液質聯用法測定嬰幼兒奶粉中左旋肉堿含量不確定度評定

◎ 張 偉，楊 敏，李永忠，夏 敏，易佳容

（1.湖南口味王集團有限責任公司，湖南 益陽 413000；2.湖南中益食品化工檢測院，湖南 益陽 413000）

左旋肉堿又稱L－肉堿，是一種促進人體脂肪轉換為動能的類碳水化合物，不僅可用于減肥類的保健食品，也可用于嬰幼兒食品。奶粉中的左旋肉堿是促進奶粉中的脂肪分解、代謝、供能的重要營養素，可以促進體內脂肪的代謝和利用。嬰幼兒飲食結構比較單一，其主要飲食來源為各種乳制品，主要能量來源為乳制品中的脂肪。添加左旋肉堿，可以提高嬰幼兒對奶粉中脂肪的利用率[1]。因此，本文依據SN/T 5146—2019 第二法[2]液相色譜-質譜法測定嬰幼兒奶粉中左旋肉堿的含量。同時，分析嬰幼兒奶粉中的左旋肉堿含量不確定度，以供參考[3]。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙腈（色譜純，Merck）；甲醇（色譜純，Merck）；氨水（AR，湖南匯虹）；鹽酸（GR，國藥集團）；甲酸（HPLC，科密歐），左旋肉堿（壇墨，批號2 362012；含量99.90%；U=0.5%）；D3-左旋肉堿（TRC，批號：5-BKS-60-2）。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 標準儲備液

稱取左旋肉堿標準品7.30 mg，乙腈溶解，配制成濃度為729.27 μg·mL-1的標準儲備溶液，4 ℃以下避光保存。

1.2.2 標準中間液

準確吸取標準儲備液（729.27 μg·mL-1）0.10 mL，用乙腈稀釋至10 mL，搖勻，制成7.292 7 μg·mL-1的標準中間液，4 ℃以下避光保存。

1.2.3 D3-左旋肉堿內標標準儲備液

準確稱取標準品5.00 mg，用乙腈溶解，配制成濃度為500 μg·mL-1的標準儲備液，4 ℃以下避光保存。

1.2.4 D3-左旋肉堿內標標準中間液

準確吸取D3-左旋肉堿內標標準儲備液（500 μg·mL-1）0.20 mL，用乙腈稀釋至10 mL，搖勻，制成10 μg·mL-1的標準中間液，4 ℃以下避光保存。

1.2.5 標準工作液

準確移取標準中間液和內標標準中間液適量，用0.1%甲酸水溶液溶解并稀釋，配制成內標濃度為100 ng·mL-1，以及左旋肉堿濃度分別為0.364 6、1.823 2、18.231 2、72.927、145.854、364.635 ng·mL-1的 系列標準溶液，現用現配。

1.3 儀器與設備

AB-3500 液質聯用儀（美國AB）；十萬分之一電子天平（XS205，梅特勒）；萬分之一電子天平（AR224CN，奧豪斯）；ASE-12 固相萃取裝置；TG18G-Ⅱ離心機；WD-12 氮吹儀；SHA-C(A）恒溫水浴振蕩器；SPE 固相萃取柱（Oasis MCX 柱，60 mg/3 mL，Waters）。

1.4 測定方法

1.4.1 樣品提取與凈化

稱取試樣1 g →50 mL 離心管→加內標標準中間液100 μL →加入20 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液→搖勻，超聲5 min →加入5 mL 的1 mol·L-1氫氧化鉀溶液，混勻→60 ℃水浴皂化30 min →冷卻至室溫→加5 mL的1 mol·L-1鹽酸溶液→渦旋1 min →移至50 mL 容量瓶→用0.1 mol·L-1鹽酸溶液潤洗離心管，合并潤洗液至容量瓶→用0.1 mol·L-1鹽酸溶液定容至刻度→取1.00 mL 提取液于15 mL 離心管→加入9.0 mL 乙腈→渦旋混勻1 min →離心→取1.00 mL 上清液過Oasis MCX固相萃取小柱（依次使用3 mL 甲醇、3 mL 水和3 mL 10 mmol·L-1鹽酸活化）→用3 mL 的10 mmol·L-1鹽酸溶液淋洗→棄去淋洗液→抽干小柱→加2 mL 4%氨水甲醇溶液洗脫→收集洗脫液→40 ℃氮吹干→加入1.0 mL 0.1%甲酸水溶液溶解殘渣→過0.22 μm 濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4.2 標準曲線建立

以左旋肉堿和D3-左旋肉堿濃度比為橫坐標，左旋肉堿和D3-左旋肉堿內標峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5 建立數學模型

式中，X為樣品中左旋肉堿的含量，mg·kg-1；V為樣品定容體積，mL；n為樣品稀釋倍數；m為試樣質量，g；1 000 為換算系數。

1.6 不確定度來源的識別

對過程分析可知，左旋肉堿含量測定的不確定度主要有以下4 個方面[4]：樣品稱量過程引入的標準不確定度urel（m）；樣品測試液中左旋肉堿濃度引入的不確定度urel（C）；樣品稀釋體積引入的不確定度urel（V）；重復性引入的不確定度urel（r）。

2 不確定度分量的評定與合成

2.1 A 類不確定度

重復性引入的不確定度urel（r），主要受操作過程、樣品特性和儀器本身性能等因素的影響，獨立測定6次，結果如下：35.88、36.27、36.59、35.57、36.59、36.50 mg·kg-1。

6 次測量標準偏差：

實際檢測時，進行平行實驗，標準不確定度：

重復性引入的相對標準不確定度：

2.2 B 類不確定度

2.2.1 樣品稱量過程引入的標準不確定度urel（m）

樣品平均質量為1.034 4 g，稱量范圍內的最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布考慮（k=），則稱量引入的標準不確定度：

其相對標準不確定度：

2.2.2 樣品測試液中左旋肉堿濃度引入的不確定度urel（c）

（1）標準曲線擬合的相對不確定度分量urel（C1）。對6 個標準系列溶液各進樣1 次，共計6 次，得到左旋肉堿峰面積A1和D3-左旋肉堿A2，結果見表1。

表1 左旋肉堿標準曲線方程數據表

以左旋肉堿和內標濃度之比為橫坐標，左旋肉堿峰面積和內標峰面積之比為縱坐標，繪制標準曲線。標準工作曲線為：Y=2.154 16X+0.007 59，相關系數R=0.999 9。

標液中左旋肉堿和內標濃度之比的平均值：

峰面積比值的殘差標準偏差：

對被測樣品的提取液共測量1 次，即p=1，測得提取液中左旋肉堿濃度和D3-左旋肉堿濃度比值X=0.728 68。于是其標準不確定度u（c1）：

（2）儲備液與標準系列溶液的配制引入的不確定度urel（c2）。標準溶液配制時的不確定度主要來源為標準品的稱量、標準品純度和定容。

①標準物質純度引入的不確定度urel（c21）

本次使用的左旋肉堿標準品的證書標識純度為99.90%；urel=0.5%，則urel（c21）=0.005；D3-左旋肉堿帶入的不確定度不予考慮。

②標準品稱量引入的不確定度urel（c22）

本次左旋肉堿標準品配制時采用的是十萬分之一電子天平，其質量為7.30 mg，該天平準確度等級為Ⅰ級，在（0 g ≤m≤50 g）稱量范圍內的最大允許誤差為±0.05 mg，可按均勻分布考慮（k=），則標準品稱量引入的相對標準不確定度：

③標準溶液配制過程量器具及溫度變化引入的不確定度urel（c23）

標準儲備液、中間液和標準系列溶液配制中，均用到了移液槍和容量瓶，實驗過程中使用的移液槍經校準合格，玻璃量器具均為A 級，根據其最大允差計算；實驗室溫度在±5 ℃范圍內變動，溫度對體積的影響可以通過體積膨脹系數進行計算。因溶液的體積膨脹系數大于容量瓶體積的膨脹，故只考慮前者的影響。水的膨脹系數為2.1×10-4℃-1，均假設為三角分布，各量器具帶入的相對標準不確定度如下：

合成，得到：

將以上3 個分量進行合成，urel（c2）為：

2.2.3 樣品稀釋體積引入的不確定度urel（V）

本實驗樣品處理過程中，用到50 mL 容量瓶（A 級）1 次，1 mL 移液槍移取1.00 mL 溶液3 次，10 mL 刻度移液管（A）移取9.0 mL 溶液1 次，按照JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》[5]和JJG 646—2006《移液器檢定規程》[6]的要求，按三角分布考慮，則由量器具體積不準引入的相對標準不確定度如下。

50 mL 容量瓶（A 級）體積不準帶入的相對標準不確定度：

10 mL 刻度移液管（A 級）量取9.0 mL 體積不準帶入的相對標準不確定度：

1 mL 移液槍量取1.00 mL 體積不準帶入的相對標準不確定度：

由量器具帶入的相對標準不確定度：

2.3 相對標準不確定度的合成與擴展

2.3.1 不確定度的合成

根據以上結果，將urel（m）、urel（c）、urel（V）、urel（r）進行合成，即

2.3.2 不確定度的擴展

擴展不確定度是標準不確定度u（X）乘以包含因子k。取包含因子P95=2，則所測結果擴展不確定度：U=2×1.18 mg·kg-1=2.36 mg·kg-1。

3 結論

嬰幼兒奶粉中左旋肉堿的含量為（36.23±2.36）mg·kg-1，P95=2。本實驗采用液質聯用同位素內標法，測定嬰幼兒奶粉中的左旋肉堿含量。通過建立數學模型并計算，獲得不確定度結果。從不確定度的評定過程可以看出，不確定度主要來源是左旋肉堿濃度的測定，而樣品中左旋肉堿濃度的不確定度主要來源為標準曲線的測定。因此，我們在實驗過程中，應嚴格控制實驗條件，保證標準曲線的準確。