超高效液相色譜-串聯質譜法研究木瓜中熊果酸和齊墩果酸含量

◎ 李海燕

（怒江州食品藥品檢驗所，云南 怒江 673199）

酸木瓜[Pseudocydonia sinensis(Thouin) C.K.Schneid.]別名鄒皮木瓜、木瓜海棠、木瓜等，是薔薇科木瓜屬灌木或小喬木[1]。酸木瓜中含較多果酸和單寧，吃起來酸、澀，解膩開胃，舒筋濕痹，在云南人的生活和菜品中多為常見。《詩經》記載：“投我以木瓜，報之以瓊琚。”古人將酸木瓜視為和“瓊琚”一般美好的事物。古籍中對酸木瓜的記載還有很多，關于木瓜泡酒早有記載。《齊民要術》記載，木瓜以苦酒鼓汁，密度之，可按酒食，密封藏百日，乃食之，甚益人。酸木瓜中的主要化學成分有熊果酸、齊墩果酸、蘋果酸、綠原酸、蘆丁、多糖、黃酮、鞣質等[2]。其中，熊果酸和齊墩果酸為五環三萜有機酸。據文獻報道，齊墩果酸可消炎抑菌，降低轉氨酶，促進肝細胞再生，防止肝硬化，強心、利尿、降血脂、降血糖，增強機體免疫力[3]。熊果酸是齊墩果酸的同分異構體，藥理研究證明，熊果酸具有抗癌、促進免疫、穩定心血管、增強毛細血管彈性等作用。由于木瓜具有藥用、食用、觀賞等多種用途，越來越受人們的喜愛。基于此，本文采用有機溶劑超聲提取，離心，旋轉濃縮，C18 柱凈化，正己烷洗脫，氮吹，旨在探索酸木瓜中熊果酸和齊墩果酸的提取工藝。實驗結果表明，這種方法快速，且樣品損失較小，克服了傳統方法的不足，具有高效、簡便、快速、重復性好的優點，可以為木瓜的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、材料

①儀器。島津液相色譜儀LC-30A，與三重四極桿質譜儀LCMS-8050 聯用系統；GH252 雙量程電子天平；超聲提取儀；艾本德離心機；旋轉蒸發儀；氮吹儀。②試劑。甲醇、正己烷、乙醇，均為色譜純；C18 固相萃取柱。③材料。熊果酸、齊墩果酸標準品（中國食品藥品檢定院）。

1.2 分析條件

液相色譜條件：XRODS-Ⅲ（2.0 mmI.D×75 mm，1.6 μm）；流動相：A－甲醇，B－純水；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL；質譜條件：掃離子模式，多反應監測（MRM），負離子掃描模式。

用1 μg·mL-1熊果酸和齊墩果酸標準品進行一級質譜和二級質譜掃描，并做電壓優化，確定熊果酸和齊墩果酸的母離子為455.3，子離子為455.45，錐孔電壓熊果酸為25 V，齊墩果酸為28 V，碰撞電壓均為24 V。

1.3 樣品前處理

1.3.1 熊果酸和齊墩果酸2 種不同前處理方法比較

（1）方法1。取5 批次怒江州瀘水市老窩鄉不同產地的酸木瓜鮮果，去核、粉碎，精密稱定5.0 g，于50 mL 具塞離心管中，加入50 mL 乙醇，70 ℃超聲提取30 min，8 000 r 離心，取上清液過0.22 μm 針筒過濾頭，濾液供液相色譜-串聯質譜分析[4]。

（2）方法2。取5 批次怒江州瀘水市老窩鄉不同產地的酸木瓜鮮果，去核、粉碎，精密稱定5.0 g，于50 mL 具塞離心管中，加入50 mL 乙醇，振蕩提取20 min，8 000 r 離心，將離心液轉入100 mL 雞心瓶，旋轉蒸發到5 mL，過C18 固相柱（5 mL 甲醇，5 mL水活化固相柱），用5%乙醇水沖洗小柱2 次，再用6 mL 正己烷洗脫，收集洗脫液，50 ℃氮吹干，準確加入1 mL 初始流動相溶解，過0.22 μm 針筒過濾頭，濾液供液相色譜-串聯質譜分析。

1.3.2 標準溶液配制

精密稱定熊果酸和齊墩果酸標準品各10.0 mg 用甲醇定容至10 mL，配成1.0 mg·mL-1的母液，再用初始流動相稀釋配成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μg·mL-1標準工作液。

2 結果與討論

2.1 標準溶液的MRM 色譜圖

0.02 ng·mL-1混合標液的MRM 色譜圖，如圖1所示。

圖1 0.02 ng·mL-1 混合標液的MRM 色譜圖

2.2 標準曲線線性關系與檢出限、定量限

將混合標準工作液按1.2 中的分析條件進行測定，在1.2 色譜條件下依次進樣測定，以待測化合物的質量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數。該方法熊果酸的線性方程為Fx=3.952 9e+007*x+104 321，相關系數為0.999 938 6；齊墩果酸的線性方程為Fx=3.797 90e+007*x+386 09.2，相關系數為0.999 177 1。熊果酸和齊墩果酸線性范圍均為0.001～0.2 μg·mL-1，峰面積在該線性范圍內線性關系良好。用初始流動相逐級稀釋對照品混合液，在1.2 色譜條件下進樣，以3倍信噪比對應的溶液濃度為方法檢出限，該法的熊果酸和齊墩果酸的檢出限均為0.000 2 mg·kg-1。

2.3 2 種提取方法對結果的影響

實驗表明，以5 號樣品為例，方法1 用乙醇超聲提取后直接上機測定，得到的色譜峰比較雜亂，基線不平穩，待測物含量偏低。方法2 用乙醇振蕩提取后，旋轉蒸發濃縮，過C18 固相柱，正己烷洗脫、氮吹后，上機測定的結果待測物含量偏高，雜峰干擾少，基線平穩，因為濃縮、過柱能去除大分子物質和一些雜質，降低離子抑制程度，提高分析的靈敏度[5]。2 種提取方法所得色譜圖，分別如圖2、3 所示。

圖2 方法1 所得的色譜圖

圖3 方法2 所得的色譜圖

2.4 精密度試驗

將5 號酸木瓜樣品按1.2 中分析條件進行重復進樣6 次。熊果酸（n=6）的保留時間（RSD%）為3.619%，色譜峰面積分別為2 942 307、2 986 988、2 792 078、2 814 979、2 799 595、2 766 655，平均峰面積為2 851 285，峰面積（n=6）的（RSD%）為2.913，齊墩果酸（n=6）的保留時間（RSD%）為3.313%，色譜峰面積分別為2 663 911、2 591 525、2 539 461、2 572 418、2 536 866、2 506 049，平均峰面積為2 569 431，峰面積（n=6）的（RSD%）為1.974。由此可知，該方法儀器精度良好，滿足檢測要求。

2.5 加標回收試驗

取5 個木瓜樣品，加入適量的熊果酸和齊墩果酸對照品，按1.3 樣品前處理方法進行樣品前處理，按1.2中分析條件進行加標回收試驗，熊果酸和齊墩果酸加標回收率結果如表1 所示。

表1 熊果酸和齊墩果酸加樣回收試驗表

3 結論

本文初步研究了云南省怒江州瀘水市老窩鄉的酸木瓜中熊果酸和齊墩果酸含量，采用液相色譜-串聯質譜法測定其含量，從提取工藝中得知，樣品經提取、濃縮，通過C18 固相柱后，可以有效減少雜質干擾。結果表明，該方法準確、可靠，可以為酸木瓜的開發利用提供可靠依據。