南瓜籽餅粕粉制備高含量蛋白肽的工藝優化分析

◎ 張良明，田 斌，蘇亞慶

（西安天一生物技術股份有限公司，陜西 西安 710000）

南瓜籽是成熟南瓜的種子，其成分具有抗糖尿病、抗癌、改善前列腺增生的效果。研究表明，南瓜籽蛋白肽具有很好的抗氧化活性[1-3]。南瓜籽蛋白是南瓜籽榨油后的副產物——南瓜籽餅粕，其含有豐富的蛋白質、氨基酸、多種維生素、微量元素，營養豐富。以南瓜籽餅粕為原料，利用酶法，可以將蛋白質降解為小分子多肽。在蛋白質的水解中，需要采用專門的蛋白酶分解蛋白質，以水解蛋白質分子的肽鏈，生成多肽和氨基酸，使其成為具有良好溶解性、乳化性和生物活性的小分子肽，從而改善蛋白質的功能特性，將其更廣泛地應用于普通食品和功能性食品中。通過有效控制蛋白質的水解程度，可以改善其乳化性能，更有利于氨基酸的吸收[4]。

基于此，本文通過正交實驗，優選了南瓜籽蛋白肽的傳統制備工藝。同時，通過膜分離技術對南瓜籽蛋白肽進行提純，旨在促進南瓜籽蛋白肽更好地實現工業化生產，產生更高的經濟效益。

1 材料與試劑

1.1 原材料與試劑

1.1.1 原材料

南瓜籽餅粕粉是西安天一生物技術股份有限公司自產的南瓜籽蛋白產品。以南瓜籽為原料，通過低溫壓榨，可得到南瓜籽油和南瓜籽蛋白餅粕；通過沖擊磨超微粉碎南瓜籽餅粕，可得到南瓜籽蛋白超微粉產品。

1.1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉三氯乙酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸標準滴定液、混合指示液、混合氨基酸標準溶液、檸檬酸緩沖溶液、pH 5.2的乙酸鋰溶液、茚三酮溶液等；堿性蛋白酶（東恒華道生物科技有限公司）；風味蛋白酶（山東隆科特生物）；堿性蛋白酶、復合蛋白酶[諾維信（中國）生物技術有限公司]。

1.2 儀器與設備

雷磁PHS-3C pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）、升降水油浴鍋RE-501（西安予輝儀器有限公司）、低速大容量離心機TDL-5-A（上海安亭科學儀器廠）、旋轉蒸發器RE-5210A 和RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）、SHZ-95B 型循環水式多用真空泵（鞏義市予華儀器設備有限公司）、DZF-6050 真空干燥箱（上海瑯軒實驗設備有限公司）、電熱鼓風干燥箱101-AB（天津市泰斯特儀器設備有限公司）、小型噴霧干燥機MAI-GZJ（上海那艾精密儀器有限公司）、K9840 自動凱氏定氮儀（山東海能儀器有限公司）、電子天平SQP[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

2 檢測依據和實驗方法

2.1 檢測依據

按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品蛋白質的測定》第一法：采用凱氏定氮法進行干燥后，測定南瓜籽蛋白肽粉粗蛋白；采用GB/T 22492—2008附錄B，測定南瓜籽蛋白肽粉肽含量。

2.2 南瓜籽多肽的制備工藝

南瓜籽蛋白超微粉→溶解預熱→調節pH →調節溫度→加酶水解→滅酶→離心→噴霧干燥或真空干燥→南瓜籽蛋白肽產品。

取100 g 南瓜籽蛋白粉，以一定比例加純化水于四口瓶中配制南瓜籽蛋白溶液，持續攪拌，并進行預熱處理30 min。將經過預熱處理后的南瓜籽蛋白溶液調節pH 至反應所需的條件，以底物蛋白量添加不同的蛋白酶，攪拌，恒溫水浴酶解，酶解結束后，升溫至85 ℃滅酶30 min，冷卻后放置4 ℃冰箱靜置12 h，離心，將上清液進行減壓濃縮，噴霧干燥或真空干燥，得到南瓜籽蛋白肽產品[5-10]。

2.2.1 多肽得率

多肽得率=（干燥產品中粗蛋白質含量/原料中粗蛋白質含量）×100%

2.2.2 蛋白酶的篩選

選用不同廠家不同型號的蛋白酶，分別對南瓜籽蛋白進行水解（蛋白酶添加量為1.2%），在每種酶的最適條件下進行實驗，分別測定南瓜籽蛋白的水解度、多肽得率，平均實驗3 次，取平均值，篩選出適合南瓜籽蛋白肽的蛋白酶種類。根據酶的說明書，與蛋白酶廠家技術人員溝通，確定不同蛋白酶的作用條件如表1 所示。

表1 不同蛋白酶的作用條件表

2.2.3 正交實驗

在單因素試驗的基礎上，結合生產成本考慮，選取加酶量、pH、加水倍量、酶解時間為考察因素，以南瓜籽蛋白肽得率為指標，優選南瓜籽蛋白肽酶解最佳工藝條件，并對優選出的最佳條件平行進行3 次實驗。

2.2.4 膜分離技術進行除雜，提純南瓜籽蛋白肽的含量采用優選的南瓜籽蛋白肽酶解條件制備蛋白肽水解液，水解液經離心機5 000 r·min-1離心，獲得小分子蛋白肽料液。將上述料液經陶瓷膜系統進行微濾，除掉懸浮物、菌體、大分子蛋白質，濾液澄清，將上述澄清濾液通過有機超濾膜系統進行分級純化，除掉大分子蛋白、色素等雜質，提高產品純度。接著，通過納濾膜系統進行納濾，脫除料液中的一價鹽，對產品進行濃縮，并將上述截留液經噴霧干燥，設置進料溫度160～190 ℃，塔內溫度85～95 ℃，水分控制≤6.0%，得到南瓜籽蛋白肽產品，測定粗蛋白含量和蛋白肽含量[11-12]。

3 結果與分析

3.1 南瓜籽蛋白正交實驗

設定溫度55 ℃，酶解8 h，選取加酶量（A）、溶液pH（B）、加水倍量（C）3 個因素3 個水平進行正交實驗，以蛋白肽得率為指標，實驗設計見下表2、直觀分析表見表3、效應曲線圖見圖1。

圖1 效應曲線圖

表2 南瓜籽蛋白肽正交實驗表

表3 正交實驗直觀分析表

通過正交實驗數據可以看出，加酶量是影響水解的關鍵因素，優選的蛋白肽水解條件為加酶量1.2%，pH=9，倍量16 倍，55 ℃水解8 h，之后進行滅酶，冷卻后離心處理，清液干燥得南瓜籽蛋白肽產品。

3.2 不同廠家蛋白酶篩選

采用不同廠家的蛋白酶，酶添加量1.2%，pH=9，加水（純化水）倍量12 倍，采用四口瓶水浴55 ℃攪拌水解8 h，對等量的南瓜籽蛋白進行酶解，不同廠家的蛋白酶得率見表4。

表4 不同廠家的蛋白酶選擇表

以南瓜籽蛋白肽得率為指標，可以看出B 廠家的* 專用蛋白酶和C 廠家的堿性蛋白酶得率偏高，E 廠家的復合蛋白酶得率最高。為了使南瓜籽多肽具有更好的得率和更好的生物活性，選擇B 廠家的* 專用蛋白酶和C 廠家的5# 堿性蛋白酶同A 廠家的風味蛋白酶進行復配，復配比例2 ∶1[13-15]。以優選的實驗條件重復3 次實驗進行驗證，同E 廠家的復合蛋白酶開展蛋白肽得率驗證實驗，多肽含量計算平均值，樣品粗蛋白含量和蛋白肽得率見表5。

表5 蛋白肽得率驗證實驗數據表

3.3 驗證實驗數據

由表5 可以看出，通過堿性蛋白酶和風味蛋白酶的復配，可以提高蛋白肽的得率，復配比例為2 ∶1，多肽得率為86.52%和86.18%，粗蛋白質含量均＞80%，多肽含量＞55%。

3.4 膜分離提純除雜實驗

根據上述優選的條件，通過復配的蛋白酶制備南瓜籽蛋白肽離心液，采用膜分離技術進行除雜，提純南瓜籽蛋白肽的含量，表6 為進料液pH、溫度及固形物濃度參數。

表6 進料液pH、溫度及固形物濃度參數表

采用陶瓷-MF 進行膜過濾，運行時間：185 min；溫度：43～46 ℃；壓力：0.25～0.3 MPa，平均通量：61.5 L·min-1，45 Hz 的情況下通量隨時間變化曲線，見圖2。

圖2 陶瓷膜膜過濾通量隨時間變化曲線圖

采用卷式超濾膜-1#UF 進行膜過濾，運行時間：135 min；溫度：33～36 ℃；壓力：0.65～0.85 MPa，過濾倍量：15 倍；平均通量：48 L·min-1，通量隨時間變化曲線見圖3。

圖3 卷式超濾膜膜過濾隨時間通量變化曲線圖

通過上述陶瓷膜過濾、卷式陶瓷膜除雜、卷式納濾膜濃縮后，蛋白肽固含量達17.8%，經噴霧干燥后檢測產品粗蛋白含量為92.7%，多肽含量為81.8%，工藝重復2次，設備運行良好，蛋白肽含量均＞80%（以干基計），粗蛋白含量＞90%（以干基計），陶瓷膜過濾后，經純化水頂洗收率達95%，卷式超濾膜收率93%以上。

4 結論及建議

本研究以低溫壓榨得到的南瓜籽餅粕，采用沖擊磨粉碎后的南瓜籽蛋白超微粉，通過正交實驗設計，得出南瓜籽蛋白制備南瓜籽蛋白肽的最佳制備工藝：加酶量1.2%，pH=9，倍量16 倍，溫度為55 ℃，酶解8 h，該條件下，多肽得率＞85%，粗蛋白質含量≥80%，多肽含量≥55%。同時，本研究進行膜分離除雜提純實驗，得到最終產品粗蛋白含量≥90%（以干基計），多肽含量≥80%（以干基計）。結果表明，該制備工藝穩定、可行，可以獲得一種簡便易行、綠色環保、成本可控、溶解性好的高含量南瓜籽蛋白肽產品。因此，本研究結果可以為南瓜籽蛋白肽膜過濾濃縮除雜純化方式提供數據支持。