SIRT3缺陷對膿毒癥心肌損傷的影響及作用機制

徐天華 劉鵬昊 崔德榮

膿毒癥是由宿主對感染的反應失調引起的危及生命的器官功能障礙,是全球危重癥患者死亡的主要原因之一,院內病死率可達32.8%,當存在休克時甚至接近40%～60%,每年可能有數十萬人死亡[1,2]。膿毒癥誘發的心臟功能障礙與患者的不良結局和更高的病死率相關,是膿毒癥的主要并發癥之一[3,4]。目前關于膿毒癥心肌損傷的具體發病機制仍然存在爭議,其中微循環障礙被認為是膿毒癥心肌損傷的重要環節,微血管內皮損傷可引起心肌灌注減少和組織供氧不足,導致心力衰竭[5,6]。在缺氧、炎癥等條件刺激下,內皮細胞獲得間充質細胞的某些特征并逐漸失去內皮性質,這一過程被稱為內皮-間充質轉化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT),其導致細胞外基質成分(如膠原蛋白和纖連蛋白)積累,引起內膜增生和血管狹窄,進而參與了許多疾病的纖維化過程[7,8]。自噬作為細胞應對外界刺激的一種重要生理機制,能夠清除受損的細胞組分進而維持細胞穩態。既往研究表明,自噬可通過影響EndMT保護缺氧條件下的人心臟微血管內皮細胞[9]。然而,有關EndMT在膿毒癥心肌損傷中的作用機制報道較少。

SIRT3(sirtuin 3)主要位于線粒體中,通過對多種蛋白質的去乙酰化修飾維持線粒體正常的生物學功能,其活性與自噬、氧化應激等多種生理通路有關[10,11]。研究表明,SIRT3可通過激活Foxo3a、AMPK和SOD2調節自噬過程,進而減輕心肌缺血再灌注損傷[12]。然而SIRT3在膿毒癥心肌損傷中的具體調控機制尚不明確。因此本研究擬采用野生型(wild type, WT)小鼠與SIRT3基因敲除(SIRT3-/-)小鼠制備膿毒癥心肌損傷模型,觀察SIRT3缺陷對膿毒癥心肌損傷的影響,探究其作用機制,為臨床治療膿毒癥心肌病提供新的思路。

材料與方法

1.材料與試劑:兔抗小鼠SIRT3抗體,兔抗小鼠血小板-內皮細胞黏附分子(platelet-endothelial cell adhesion molecule, CD31)抗體,兔抗小鼠微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3(microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3,LC3)單克隆抗體,小鼠抗小鼠泛素結合蛋白p62(sequestosome 1,SQSTM1/p62)抗體,小鼠抗小鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體,Alexa Fluor?546標記的山羊抗兔IgG H&L抗體和Alexa Fluor?488標記的山羊抗小鼠IgG H&L抗體均購自英國Abcam公司,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自美國 Sigma 公司。人心臟微血管內皮細胞及內皮細胞專用培養基購自上海中喬新舟公司,SIRT3過表達慢病毒及陰性對照病毒購自上海吉凱基因公司,增強型化學發光顯影劑(enhanced chemiluminescence, ECL)購自南京諾唯贊生物科技有限公司,RIPA組織蛋白裂解液購自美國Thermo Fisher公司,蛋白定量試劑盒(BCA protein assay kit)購自上海碧云天生物技術股份有限公司。

2.動物模型制備及分組:本研究符合《美國NIH實驗室動物使用指南》的規定, C57BL/6野生型小鼠購自上海雷根生物科技有限公司[實驗動物許可證號: SCXK(蘇)2020-0009],SIRT3基因敲除小鼠(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院實驗室贈予)飼養于上海市第六人民醫院實驗動物中心[實驗動物許可證號: SYXK(滬)2021-0028]。參照既往研究方法,隨機選取8～12周雄性小鼠腹腔注射LPS(10mg/kg)或相同體積的0.9%氯化鈉溶液(normal saline, NS),24h之后收集心臟組織用于檢測[13,14]。動物分組設立為WT-NS組、WT-LPS組、SIRT3-/--LPS組、SIRT3-/--NS組,每組8只小鼠。

3.細胞處理及分組:人心臟微血管內皮細胞培養于含5%胎牛血清及1%內皮生長因子的內皮細胞培養基中,放置在正常細胞培養箱中培養。轉染時細胞以90000/孔的密度接種在6孔板中,培養16～24h后加入SIRT3過表達慢病毒及陰性對照病毒,感染12h之后換新鮮培養基,繼續培養至72h后于熒光顯微鏡下觀察病毒轉染效率。取生長狀態良好的人心臟微血管內皮細胞,經LPS(10μg/ml)刺激24h之后收集細胞蛋白進行檢測。細胞分組設立為對照組、LPS組、LPS+SIRT3過表達組、陰性對照病毒組。

4.心臟超聲:小鼠LPS腹腔注射24h后,經異氟烷吸入麻醉誘導并固定于恒溫板上。超聲探頭放置于胸骨旁左心室切面, 探頭頻率為30MHz,探測深度為13mm,待小鼠心率與呼吸穩定后,記錄并分析M模式下小鼠收縮末期及舒張末期左心室后壁厚度、左心室舒張末期容積。

5.天狼星紅染色:4%多聚甲醛固定心臟組織,常規石蠟包埋及切片。石蠟切片脫蠟至水,放入天狼星紅染液中染色8min,用無水乙醇脫水后放入干凈的二甲苯中透明5min,中性樹膠封片。染色后在光學顯微鏡下進行觀察,正常心肌組織呈黃色,而膠原組織呈紅色。使用膠原組織面積占該視野中總面積的百分比進行統計,分析心臟纖維化水平和膠原蛋白的空間分布情況。

6.Western blot法檢測:動物模型制備成功后,取部分心肌組織于冰上裂解,采用BCA法測定蛋白濃度。樣品經常規電泳、轉膜之后,使用脫脂牛奶室溫封閉1h。將PVDF膜放入按照1∶1000稀釋的 CD31、α-SMA、LC3、p62、SIRT3和1∶5000稀釋的α-tubulin和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體中,置于搖床上4℃孵育過夜,清洗之后加入稀釋的二抗,室溫下孵育1h。ECL顯影,凝膠成像系統進行拍照。GAPDH和α-tubulin作為內參蛋白,目標蛋白與內參的比值作為蛋白的相對表達量。

7.免疫熒光:石蠟切片脫蠟至水,置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(pH值為8.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。用含10%胎牛血清及0.3% Triton X-100的封閉液室溫封閉1h,隨后加入一抗稀釋液,兔抗小鼠CD31抗體(1∶200),小鼠抗小鼠α-SMA抗體(1∶400),放于濕盒中4℃孵育過夜。加入Alexa Fluor?546標記的山羊抗兔IgG H&L抗體(1∶500)和Alexa Fluor?488標記的山羊抗小鼠IgG H&L抗體(1∶500),室溫避光孵育1h, 加入含核酸染料4′, 6-二脒基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)的封片劑進行封片,共聚焦顯微鏡下采集圖像并分析。

結 果

1.SIRT3缺陷對LPS刺激下小鼠心臟結構和功能的影響:如圖1所示,心臟超聲觀察結果表明,相對于WT-NS組和WT-LPS組,SIRT3-/--LPS組的左室后壁厚度明顯增加,且左心室舒張末期容積顯著降低(P<0.001)。而WT-LPS組與WT-NS組比較,差異無統計學意義。

圖1 SIRT3缺陷對LPS刺激下小鼠心臟結構和功能的影響(n=5)

2.SIRT3缺陷對LPS刺激下小鼠心臟纖維化的影響:天狼星紅染色結果顯示(圖2),與WT-NS組比較,WT-LPS組的膠原蛋白含量明顯增多,且主要沉積于血管周圍(P<0.01)。而SIRT3-/--LPS組膠原蛋白沉積程度進一步加深(P<0.001)。

圖2 SIRT3缺陷對LPS刺激下小鼠心臟纖維化的影響(n=4)

3.SIRT3缺陷對LPS刺激下小鼠心臟微血管內皮細胞的影響:使用免疫熒光技術檢測心臟CD31、α-SMA蛋白表達情況(圖3),結果顯示,與WT-NS組比較,WT-LPS組血管內皮細胞標志蛋白CD31熒光強度降低(P<0.01),間充質細胞標志蛋白α-SMA熒光強度升高(P<0.05),表明EndMT的發生;而SIRT3-/--LPS組較WT-LPS組CD31熒光強度更低(P<0.05),α-SMA熒光強度更高(P<0.001),說明SIRT3-/--LPS組的內皮-間充質轉化程度更重。

圖3 SIRT3缺陷對LPS刺激下小鼠心臟微血管內皮細胞的影響(n=4)

4.SIRT3缺陷對LPS刺激下小鼠心臟組織自噬水平的影響:使用Western blot法檢測心臟LC3、p62、SIRT3的蛋白表達情況(圖4),結果顯示,與WT-NS組比較,WT-LPS組自噬水平明顯增加,LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高(P<0.001),p62蛋白表達水平降低(P<0.01),且WT-LPS組SIRT3蛋白表達明顯下降(P<0.05)。而SIRT3-/--LPS組較WT-LPS組自噬水平明顯下降:LC3-Ⅱ蛋白表達顯著降低(P<0.05),p62蛋白表達升高(P<0.001)。

圖4 SIRT3缺陷對LPS刺激下小鼠心臟組織自噬水平的影響(n=4)

5.SIRT3過表達對LPS誘導的人心臟微血管內皮細胞間充質轉化及自噬水平的影響:使用Western blot法檢測人心臟微血管內皮細胞LC3、p62、SIRT3、CD31、α-SMA的蛋白表達情況(圖5),結果顯示,與對照組比較,LPS組自噬應激性增強,LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高(P<0.001),SIRT3蛋白表達明顯下降(P<0.001),并伴隨EndMT的發生,CD31蛋白表達量下降(P<0.01),α-SMA蛋白表達量增加(P<0.05)。而SIRT3過表達導致人心臟微血管內皮細胞自噬水平進一步升高:LC3-Ⅱ蛋白表達顯著升高(P<0.05),p62蛋白表達降低(P<0.01),且抑制了LPS誘導的EndMT水平,CD31蛋白表達量升高(P<0.001),α-SMA蛋白表達量下降(P<0.001)。

圖5 SIRT3過表達對LPS誘導的人心臟微血管內皮細胞間充質轉化及自噬水平的影響(n=4)

討 論

心臟功能障礙是膿毒癥相關心血管衰竭的關鍵特征,與臨床預后密切相關,然而膿毒癥誘發心肌損傷的治療手段有限,其病理生理機制仍不明確[15]。研究表明,膿毒癥可導致心臟纖維化并影響患者的長期生存[3,16]。以膠原纖維過度沉積為特征的心臟纖維化會改變心肌結構,損害收縮和舒張功能并逐漸進展為心力衰竭,心臟纖維化的嚴重程度與心臟病患者較高的長期病死率有關[17]。本研究發現,LPS可誘導野生型小鼠心臟SIRT3蛋白表達量下降,且心臟超聲和天狼星紅染色的結果表明,與WT-NS組比較,LPS刺激可導致心臟膠原蛋白含量增加,且SIRT3-/--LPS組增加更顯著。相較于WT-NS組,SIRT3-/--LPS組左心室舒張末期容積降低、左心室室壁厚度增加,但WT-LPS組的相關心超指標差異不顯著,這可能與SIRT3在LPS誘導的心肌損傷中的保護作用有關,而SIRT3的缺陷加重了LPS誘導的小鼠心臟結構及功能損傷,說明SIRT3的表達量與LPS誘導的心臟功能障礙及纖維化水平有關。

內皮-間充質轉化是內皮細胞的表型向間充質細胞變化的過程,包括緊密連接的喪失,運動性增強和細胞外基質蛋白分泌增加,以內皮基因/蛋白質表達減少和(或)間充質基因/蛋白質的表達增加為特征[18]。心臟微血管內皮細胞的內皮-間充質轉化可引起心臟纖維化并通過分泌TGF-β1誘導心肌細胞凋亡[19]。本研究結果顯示,LPS可誘導野生型小鼠心臟組織中血管旁膠原蛋白沉積增多,血管內皮細胞標志蛋白CD31表達水平下降而間充質細胞標志蛋白α-SMA表達水平升高,且SIRT3-/--LPS組這一變化更加顯著。人心臟微血管內皮細胞經LPS刺激后亦會發生EndMT并伴隨SIRT3蛋白表達下降,而SIRT3過表達減輕了LPS誘導的EndMT水平。提示LPS誘導的膿毒癥小鼠中SIRT3缺陷可促進心臟微血管內皮細胞發生EndMT,并且EndMT的程度與心臟膠原蛋白的含量有關,而增加SIRT3的表達可以抑制LPS誘導的心臟微血管內皮-間充質轉化。

自噬可通過清除受損的細胞器及錯誤折疊或聚集的蛋白質維持細胞穩態。既往研究表明,自噬通量的恢復可抑制活性氧積累導致的內皮-間充質轉化,從而改善阿霉素誘導的心臟纖維化[20]。LC3有Ⅰ型和Ⅱ型兩種形式,其中LC3-Ⅱ的含量與自噬體形成的程度呈正比[21,22]。p62蛋白與自噬降解水平相關[23]。本研究發現,WT-LPS組小鼠心臟組織LC3-Ⅱ的表達水平升高且p62的表達水平下降,提示LPS可誘導小鼠心臟組織自噬水平應激性升高。而與WT-LPS組比較,SIRT3-/--LPS組小鼠心臟組織自噬水平下降,說明LPS誘導的膿毒癥小鼠中SIRT3缺陷可抑制自噬激活。同時人心臟微血管內皮細胞經LPS刺激后自噬應激性增強,而 SIRT3過表達導致自噬水平進一步增加。提示LPS誘導的膿毒癥小鼠中EndMT的程度可能與自噬水平相關,且 SIRT3參與自噬水平的調控。

SIRT3在治療心血管疾病領域具有很大潛力,從中藥中提取的一些成分,如白藜蘆醇、和厚樸酚等,可通過激活SIRT3發揮對心血管疾病的保護作用[24]。既往關于SIRT3的研究聚焦于其介導的膿毒癥心肌細胞損傷,機制主要涉及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成障礙等,而關于SIRT3調控膿毒癥心臟微血管內皮細胞損傷的機制研究較少[25～27]。本研究從膿毒癥心臟微循環障礙這一角度出發,發現SIRT3缺陷可抑制LPS誘導的自噬激活,參與調控EndMT,進而影響膿毒癥心臟功能及其纖維化。因此,筆者推測SIRT3可能作為膿毒癥心肌損傷的有效治療靶點。

本研究存在的不足:①缺乏特異性敲除心臟內皮細胞SIRT3基因的小鼠,有關SIRT3調控內皮-間充質轉化的直接證據尚不充分;②動物模型未設置多個時間點進行檢測,且未干擾自噬相關蛋白進行分子之間上下游關系的驗證,關于SIRT3的調控靶點有待進一步明確,SIRT3與自噬及心肌纖維化之間的因果關系需要更深入的研究加以闡述。

綜上所述,本研究發現,LPS誘導的膿毒癥小鼠中SIRT3缺陷可降低心臟組織自噬水平,促使心臟微血管內皮細胞發生內皮-間充質轉化,進而加重心臟舒張功能障礙及纖維化程度。SIRT3與膿毒癥心臟纖維化存在聯系,其中的機制有待于進一步探究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。