細胞間黏附分子-1基因多態性與缺血性心肌病易感性及預后的關聯

穆巴拉克·亞庫甫 熱甫開提·阿不都哈力克 孫 娟 艾力曼·馬合木提

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)的晚期階段,近年來其遺傳因素在發病機制中備受關注。細胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)可能因介導內皮細胞與白細胞、血小板間的起始黏附,在動脈粥樣硬化的發展過程中起著重要的作用,并與CHD和ICM的發生、發展密切相關[1]。ICAM-1主要通過特異性結合表達于血管內皮細胞上的相關聯受體,促使炎性細胞與內皮細胞的黏附作用,從而誘導并增強炎性反應,促進心室重塑,加重心肌缺血,破壞心功能,在ICM發生及發展中扮演了重要角色。近年來,ICAM-1單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與心血管疾病的關系主要集中在rs5498外顯子上,但ICAM-1基因的其他遺傳變異與ICM之間的相關性研究匱乏[2～4]。為深入探究ICAM-1基因多態性與ICM易感性及預后的關系,本研究從ICAM-1基因中初步篩選出rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491、rs923366共6個SNP,結合臨床資料進行了預實驗,為后續進行更多基因位點及更大樣本的研究提供實驗數據。

對象與方法

1.研究對象:采用病例-對照方法,選取64例在2017年1月～2019年1月就診于新疆醫科大學第一附屬醫院心力衰竭科且明確診斷為ICM的患者為ICM組,均符合ICM診斷標準[5,6]。排除標準:①除外CHD的特殊并發癥;②除外因其他因素導致的心臟擴大與心功能不全;③除外合并嚴重感染、其他嚴重心臟、肺、肝臟、腎臟等疾病以及惡性腫瘤。另外隨機抽取同期于新疆醫科大學第一附屬醫院健康體檢中心進行體檢的人群138例作為對照組,除外CHD、嚴重感染、嚴重心臟、肺、肝臟、腎臟等疾病及惡性腫瘤。本實驗在所有研究對象知情同意的條件下開展,且通過了筆者醫院醫學倫理學委員會審批(倫理學審批號:K202109-22)。

2.資料的收集及相關定義標準:記錄所有研究對象的一般資料包括年齡、性別、民族、體重指數(BMI);血清學指標包括總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、N-末端前體腦利納肽(NT-proBNP);影像學指標包括左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF);個人史包括吸煙史;既往史包括是否合并2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)、是否合并髙血壓。吸煙史定義為連續或累積吸煙≥6個月者且平均>1支/天。高血壓及T2DM診斷標準參考相關文獻[7,8]。

3.ICAM-1基因目標位點基因型檢測:采取外周靜脈血10ml,利用全血基因組提取試劑盒(廈門凱碩生物科技有限公司)提取基因組DNA。從NCBI HapMap數據庫中查找ICAM-1基因的SNP數據信息,用haploview軟件隨機標簽了6個SNP,分別為rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491及rs923366。應用在線Primer3 軟件設計引物,運用多重聚合酶鏈反應技術對6個目標多態位點所處區段進行擴增。外切核酸酶及蝦堿酶純化擴增產物,再運用SNaPshot多重SNP分型試劑盒(美國Applied Biosystems公司)進行延伸反應。純化后的延伸產物使用ABI3730XL測序儀(美國Applied Biosystems公司)進行測序,最后用GeneMapper4.1軟件對收集的原始數據進行分析后確定6個目標位點基因型。

4.隨訪:在患者明確診斷為ICM后的3、6、12、24、36個月分別進行電話隨訪,隨訪內容包括終點事件發生及其時間,隨訪的終點事件為心源性死亡。如果未發生終點事件,隨訪至3年并終止隨訪。

結 果

1.研究對象的一般情況:ICM組和對照組TC、TG、HDL-C、NT-proBNP、LVEF、吸煙、2型糖尿病比較,差異均有統計學意義(P均<0.05);年齡、性別、BMI、LDL-C、高血壓比較,差異均無統計學意義(P均>0.05),詳見表1。

表1 ICM組和對照組的一般資料比較

2.ICAM-1基因型、等位基因分布及相對危險度:ICAM-1基因6個SNP位點rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491及rs923366基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡,提示人群選擇無偏倚。rs12462944、rs281430、rs3093030、rs923366位點基因型和等位基因分布在ICM組與對照組中比較,差異均無統計學意義(P均>0.05)。ICM組rs5491位點AT基因型及等位基因T頻數均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),變異型雜合子AT攜帶者較野生型AA攜帶者ICM的風險是3.219倍(95%CI:1.524～6.800)。兩組rs281434位點AA、AG、GG基因型和A、G等位基因分布比較,差異均無統計學意義(P均>0.05),但在顯性遺傳模型中,ICM組變異基因型(AG+GG)頻率高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。變異型AG和GG攜帶者較野生型AA攜帶者ICM的風險是2.685倍(95%CI:1.057～6.825),詳見表2。

表2 兩組人群SNP基因型分布及風險評估[n(%)]

3.多因素Logistic回歸分析:以ICM發生與否作為因變量,以年齡、性別、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、吸煙、T2DM、高血壓及ICAM-1 6個位點基因型為自變量進行多因素Logistic回歸分析。因自變量較多,多因素Logistic回歸分析逐步向前回歸,結果顯示,2型糖尿病、rs5941位點AT基因型是發生ICM的獨立危險因素(OR=5.433、3.428,P<0.05),HDL-C高水平是ICM的保護因素(OR=0.192,P<0.05),其中AT型攜帶者ICM風險是AA型的3.428倍(95%CI:1.517～7.747),詳見表3。

表3 影響 ICM的多因素 Logistic回歸分析

4.ICM患者心源性死亡多因素COX回歸分析:將ICM組年齡、性別、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、NT-proBNP、LVEF、吸煙、T2DM、高血壓及ICAM-1 6個位點基因型作為協變量,以心源性死亡作為因變量,進行COX比例風險回歸模型分析,結果顯示,NT-proBNP水平增高、LVEF水平下降、rs5491位點AT基因型是心源性死亡的危險因素(HR分別為1.861、0.917、5.075,P<0.05),詳見表4。

表4 ICM組心源性死亡多因素COX回歸分析

5.rs5491位點AA、AT基因型預后差異:繪制Kaplan-Meier生存曲線,并采用Log-Rank檢驗用于比較兩組終點事件發生率的差異。從患者確診為ICM后開始隨訪,3年內rs5491位點AT基因型ICM患者較AA基因型心源性死亡風險更高(P<0.05),詳見圖1。

圖1 rs5491位點AA和AT基因型的ICM患者的生存曲線

討 論

ICAM-1是目前為止研究最多的與動脈粥樣硬化相關的黏附分子,近年來關于其多態性與冠狀動脈疾病易感性的關聯研究多集中在rs5498位點[2,9,10],ICAM-1基因的其他遺傳變異與ICM之間的相關性研究甚少,且因遺傳背景和種族差異,研究結果并不一致。為明確ICAM-1基因其他位點多態性與ICM的關系,本研究對隨機標簽出的分別位于外顯子區、內含子區及3′非編碼區的6個SNP位點進行了研究,結果顯示rs5491基因型的變異提高了ICM的患病風險。rs5491位于第2外顯子區,近年來有研究證明,外顯子錯義突變可導致心腦血管疾病的發生[11,12]。Craig等[13]研究發現,rs5491基因變異可導致ICAM-1N-末端區域的結構變化,從而改變其蛋白與淋巴細胞功能相關抗原-1及纖維蛋白原的結合能力,目前也有報道證實了該位點基因突變與其他疾病的相關性[14]。由此推測rs5491與外顯子區其他SNP有相似功能特點,可能通過改變ICAM-1的結構甚至結合能力,從而對促進ICM的發生產生一定作用,最終增加ICM的發病風險。

ICAM-1基因多態性還可能通過觸發動脈粥樣斑塊不穩定性,影響冠狀動脈疾病患者預后。有研究顯示ICAM-1基因rs5498多態性與急性冠脈綜合征復發和心血管病死率相關聯[15]。本研究也發現攜帶rs5491AT基因型的ICM患者較攜帶AA基因型的患者3年內心源性死亡風險高。然而ICAM-1基因多態性與冠狀動脈疾病預后的關聯性文獻仍然有限,需要更多的證據來明確其機制。

rs281434與冠狀動脈疾病的相關性尚未得到證實。本研究結果顯示,ICAM-1rs281434的多態可能與ICM易感性有關聯,但會受其他影響因素的干擾。通常情況下,內含子并不像其他遺傳結構那樣重要,然而近年來研究表明,內含子在基因轉錄、基因加工和RNA穩定性中起著至關重要的作用[2]。因此內含子區rs281434多態性可能影響mRNA的加工和穩定性,引起剪接位點的中斷從而導致異常剪接的發生,在ICM的發生中起到一定作用。然而本研究中位于內含子區的其他兩個SNP的基因型分布在兩組的差異無統計學意義,可能是本實驗納入的樣本量較小,因而無法準確反映其多態性對疾病易感性的作用,也有可能該位點在蛋白的功能改變上不起主要作用。3′非編碼區可以在不同水平上調節基因的表達并介導mRNA的穩定性、降解和亞細胞定位,該區基因表達特征可代表疾病發生的基因組機制,有助于發現新的診斷和治療方法[16,17]。但本研究中未發現位于3′非編碼區的rs3093032和rs923366的多態性與ICM發生相關。

本預實驗結果還顯示,T2DM是發生ICM的獨立危險因素,HDL-C是其保護因素,NT-proBNP高、LVEF低是ICM患者發生心源性死亡的危險因素,與既往研究結果一致[18～21]。

綜上所述,本研究發現,ICAM-1基因rs5491多態性與ICM易感性和預后相關,rs5491基因型的變異提高ICM的患病風險,AT型ICM患者較AA型預后較差。rs281434多態性可能與ICM易感性相關。然而本研究沒有發現其他ICAM-1基因位點與ICM相關,原因可能為預實驗納入的樣本量小,故有必要后續篩選更多的基因位點、擴大樣本量以及延長隨訪時間對本次研究結果給予驗證及補充,并進一步揭示ICAM-1基因多態性增加ICM發病及死亡風險的作用機制,為ICM的預防和治療提供新依據。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。