以解聚和溶解細胞壁結構骨架中的一些特定植物化學物質，導致發酵底物中一些特殊酚類物質的釋放或合成，增強底物的抗氧化能力。但具體酚類物質的增加及底物功效的增強與乳酸菌菌株密切相關[14]。針對第二種可能性，有研究發現不同滅活乳酸菌對脂多糖造成的角質形成細胞活力損傷的預防能力不同[25]，不同植物乳植桿菌菌株上清液的體外抗氧化能力不同[26]。因此，不同乳酸菌發酵會改變花生衣的原有抗糖化功能。綜合2.1.1 和2.1.2 的結果，植物乳植桿菌CCFM1354發酵提升花生衣抗糖功能的能力最顯著，既能提高體外AGEs 生成抑制率，也能緩解MGO 對HSF細胞造成的糖化損傷，提升花生衣體外抗糖化能力。

植物乳植桿菌在發酵提升抗糖化功能方面的作用被多次報道：植物乳植桿桿菌GKM3 發酵上清液可以通過捕獲糖化劑實現抑制蛋白質糖化[27]，植物乳桿菌Kinko-SU4 發酵花生乳也提升了花生乳的抗糖化特性[7]。而本研究篩選出的體外抗糖化功效最強的菌株也是植物乳植桿菌，與相近研究的結果具有一致性。因此，選擇植物乳植桿菌CCFM1354 的花生衣發酵上清液為研究對象，開展體外和體內的抗糖化功效評價。

2.2 植物乳植桿菌CCFM1354 發酵提升花生衣預防HSF 細胞糖化損傷的能力

HG 常被用來模擬糖尿病條件，該培養條件容易引起糖化反應并對細胞造成不利影響。研究表明，30 mM 葡萄糖處理不影響HSF 細胞的增殖活性，但能明顯上調細胞凋亡基因，誘發炎癥，造成細胞部分功能異常[19]。

2.2.1 花生衣發酵液對高糖培養下HSF 細胞基因表達的影響

HG 培養會加劇細胞炎癥并促進細胞凋亡，也會促進AGE-RAGE 結合，從而加劇糖化下游反應，同時會造成蛋白質異常水解。BAX 是動物細胞凋亡基因Bcl-2 家族一員，高表達會加劇細胞凋亡；NFKB1 能編碼蛋白質前體，參與NF-κB 復合物形成，使糖化下游級聯反應持續作用；DDOST是調控RAGE 競爭性受體AGER1 的基因，能通過增加DDOST 的表達減少AGE-RAGE 的結合；MMP9 是金屬蛋白水解酶家族一員，與HSF 的生理功能緊密相關。HG 培養下HSF 的基因表達水平結果如圖4 所示。

與對照組相比，模型組BAX mRNA 相對表達量顯著上升至2.390（Plt;0.000 1）（圖4（a）），與其他研究結果一致[28]；與模型組相比，Hsp 組中BAX表達顯著降低至1.410（ Plt;0.001） ， H-CCFM1354組BAX 表達量顯著降低至1.100（ Plt;0.000 1） 。HG 培養后，模型組NFKB1 mRNA 相對表達量顯著上升至1.680（Plt;0.000 1）（圖4（b））；與模型組相比，Hsp 和H-CCFM1354 都能顯著降低基因NFKB1相對表達量（ Plt;0.000 1） 。HG 培養后， 模型組DDOST mRNA 相對表達量由對照組1.200 降低至0.590 0（圖4（c）），Hsp 干預能使基因相對表達量提高至1.070，而H-CCFM1354 干預后基因相對表達量仍僅有0.570 0。HG 培養后，與對照組相比，模型組MMP9 mRNA 相對表達量顯著上升（Plt;0.01）；與模型組相比，Hsp 組能顯著（Plt;0.05）降低基因相對表達量至1.310（圖4（d）），而H-CCFM134 組的基因表達量只能降低為1.780，即發酵沒有明顯提升花生衣調控MMP9 基因表達異常的能力。

花生衣能調控由高糖誘導的細胞中BAX、NFKB1、DDOST 和MMP9 基因表達異常，但具體功能成分未見報道。乳酸菌可以發酵花生衣提取物，但其中的物質轉化尚未明確。益生菌可以通過抑制NF-κB 信號通路，顯著降低細胞凋亡蛋白BAX 的水平[29]，而BAX 基因和NFKB1 基因密切關聯，所以乳酸菌發酵花生衣對BAX 和NFKB1具有較好的調控效果。對于DDOST 基因，目前研究未發現其具體的上游調控機制，我們推測乳酸菌發酵改變了花生衣中原有的緩解DDOST 基因表達缺陷的有效成分，因此，并未提升花生衣調控DDOST 基因表達異常的能力。乳酸菌發酵花生衣依舊能降低高糖模型下HSF 細胞MMP9 基因的過表達，只是與發酵前比未得到顯著提升；在未發酵的花生衣中，白藜蘆醇是抑制MMP9 基因活性的潛在成分[30]，但白藜蘆醇在發酵過程中可能發生生物轉化，變成對MMP9 調控敏感性低的其他衍生形式， 導致發酵物改善MMP9 基因異常過表達的能力降低。綜上，盡管植物乳植桿菌CCFM1354 發酵未能全面提升Hsp 的抗糖化功能，但能明顯提升花生衣預防細胞高糖損傷下BAX 和NFKB1 基因表達異常的能力。

2.2.2 花生衣發酵液對高糖培養下HSF 細胞產III 型膠原蛋白能力的影響

III 型膠原蛋白是維持皮膚彈性的重要膠原蛋白，人體自然衰老過程中，III 型膠原蛋白的占比會逐漸減低。HSF 細胞可以分泌III 型膠原蛋白，對傷口愈合和維持皮膚組織正常強度和完整性有重要意義；HG 培養會加劇HSF 細胞中蛋白水解酶的表達，減少膠原蛋白合成。采用ELISA 試劑盒檢測細胞上清液中III 型膠原蛋白含量，結果如圖5 所示。與對照組相比，HG 模型組的III 型膠原蛋白含量顯著下降至31.85 ng/L（Plt;0.01）；Hsp干預后的III 型膠原蛋白含量顯著上升至36.56 ng/L（Plt;0.05），H-CCFM1354 干預后的III 型膠原蛋白含量顯著上升至40.05 ng/L（Plt;0.001）。表明植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣能提升Hsp 預防III 型膠原蛋白含量下降的能力。

2.3 植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣上清液對D?半乳糖致衰小鼠的影響

2.3.1 灌胃樣品對小鼠體重的影響

實驗期間小鼠體重變化如圖6 所示。在實驗期間，各組小鼠體重均呈現平穩增長，組間并未出現明顯差異，表明Hsp 及H-CCFM1354 灌胃樣品（未發酵花生衣上清液及其發酵上清液）對小鼠無明顯副作用。

2.3.2 灌胃樣品對血清糖化衰老標志物的影響

D?半乳糖致衰是種常見的模擬衰老模型，高劑量D?半乳糖受半乳糖氧化酶催化會刺激活性氧形成，在造成氧化應激、炎癥反應的同時也加劇機體糖化反應標志物AGEs 的生成，刺激后續糖化損傷發生。血清中AGEs 含量測定結果如圖7 所示。以D?半乳糖連續皮下注射造模后，模型組小鼠血清AGEs 含量較對照組260.2 ng/L 顯著提升至406.2 ng/L（Plt;0.01），與其他D?半乳糖誘導的衰老模型AGEs 變化趨勢相符[31]。與模型組相比，Hsp組血清AGEs 含量顯著降低至247.0 ng/L（Plt;0.01），H-CCFM1354 組顯著降低至208.4 ng/L（Plt;0.001）。由此可見，植物乳植桿菌CCFM1354 的發酵強化了花生衣抑制血清AGEs 積累的能力，具有更好地抑制后續機體糖化損傷的潛力。

2.3.3 灌胃樣品對小鼠皮膚彈性性能的影響

D?半乳糖造成的AGEs 積累會造成全身糖化損傷，在皮膚層面主要表現為促進皮膚細胞凋亡并影響其正常生理活性、破壞蛋白質結構、影響傷口愈合等，直觀反映為表皮變薄、皮膚結構松弛等衰老表象[4]。R2 值被認為是最接近皮膚彈性真實狀態的參數值，數值越大表明皮膚彈性越好。由圖8 可知，與對照組的皮膚彈性74.90% 相比，模型組的R2 顯著降低至53.70%（Plt;0.01）；與模型組相比，Hsp 能緩解R2 的降低，使其恢復至64.90%； H-CCFM1354 顯著恢復了皮膚彈性性能，使R2 值達到72.40%（Plt;0.05）。由此可見，植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣顯著提高了小鼠皮膚彈性，比未發酵花生衣有提升作用。

2.3.4 灌胃樣品對小鼠皮膚病理的影響

皮膚組織Hamp;E 染色結果如圖9（a） 所示。與對照組相比，模型組表皮嚴重萎縮、皮突明顯減少、炎性細胞大量增加，真皮內出現充血現象，并且彈性蛋白結構紊亂不清晰，與先前研究中造模出現的皮膚病理情況相吻合[32]。與對照組相比，Hsp 組和H-CCFM1354 組出現表皮萎縮、真皮內充血的情況有所緩解。此外，H-CCFM1354組較Hsp 組的炎性細胞含量明顯減少，彈性蛋白結構更完整清晰。以Image J 軟件對各組皮膚切片的表皮厚度進行測量，結果如圖9（b） 所示。與對照組相比，模型組表皮厚度顯著下降至12.40 μm（Plt;0.01）。與模型組相比，Hsp 組的表皮厚度提升至14.05 μm，H-CCFM1354組的表皮厚度顯著提升至17.00 μm（Plt;0.05）。由此可見，植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣可有效改善衰老小鼠的皮膚表皮萎縮，改善皮膚質構。

3 結 論

通過體外AGEs 反應體系、細胞糖損傷模型、D?半乳糖致衰小鼠模型，研究了乳酸菌發酵對花生衣抗糖化功能的影響，明確花生衣發酵液體內外抗糖化緩解皮膚衰老的關鍵機制。本研究得到的主要結論如下：

a. 利用體外AGEs 生成模型和HSF 細胞丙酮醛損傷模型，從10 株乳酸菌中篩選出1 株能夠提升花生衣體外抗糖化能力的植物乳植桿菌CCFM1354。

b. 構建HSF 細胞高糖模型， 植物乳植桿菌CCFM1354 發酵能提高花生衣的抑制BAX 和NFKB1 mRNA 過表達的能力、緩解高糖下HSF 細胞III 型膠原蛋白含量降低的能力，但植物乳植桿菌CCFM1354 發酵花生衣不能阻礙高糖培養下HSF 細胞的AGE-RAGE 結合，也不影響HSF 細胞中蛋白質水解相關的基因表達。

c. 與未發酵花生衣相比，口服植物乳植桿菌CCFM1354 的花生衣發酵液能有效降低D?半乳糖致衰小鼠血清中AGEs 的含量，緩解D?半乳糖致衰小鼠皮膚彈性降低，能更好地減輕D?半乳糖致衰小鼠皮膚病理情況。

綜上，本研究證實植物乳植桿菌CCFM1354發酵可以提升花生衣的抗糖化功能力，抗糖化特性在體內依然起效，填補了口服花生衣抗糖化的研究空白，也為花生衣及其發酵物作為化妝品或食品抗糖化功效原料提供數據支持和理論指導。