實時熒光PCR 檢測鼠源性成分的定性方法驗證

◎ 張從黨，王均華，王亞平，張維益，包靜云

（江陰市食品安全檢測中心，江蘇 無錫 214400）

隨著生活質量的不斷提升，人們對優質肉類及產品的需求逐年上升。然而，僅通過肉眼觀察難以分辨各類肉質的好壞[1-2]，一些經營者為牟取暴利，采取摻雜低廉肉品、注膠注水等手段，嚴重影響了食品安全[3-5]。鼠肉價格低廉，通常是不法商家的首選。然而，鼠肉攜帶多種病菌，含鉛、砷等有毒有害物質較高，食用后會對人類健康造成嚴重危害，并增加疫病傳播風險[5]。因此，對肉類及其制品中鼠源性成分的檢測，是保障食品安全的重要環節[6]。對于鼠源性成分的檢測方法，目前國內標準主要有GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR 法》和BJS 201904 《食品中多種動物源性成分檢測實時熒光PCR 法》[7-8]。

本研究旨在驗證GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR 法》在肉類食品中鼠源性成分檢測上的適用性，并將其與其他鼠源成分PCR 鑒定方法進行對比，以提供肉類摻假鑒別的方法依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本次實驗所用鼠DNA 樣品分別來自：1 號鼠DNA樣品由中國檢驗檢疫科學研究院饋贈（褐家鼠）；2 號鼠DNA 樣品由南京市食品藥品監督檢驗院饋贈（Balb/c 小鼠）。小家鼠新鮮組織樣本由本實驗采購。

1.2 儀器與試劑

①儀器：熒光定量PCR 儀（CFX-96，BIORAD，美國），紫外分光光度計（SHIMADZU) ；Dneasy mericon 食物核酸提取試劑盒（QIAGEN，德國）。②試劑：鼠種特異性基因測定試劑盒（熒光 PCR 法，北京良潤）；TaKaRa Taqman Real Time PCR 預混液（日本TAKARA 公司）；引物與熒光探針均由南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.3 樣本處理及總 DNA 提取

生鮮肉組織用滅菌水進行簡單沖洗，稱取適量樣品，并使用組織研磨儀進行研磨。采用離心柱型Dneasy mericon 食物核酸提取試劑盒，按照說明書操作，提取200 mg 肉制品中的總DNA，并命名為3 號鼠。

1.4 引物和探針

分別依據標準GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》、BJS 201904《食品中多種動物源性成分檢測實時熒光PCR 法》合成鼠成分熒光PCR 檢測相應的引物及探針，序列見表1。

表1 引物探針序列表

1.5 有效性實驗

根據GB/T 38164—2019 的實驗方法，以3 號鼠的DNA 為模板，使用GBT 引物和探針進行PCR 擴增，以評價國標方法的有效性。PCR 反應體系如下：DNA模板2 μL（濃度為50 ng·μL-1），引物GBT 鼠-F/GBT 鼠-R 和 探針GBT 鼠-P 各1 μL，2×Premix Ex Taq 12.5 μL，滅菌雙蒸水補足至25 μL。PCR 擴增條件分別為：95 ℃、30 s；95 ℃、5s；62 ℃、40 s，共40 個循環，在62 ℃時，采集熒光信號。

1.6 對比實驗

根據BJS 201904《食品中多種動物源性成分檢測實時熒光PCR 法》，以及鼠種特異性實時熒光PCR 檢測試劑盒的實驗方法，以3 號鼠DNA 為模板，進行相應的熒光PCR 擴增。通過對比2 種方法的擴增曲線和Ct 值，評估GB/T 38164—2019 方法的特異性。BJS 201904 方法使用BJS 引物和探針進行PCR 擴增，除了反應退火溫度和時間外，PCR 反應體系和擴增條件與步驟1.6 相同。試劑盒的熒光PCR 反應體系及擴增條件，按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 溫度梯度實驗

根據GB/T 38164—2019 實驗方法，以3 號鼠DNA為模板進行實驗。為了分析不同退火溫度對實驗結果的影響，本研究設置了6 種不同的退火溫度。除了退火溫度不同外，PCR 反應體系和擴增條件與步驟1.6相同。

1.8 適用性評估實驗

根據GB/T 38164—2019 實驗方法，分別以1 號鼠、2 號鼠和3 號鼠的DNA 為模板，使用GBT 引物和探針進行PCR 擴增，以評估國標方法在檢測不同鼠源性成分上的局限性。PCR 反應體系和擴增條件與步驟1.6相同。

2 結果與分析

2.1 有效性實驗結果

根據GB/T 38164—2019 的實驗方法，以3 號鼠的DNA 為模板，使用GBT 引物和探針進行PCR 擴增，擴增結果見圖1。從結果可知，GBT 引物和探針對目標基因無明顯的特異性擴增曲線，說明GB/T 38164—2019 標準中的引物探針不具有良好的物種特異性，不適用于小鼠物種的鑒別。

圖1 3 號鼠成分擴增曲線圖

2.2 對比實驗結果

分別用BJS 引物和探針及商品化的鼠源特異性PCR 試劑盒對3 號鼠DNA 進行熒光PCR 擴增反應，擴增結果見圖2、圖3。結果顯示，BJS 引物和探針以及商業化的試劑盒，均出現了特異性的擴增曲線，進一步確認了實驗室自提的3 號鼠樣本中存在鼠成分。由此說明，GB/T 38164—2019 標準中的鼠引物及探針，不具有良好的物種特異性，不適用于小鼠物種的鑒別。

圖2 BJS 201904 方法檢測3 號鼠熒光PCR 的擴增曲線圖

圖3 商品化試劑盒檢測3 號鼠熒光PCR 的擴增曲線圖

2.3 溫度梯度實驗結果

根據GB/T 38164—2019 標準的實驗方法設置6 種退火溫度，分別為54、56、58、60、62、64 ℃，進行熒光PCR 擴增反應，擴增結果見圖4。從結果可知，退火溫度在54、56、58 ℃時，均有出現擴增曲線，高于58 ℃以后，就沒有明顯的擴增曲線。盡管如此，根據GB/T 38164—2019 標準要求，鼠的熒光PCR 退火溫度應為62 ℃。

圖4 不同退火溫度對PCR 結果的影響圖

2.4 適用性評估實驗

采用GBT 引物和探針，根據GB/T 38164—2019 標準規定的鼠退火溫度，對1 號鼠、2 號鼠和3 號鼠的DNA 進行熒光PCR 擴增反應，擴增結果如圖5 所示。分析結果表明，僅有1 號鼠表現出特異性擴增曲線，2 號鼠和3 號鼠的DNA 未出現特異性擴增曲線，說明GB/T 38164—2019 標準中的鼠引物探針不具有良好的物種特異性，僅對大鼠有特異性擴增，不適用于小鼠物種的鑒別。

圖5 不同鼠源性樣本的熒光PCR 結果圖

3 結論

本研究旨在驗證GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR 法》，并評估其在肉類食品鼠源性成分檢測中的適用性。通過對不同來源的鼠樣品進行實時熒光PCR 檢測，并結合其他實驗方法，本研究證實了該方法能夠準確檢測肉類食品中的大鼠成分。但驗證結果亦表明，該方法在檢測不同鼠源性成分上存在局限性，僅能檢測大鼠成分，不適用小鼠成分的檢測，從而限制了其通用性。

此外，本研究也存在一定局限性。例如，鼠類樣本種類較少，未涉及豚鼠、竹鼠、海貍鼠等常見鼠類動物的驗證。因此，為提高鼠類成分實時熒光PCR 檢測方法的通用性，未來的研究應進一步擴大樣本量，分析不同鼠類間的基因多態性差異，設計適用于鼠類的通用引物和探針，并優化反應條件，以同時覆蓋其他常見鼠類品種的熒光PCR 檢測。

總之，本研究為相關檢測機構提供了驗證方法的借鑒，并為肉類食品中鼠源性成分的熒光PCR 檢測提供了有益參考。未來，隨著實驗方法的不斷完善和優化，實時熒光PCR 技術將在肉類食品中鼠源性成分檢測方面展現更加廣闊的應用前景。