基因突變通過內質網應激途徑介導慢性胰腺炎發病機制的研究進展

馬立哲 孫曉茹 劉俊岑 劉牧云 孫暢

1海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海 200433；2中國人民解放軍海軍第905醫院消化內科，上海 200050

【提要】 內質網應激在慢性胰腺炎發生中具有重要作用。包括PRSS1、SPINK1、CPA1、CEL等易感基因可能通過蛋白質錯誤折疊引起內質網應激，從而介導慢性胰腺炎的發生。本文圍繞基因突變通過該途徑介導慢性胰腺炎的發生進行綜述。

內質網應激是細胞的一種保護性應激反應。內質網具有特殊膜結構，參與蛋白質的翻譯、翻譯后加工及質量控制等生理過程。蛋白質的翻譯后加工復雜且極易出錯，許多生理或病理損傷（如葡萄糖剝奪、氧化損傷、基因突變表達錯誤折疊蛋白、分泌蛋白合成的簡單增加等）均易導致內質網的加工能力達到飽和，引起內質網應激[1]。輕中度的內質網應激可誘導未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）信號轉導進行代償達到細胞自適應的目的，而重度或長期的內質網應激則使細胞從適應程序轉至凋亡程序，以清除不可逆損傷的細胞[2-3]。

UPR信號通路主要包括3個分支，分別由跨膜蛋白肌醇依賴酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和活化轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）啟動[4]。當未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網腔內過度累積超過內質網負荷時，分子伴侶蛋白BiP與IRE1、PERK及ATF6解離并導致其活化；但也有學者提出，單獨的BiP解離并不總是能夠激活內質網應激感受器，未折疊蛋白質和感受器或其他機制的直接作用也可能調節感受器的活化[5-6]。其中，IRE1、PERK從無活性的單體構象轉變成可自磷酸化的活性寡聚體形式誘導下游X盒結合蛋白1（X-box binding protein 1, XBP1）、真核翻譯起始因子2A（eukaryotic initiation factor 2A, eIF2a）等信號的活化，而ATF6被切割成活性單體形式發揮作用[7]。激活的UPR信號試圖通過翻譯衰減、內質網擴張、促進蛋白質折疊、內質網相關降解等多種途徑轉變內質網應激狀態，維持內質網穩態[8-9]；若內質網應激狀態不能被轉變或持續存在，則UPR信號可能通過增加活化轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)等的表達誘導細胞程序性凋亡[10]。

一、內質網應激與胰腺功能

胰腺作為人體最大的消化器官，可分泌胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種消化酶及激素。在所有哺乳動物中，腺泡細胞的蛋白質合成率最高，因此腺泡細胞依賴于包括UPR在內的多種機制來維持內質網穩態及蛋白的合成、轉運[11-12]。UPR系統作為內質網重要的保護性反應機制，此前的多種研究已證實其各成分在腺泡細胞穩態中的作用。早期的動物研究發現[13-15]，XBP1缺失的純合子小鼠出現明顯腺泡細胞的內質網發育不良和酶原顆粒的減少，提示XBP1對腺泡細胞的發育至關重要；而XBP1缺失的雜合子小鼠顯示出更易感染胰腺炎的表征，且在進一步的實驗中，顯示出XBP1具有保護腺泡細胞免受乙醇誘導的胰腺損傷的效應。PERK缺失的小鼠表現出胰腺腺泡細胞內質網的明顯擴張和碎片化改變，以及胰腺β細胞和α細胞的逐步喪失，并發展為糖尿病，提示其在胰腺發育中的重要作用，但是其下游靶點分子CHOP的缺失可保護小鼠胰腺β細胞的形態和功能免受高脂肪飲食所造成的損傷[16-17]。

二、基因突變通過錯誤折疊和內質網應激機制介導CP發生

自2009年陽離子胰蛋白酶原（cationic trypsinogen 1，PRSS1）的突變體可能通過蛋白質錯誤折疊引起內質網應激介導CP的發生這一機制被提出后[18]，越來越多與CP發生相關的突變基因被發現可能通過該途徑介導疾病的發生，如：羧肽酶A1（carboxypeptidase A1，CPA1）、人胰凝乳蛋白酶C (chymotrypsin C，CTRC)、絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(serine peptidase inhibitor Kazal type 1，SPINK1)、羧基酯脂肪酶（carboxyl ester lipase，CEL）等[18-22]。

1.PRSS1與內質網應激：2009年美、德等國家的學者率先在動物研究中發現，PRSS1突變體p.R116C和p.C139S產生的胰蛋白酶原水平減少至野生型的20%，但細胞裂解物中胰蛋白酶原水平與野生型接近，區別是突變型p.R116C以不溶性形式存在，且發現內質網應激標志物XBP1在突變體p.R116C和p.C139S中顯著升高，提示內質網應激在CP的發生中具有重要作用[18]。此后的研究又陸續發現p.L104P、p.S127C等突變體均可能通過胰蛋白酶原的錯誤折疊引起內質網應激機制介導CP的發生[23-24]。在諸多PRSS1突變體中，p.D22G、p.K23R、p.K23_I24insIDK等[25-27]是一類可引起胰蛋白酶原錯誤折疊從而導致其提前自激活的突變體，提前激活的胰蛋白酶可能在細胞內被內質網識別為錯誤折疊蛋白而被降解，細胞生物化學檢測中僅發現CHOP等內質網應激標志物升高，因此推測這種特殊形式的錯誤折疊可能與CHOP水平的增高及細胞凋亡相關[25]。

2.CPA1與內質網應激：CPA1前體是胰液中僅次于胰蛋白酶的第二大主要成分，約占胰液總蛋白的10%以上[28]。2013年一項大型研究明確了CPA1功能缺失突變與早發性CP明顯相關[19]。該研究還發現突變的CPA1對胰蛋白酶的激活、活性及降解無明顯影響，但存在CPA1蛋白分泌減少、細胞內滯留及XBP1等內質網應激標志物水平升高，提示CPA1部分功能缺失的突變可能通過蛋白質錯誤折疊及其引起的內質網應激介導CP的發生。隨后的研究陸續發現CPA1突變體p.Ser282Pro、p.K374E等也可能通過該途徑介導CP的發生[29]。

3.CTRC與內質網應激：正常情況下，CTRC在腸道中被胰蛋白酶激活，從而發揮控制胰蛋白酶原激活和降解的作用。功能缺失的CTRC突變體引起CTRC分泌減少、酶催化活性降低、抵抗胰蛋白酶激活或胰蛋白酶降解[20]，導致發生CP的風險增加。部分引起CTRC分泌減少的突變（如p.Q48R、p.G61R和p.A73T）在體外實驗中被發現引起內質網應激[30]，但是由于CTRC與PRSS、CPA1相比，其在胰腺中表達水平明顯較低，且內質網應激的有害影響與錯誤折疊的蛋白水平有關，部分學者認為CTRC功能缺失突變僅引起較輕的蛋白毒性效應[31]。

4.SPINK1與內質網應激：SPINK1的主要作用是延遲胰蛋白酶原的過早激活，避免胰腺的自我消化。2000年，N34S突變被發現是CP的強危險因素，也是SPINK1最常見的突變之一[32]。隨后眾多研究發現，N34S突變對SPINK1的表達、分泌及對胰蛋白酶的抑制活性無明顯影響[33-34]。有學者提出N34S突變與胰蛋白酶的結合障礙可能是該突變的致病基礎[35]。而c.194+2T＞C突變體顯示出外顯子3的跳躍和SPINK1的表達缺失，提示功能缺失的SPINK1是CP發病風險增加的重要機制[36]。最近的一項研究證明,SPINK1功能缺失突變導致其表達和分泌減少是主要的致病機制，一些罕見的直接影響其反應位點的突變可能與胰蛋白酶結合受損相關[21]。該研究也提示一些罕見突變體（如R65Q）出現SPINK1蛋白分泌減少可能與折疊改變有關。既往研究也報道過一些罕見的SPINK1突變體（如D50E、Y54H）出現SPINK1分泌減少和蛋白細胞內滯留[37-38]，提示可能通過錯誤折疊引起內質網應激致病。因此，內質網應激在SPINK1突變介導CP發生機制中的作用尚待進一步研究。

5.CEL與內質網應激：CEL在胰腺腺泡細胞中大量存在，人CEL基因和一個串聯排列的假基因CELP位于9號染色體q34.13[39]。編碼CELP外顯子11中的單核苷酸缺失（c.1686delT、c.1785delC）導致一種常染色體顯性遺傳病，其特征是早發性胰腺外分泌功能不全和MODY8（青年成熟型糖尿病）。隨后發現p.C563FSX673和p.C596FSX695等單核苷酸缺失的突變可能產生容易在腺泡內聚集和滯留的CEL，提示其可能通過蛋白質錯誤折疊引起內質網應激介導CP的發生[22,40]。最近的一項研究[41]通過對比CEL-16R、CEL-HYB及兩種非同義單核苷酸多態性CEL-HYB變體（即錯義突變c.1463T＞c和c.1643C＞T）的表征進行分析顯示，CEL-HYB的錯義突變導致CEL蛋白的錯誤折疊和在內質網中滯留增多，同時發現內質網應激標志物BiP升高，提示CEL可能通過引起內質網應激導致CP的發生。

6.其他：內質網中新生蛋白質的共翻譯和翻譯后修飾對蛋白質的折疊、穩定性和轉運至關重要。過去幾年的研究證實了Nε-賴氨酸乙酰化在維持內質網蛋白的穩定性中具有重要作用，部分多肽需經過乙酰化后才能通過分泌途徑并完全成熟[42-43]。內質網中乙酰輔酶A轉運體（acetyl-CoA transporter 1，AT-1）通過調節胞質中乙酰輔酶A向內質網內轉運以維持內質網腔內Nε-賴氨酸乙酰化過程的必須原料——乙酰輔酶A的水平，從而參與其中。最近的一項動物研究證實，腺泡特異性敲除AT-1小鼠可以自發產生輕癥至中度重癥的CP表現，同時伴有廣泛的未折疊蛋白反應和內質網應激標志物的上調[44]，提示內質網自身的蛋白質翻譯及翻譯后修飾的功能障礙在CP發生、發展中起重要作用。

綜上所述，內質網應激在CP的發生和發展中具有重要的作用，故有希望成為CP治療的潛在靶點。在胰腺中大量表達的PRSS1、CPA1、CEL等蛋白，更可能因為基因突變導致其表達、分泌過程中出現細胞內滯留，引起內質網應激而導致疾病的發生。SPINK1、CTRC等在胰腺中非大量表達的蛋白，也可能因為基因突變導致蛋白在內質網中折疊異常引起內質網應激；但因其表達量較少，引起內質網應激的水平有限，因此相關基因對疾病發生的作用尚待進一步研究。

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