GRSF1/GPX4軸調控的鐵代謝紊亂在小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用

劉雅靜 李亞男 李冰玉 王 蘇 劉 戀

鐵作為機體必不可少的微量元素之一,對生命活動具有十分重要的意義。適量鐵離子可參與細胞能量代謝,而過多的鐵離子又可抑制機體自我修復功能進而啟動鐵死亡加重損傷[1]。研究證實,細胞對鐵穩態有著嚴格的調控機制卻沒有適當的清除機制,機體中鐵的儲存量增多,可引起氧化還原失衡,最終導致組織向不可逆的細胞死亡方向進展[2]。已有研究證實,鐵離子是神經元損傷和死亡的關鍵調節因子,缺血腦組織中鐵代謝相關蛋白發生改變會導致鐵離子聚集,而過量的鐵離子可通過芬頓反應催化生成大量羥自由基,誘導細胞損傷,加重急性缺血期受損組織的損害并減少再灌注帶來的有益效果[3,4]。

研究發現富含鳥嘌呤序列的結合因子1(guanine-rich sequence-binding factor 1,GRSF1)在胚胎發育過程中可上調磷脂谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表達進而促進腦發育,而GPX4作為抑制鐵死亡的重要因子,有報道稱其可通過GRSF1/GPX4軸抑制鐵離子的聚集、改善心肌氧化應激進而減輕損傷[5,6]。然而GRSF1/GPX4軸是否可以通過調控鐵代謝進而改善腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)目前尚未見相關報道。本研究旨在探討GRSF1/GPX4軸調控的鐵代謝紊亂在CIRI中的作用,以期為改善CIRI的預后提供新思路。

材料與方法

1.實驗動物及分組:清潔級健康雄性C57BL/6小鼠18只,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,動物許可證號:SYXK(湘)2019-0004。本研究已獲得筆者醫院動物實驗倫理委員會審批[倫理學審批號:WDRM動(福)第20200303號]。隨機分為假手術組、腦缺血再灌注組、腦缺血再灌注+GRSF1過表達組。腦缺血再灌注組及腦缺血再灌注+GRSF1過表達組采用線栓法制備小鼠大腦中動脈栓塞模型,缺血60min再灌注24h;腦缺血再灌注+GRSF1過表達組造模前7天予以腦組織內注射GRSF1過表達慢病毒(上海吉凱基因醫學科技股份有限公司)。

2.主要材料:BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術股份有限公司;GRSF1抗體(貨號:A18227)、GPX4抗體(貨號:A1933)、TfR1抗體(貨號:A5865)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,IRP2抗體(貨號:23829-1-AP)、鐵蛋白抗體(貨號:10727-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司,β-actin抗體(貨號:GB11001)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

3.腦室注射慢病毒:0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,固定小鼠頭部于鼠腦立體定位架,消毒后沿頭部正中線切皮暴露頭骨。參考課題組既往研究進行定位后用微量注射泵垂直顱骨刺入,向小鼠側腦室緩慢注射2μl的GRSF1過表達慢病毒懸液。

4.動物模型制備:麻醉小鼠后在小鼠頸部墊枕仰臥位固定,消毒后于頸部正中切口,顯微鏡下暴露并分離左側頸總動脈及頸外動脈分支,分別結扎頸總動脈近心端及頸外動脈,利用動脈夾夾閉頸總動脈遠心端阻斷血流,盡可能靠近頸總動脈結扎處剪一小口,插入線栓通過動脈分叉處繼續向前推進,稍感阻力則停止,固定線栓并縫合切口。線栓置入60min后拔出恢復灌注。再灌注24h后行神經功能評分,小鼠不能自主活動或死亡記4分,行走時向對側傾倒記3分,向對側轉圈記2分,提尾時對側前肢不能伸直記1分,無異常記0分。

5.TUNEL法檢測細胞凋亡:4%多聚甲醛固定24h,脫水包埋后切片,脫蠟水化,滴加蛋白酶K工作液,37℃水浴鍋孵育30min,隨后破膜室溫孵育10min,浸入TUNEL混合液37℃孵育60min,PBS漂洗后滴加DAPI染液,室溫避光孵育,最后用抗熒光淬滅封片劑封片,顯微鏡下觀察拍照,使用Image J軟件進行定量分析。

6.Western blot法檢測GRSF1、GPX4、鐵調節蛋白(iron regulatory protein 2,IRP2)、轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TfR1)、鐵蛋白:根據樣品順序依次上樣,電泳儀恒壓80V 30min,觀察溴酚藍通過濃縮膠后調整為恒壓120V繼續電泳至溴酚藍將到底部。PVDF膜經甲醇激活,電轉儀恒流200mA 120min進行轉膜,快速封閉液封閉后TBST洗膜1次,隨后一抗孵育4℃過夜,TBST洗滌,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育1h,TBST洗滌后使用ECL顯影液避光孵育及利用顯影儀顯影,利用Image J軟件進行灰度值分析。

結 果

1．小鼠神經功能評分和凋亡率的比較:與假手術組比較,腦缺血再灌注組小鼠神經功能評分升高,大腦皮質缺血半暗帶區神經元凋亡率升高(P<0.05);與腦缺血再灌注組比較,腦缺血再灌注+GRSF1過表達組神經功能評分減小,各區域神經元凋亡率降低(P<0.05),詳見表1、圖1。

圖1 TUNEL染色觀察各組神經元凋亡情況

表1 小鼠神經功能評分及神經元凋亡率的比較

2.小鼠GRSF1/GPX4軸的表達變化:與假手術組比較,腦缺血再灌注組小鼠GRSF1、GPX4降低(P<0.05);與腦缺血再灌注組比較,腦缺血再灌注+GRSF1過表達組GRSF1、GPX4升高(P<0.05),詳見表2、圖2。

圖2 小鼠GRSF1/GPX4軸的表達變化及Western blot法條帶圖

表2 小鼠GRSF1/GPX4軸的表達變化

3.小鼠鐵代謝水平的表達變化:與假手術組比較,腦缺血再灌注組小鼠IRP2、TfR1、鐵蛋白升高(P<0.05);與腦缺血再灌注組比較,腦缺血再灌注+GRSF1過表達組IRP2、TfR1、鐵蛋白降低(P<0.05),詳見表3、圖3。

圖3 小鼠鐵代謝相關蛋白表達的Western blot法條帶圖及灰度值統計圖

表3 小鼠鐵代謝水平的變化比較

討 論

大腦中鐵代謝緩慢,鐵離子在中樞神經系統中的累積遠超其他組織,因此深入探究鐵代謝及其涉及的信號通路在神經系統疾病中的發病機制具有重要價值。研究證實鐵離子增加可觸發氧化應激損傷和炎性介質的積累進而導致大腦長期處于應激與炎性狀態,加劇細胞發生死亡的風險[7]。近年來有研究指出,即使是正常周齡的小鼠發生腦缺血再灌注損傷后也會出現衰老細胞增多,鐵離子蓄積的現象[8]。而作為機體內重要的抗衰老因子,研究發現,GRSF1沉默后細胞內鐵離子及TfR1表達增加,GPX4表達下降[6]。因此有研究認為,GRSF1耗竭誘導的鐵代謝紊亂可能是腦缺血再灌注損傷的關鍵機制之一。

然而在腦缺血再灌注損傷進程中GRSF1誘導鐵代謝紊亂的具體機制又是如何?GPX4作為體內重要的抗氧化酶,可通過谷胱甘肽作為輔助因子催化脂質過氧化物減少,抑制GPX4則會導致不飽和脂肪酸氧化和脂肪酸自由基的生成,進一步增加神經元對缺血缺氧的敏感度,促進鐵死亡的發生[9]。研究發現,在小鼠骨骼肌成肌細胞中GRSF1可直接靶向調控GPX4進而調節成肌細胞的分化,同時在胚胎腦發育中GRSF1與GPX4共表達,GRSF1可上調GPX4的水平,大鼠心肌細胞沉默GRSF1后會引起GPX4下降,鐵離子增多進而加重損傷[5,6,10]。本研究參考課題組既往報道建立小鼠大腦中動脈栓塞模型,筆者發現,與假手術組比較,腦缺血再灌注組中GRSF1及GPX4表達減少,小鼠神經功能評分與細胞凋亡率升高[11];而過表達GRSF1可顯著增加GPX4的表達,減輕腦損傷。

鐵蛋白、TfR1、鐵轉運蛋白1(ferroportin1,FPN1)等,作為調節體內鐵離子代謝的相關蛋白,鐵離子經小腸吸收后通過TfR1進入細胞,并在體內還原為二價鐵,胞內鐵離子會以直接或間接的形式維持細胞的正常生理功能并參與生理活動,同時IRP2還可通過與其mRNAs非翻譯區內的鐵反應元件(iron-responsive elements,IREs)結合在轉錄后調節鐵蛋白、TfR1的表達參與鐵代謝[12]。

生理條件下血-腦脊液屏障可保護大腦免受全身鐵離子濃度波動的影響,但在病理條件下,如CIRI會嚴重抑制神經元鐵外流相關蛋白的表達,從而導致鐵堆積[13]。此外,缺血還可增加細胞因子的表達,上調鐵代謝調節肽導致FPNl減少,抑制鐵釋放;同時缺血后TfR1及Dmt1表達增加,促進缺血性腦卒中鐵超載的發生,并且過量的鐵離子還可進一步誘導氧化應激和鐵死亡對大腦產生再次損傷,是加重CIRI的關鍵機制[14]。

已有實驗表明,鐵超載后IRP2與IRE解離進而IRP2增多,同時TfR1表達升高,促使鐵離子向細胞內轉運并以鐵蛋白的形式儲存[15]。此外Wang等[16]研究發現,在大鼠缺氧缺血性腦損傷模型中可見IRP2及TfR1增多。本研究結果顯示,與假手術組比較,腦缺血再灌注組鐵代謝相關分子IRP2、TfR1及鐵蛋白升高;過表達GRSF1后IRP2、TfR1及鐵蛋白降低,提示鐵代謝紊亂誘導的鐵死亡是參與CIRI的重要細胞死亡形式,通過調控GRSF1/GPX4軸可有效減輕鐵離子超載進而改善腦損傷。

綜上所述,在腦缺血再灌注期間機體鐵代謝紊亂進而誘導鐵死亡發生是加重腦損傷的關鍵機制,通過GRSF1/GPX4軸改善鐵代謝紊亂進而抑制鐵死亡減輕CIRI,可能是臨床防治腦缺血再灌注損傷的新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。