新疆桑白皮提取物對主要致齲細菌生物膜作用的實驗研究

吳 龍, 阿爾曼·阿卜力孜, 瑪依奴爾·阿塔吾拉, 趙 今

(1新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院)牙體牙髓病科; 2新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所, 烏魯木齊 830054)

齲病是牙體硬組織常見的慢性感染性疾病之一,齲病及其并發癥可誘發全身疾病或使全身疾病加重,降低了患者生活質量,增加了經濟負擔[1]。齲病的發生和發展是由細菌、宿主等多種因素共同作用引起的,如菌斑生物膜的組成和生化性能、飲食習慣、遺傳因素和牙體結構等[2]。齲病防治的關鍵措施在于預防,其中防止牙菌斑形成對于避免齲病的發生尤為重要。天然藥物因副作用小、經濟、安全等優點已成為齲病防治研究的重點。相關研究證實多種天然藥物對致齲細菌及生物膜生長有良好的抑制作用,從而達到防齲作用[3-6]。桑白皮(MoriCortex)為桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥根皮,其中包含黃酮類、呋喃類、香豆素類等[7-8],具有降血脂、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[9-13]。新疆桑白皮主要產自于新疆南部地區,含有多種的活性成分,具有獨特的自然22倍體染色體倍數性[14]。本課題組前期研究發現新疆桑白皮提取物對變異鏈球菌、血鏈球菌和黏性放線菌浮游狀態下生長及致齲相關毒力因子有良好的抑制作用,并證明對生物膜形成也有一定的抑制作用[15]。本研究探究新疆桑白皮提取物對主要致齲細菌在生物膜狀態下產酸、產糖等致齲毒力因子及生物膜活性的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥SW-CJ-2D超凈工作臺(上海博訊實業有限公司);3-18KS臺式高速冷凍離心機(Sigma公司);Multiskan GO酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);DHP-9082電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司);Gold S54紫外可見分光光度計(上海棱光技術有限公司);PHS-3CpH計(上海雷磁是儀電科學儀器股份有限公司);新疆桑白皮藥材:由新疆醫科大學天然藥物重點實驗室提供,經鑒定符合《中華人民共和國藥典》2020版規定;腦心浸液培養基(Brain heart infusion,BHI,北京索萊寶科技有限公司,315G032);氯己定(Chlorhexidine,CHX,上海麥克林生化科技股份有限公司,C804720);二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO,上海科雅生物科技有限公司,1084ML100);蒽酮試劑(上海麥克林生化科技有限公司,A800666);LDH活性試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,BC0685);鈣離子試劑盒(南京建成生物工程研究所,C004-2-1);SYTO 9/ PI活死菌染色試劑盒(上海懋康生物科技有限公司,MX4234);變異鏈球菌(Streptococcusmutans,UA159)、血鏈球菌(Streptococcussanguis,ATCC 10556)、黏性放線菌(Actinomycesviscosus,ATCC 19246)均購自廣東省微生物培養中心。

1.2 方法

1.2.1 新疆桑白皮提取物的制備 取新疆桑白皮藥材粉碎并過篩,用80%乙醇回流提取3次,抽濾并合并3次濾液,將濾液濃縮,冷凍干燥得粉末。根據前期研究結果新疆桑白皮提取物對變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌單菌種生物膜50%最低生物膜抑制濃度(50% Minimum biofilm inhibition concentration, MBIC50)分別為:1.0、1.0、0.5 mg/mL,將新疆桑白皮提取物用含1%DMSO的BHI培養基配制至2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50及1/4倍MBIC50,備用。

1.2.2 3種致齲菌菌懸液的制備 將變異鏈球菌、血鏈球菌和黏性放線菌分別接種于BHI瓊脂培養基,37℃厭氧培養48 h。挑取3種細菌單個菌落分別在BHI液體培養基中在相同條件下分別過夜培養24 h培養至對數生長期,將3種細菌菌懸液濃度分別調整至108CFU/mL(OD625=0.18)備用。

1.2.3 分組 (1)陰性對照組:不加新疆桑白皮提取物及氯己定;(2)陽性對照(CHX)組:加入0.05%氯己定;(3)實驗組:加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50及1/4倍MBIC50濃度新疆桑白提取物。

1.2.4 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜產酸水平的影響 向24孔板中加入1.5 mL BHI培養基(含1%蔗糖),分別加入“1.2.2”項下3種細菌單一菌懸液0.5 mL,培養24 h分別形成3種細菌單一菌株生物膜。吸出每孔中的培養液,用PBS緩沖液洗滌3次,實驗組分別加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50濃度新疆桑白皮提取物各2 mL,CHX組加入0.05%氯己定2 mL,陰性對照組加入BHI培養基2 mL(初始pH調至7.2),培養24 h,4℃下,8 000 r/min離心30 min收集上清液,測定pH值,計算ΔpH值=初始pH值-終末pH值。在培養的24 h內,選取1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h時間點測定pH值,繪制3種細菌pH曲線,動態觀察新疆桑白皮提取物對3種主要致齲菌單菌種生物膜pH值的變化。

1.2.5 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜產水溶性細胞外多糖(Soluble extracellular polysaccharide , SEPS)及水不溶性細胞外多糖(Insoluble extracellular polysaccharide , IEPS)能力的影響 向24孔板中分別加入1.5 mL的BHI培養基(含1%蔗糖)與3種細菌單一菌懸液0.5 mL,培養24 h分別形成3種細菌單一菌株生物膜。吸出每孔中的培養液,用PBS緩沖液洗滌3次,實驗組分別加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50濃度新疆桑白皮提取物提取物各2 mL,CHX組加入0.05%氯己定氯己2 mL,陰性對照組加入BHI培養基2 mL。培養24 h將上清液倒出,用PBS緩沖液洗滌3次,向每個孔中加入500 μL DEPC處理的水,用無菌刀片從底部充分刮取生物膜,將SEPS充分溶解于DEPC處理的水中,4℃下12 000 r/min離心10 min,將沉淀重懸于0.4 mol/L NaOH中,將IEPS充分溶解于NaOH中,4℃下12 000 r/min離心10 min。將240 μL蒽酮硫酸試劑(1 mg蒽酮粉∶1 mL硫酸)與80 μL DEPC處理水(含SEPS)或NaOH溶液(含IEPS)混合,在96℃下加熱6 min,冷卻至室溫后,分別測定OD625值,計算多糖含量。

1.2.6 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜上清液中乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase,LDH)含量的影響 分別將變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌菌懸液各100 μL和100 μL BHI培養基(含1%蔗糖)加入96孔板,37℃下培養24 h形成3種細菌單一菌株生物膜。吸出上清液,用PBS緩沖液洗滌3次,實驗組分別加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50濃度新疆桑白皮提取物提取物各200 μL,CHX組加入0.05%氯己定氯己200 μL,陰性對照組加入BHI培養基200 μL,37℃下培養24 h,收集上清液,按LDH檢測試劑盒說明書操作測定上清液中LDH含量。

1.2.7 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜上清液中鈣離子(Ca2+)濃度的影響 分別將變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌菌懸液各100 μL和100 μL BHI培養基(含1%蔗糖)加入96孔板,37℃下培養24 h,形成3種細菌單一菌株生物膜。吸出上清液,用PBS緩沖液洗滌3次,實驗組分別加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50濃度新疆桑白皮提取物提取物各200 μL,CHX組加入0.05%氯己定氯己200 μL,陰性對照組加入 BHI培養基200 μL,37℃下培養24 h,收集上清液,按Ca2+檢測試劑盒說明書操作測定上清液中Ca2+濃度。

1.2.8 3種致齲細菌單菌種生物膜活/死菌染色 將Live/Dead試劑盒中的SYTO 9和PI各1.5 μL加入1 mL生理鹽水配制成活/死菌染色試劑,避光4℃保存。實驗組分別加入MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50濃度新疆桑白皮提取物和3種細菌菌懸液各1 mL分別放入無菌激光共聚焦玻底培養皿中,CHX照組加入氯己定和3種細菌菌懸液各1 mL分別放入無菌激光共聚焦玻底培養皿中,陰性對照組加入3種細菌菌懸液和BHI培養基各1 mL分別放入無菌激光共聚焦玻底培養皿中,37℃下培養24 h,棄去上清液,用PBS緩沖液洗滌3次,加入50 μL的SYTO 9/PI混合染料,于37℃避光靜置15 min,吸去多余的染料后,放置于激光共聚焦顯微鏡下(Confocal laser scanning microscope,CLSM),觀察生物膜熒光圖像。

2 結果

2.1 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜pH值的影響與陰性對照組比較,實驗組(除1/4倍MBIC50實驗組)和CHX組生物膜ΔpH值均減小,差異有統計學意義(P<0.05)。與CHX組比較,實驗組生物膜ΔpH值均增大,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。由pH曲線可見變異鏈球菌、血鏈球菌和黏性放線菌陰性對照組和1/4倍MBIC50實驗組的pH值在培養后的2 h開始迅速下降,在培養后的6、8、12 h后下降到5.0以下。 2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50實驗組及CHX組pH值下降幅度較陰性對照組和1/4倍MBIC50實驗組降低,2倍MBIC50實驗組與CHX組pH值變化幅度最小,見圖1。

注: A: 變異鏈球菌; B: 血鏈球菌; C: 黏性放線菌。

表1 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜pH值的影響

2.2 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜產IEPS、SEPS能力的影響與陰性對照組比,實驗組(除1/4倍MBIC50實驗組)和CHX組3種致齲細菌單菌種生物膜產IEPS、SEPS能力降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與CHX組比較,實驗組3種致齲細菌單菌種生物膜產IEPS、SEPS能力升高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

2.3 新疆桑白皮對3種致齲細菌單菌種生物膜上清液LDH含量的影響與陰性對照組比較,實驗組(除了1/4倍MBIC50實驗組)和CHX組上清液中LDH含量升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與CHX組比較,實驗組上清液中LDH含量降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

注: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。

2.4 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜上清液Ca2+濃度的影響與陰性對照組比較,實驗組(除了1/4倍MBIC50實驗組)和CHX組上清液中Ca2+濃度升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與CHX組比較,實驗組上清液中Ca2+濃度降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4。

注: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。

2.5 新疆桑白皮提取物對3種致齲細菌單菌種生物膜活死菌狀態的影響與陰性對照組比較,實驗組(除了1/4倍MBIC50實驗組)和CHX組生物膜細菌總量下降,死細菌數量增大,活/死細菌比值百分比下降,差異有統計學意義(P<0.05),見圖5～8。

注：第1排表示不同處理組活菌成像;第2排表示不同處理組死菌成像;第3排表示不同處理組活死菌合并成像;比例尺為10 μm。

注：第1排表示不同處理組活菌成像;第2排表示不同處理組死菌成像;第3排表示不同處理組活死菌合并成像;比例尺為10 μm。

注: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。

3 討論

變異鏈球菌、黏性放線菌等是主要的致齲菌,通過代謝各種碳水化合物產生酸,將口腔pH值降到5.0以下,利用蔗糖作為底物合成胞內和胞外多糖,與齲病的發生密切相關[16-17]。血鏈球菌牙菌斑是一種口腔細菌生物膜,最早黏附于牙表面,為其余細菌黏附與定植提供條件。由于生物膜增加了細菌的耐藥性,抑制或破壞生物膜對預防和治療齲病至關重要[18]。與細菌浮游狀態相比,細菌生物膜更能適應并生存在復雜的環境中,因為成熟生物膜中的細菌病原體產生EPS,富含EPS的酸性微環境是一個關鍵的毒力因子,它作為一個三維支架結構具有保護屏障作用,增強了牙菌斑生物膜的致齲潛力[19-20]。盡管在預防齲病方面取得了顯著進展,但致齲菌生物膜的治療仍具有挑戰性。

產酸能力作為致齲菌生物膜與齲病發生發展相關最主要原因,致齲細菌能夠以蔗糖為底物產酸,使脫礦與再礦化平衡失調,最終致使牙體組織齲壞[21]。因此,控制致齲細菌生物膜產酸是降低致齲細菌致齲能力的有效方法。本實驗結果發現新疆桑白皮提取物呈劑量依賴性地抑制上述3種主要致齲菌生物膜狀態下產酸能力,隨著新疆桑白皮提取物濃度的增加pH值降低,細菌的產酸能力與藥物濃度成反比,除了1/4MBIC50組以外其余3組藥物濃度下24 h后的pH值高于平衡牙脫礦水平的臨界pH值。通過pH曲線動態觀察到藥物作用后致齲菌產酸能力受抑制作用,進入平臺期的時間加快,因此進一步證明新疆桑白皮提取物對生物膜狀態下有良好的防齲效果。由特定病原微生物產生的EPS促進了微生物的黏附和粘連,其中IEPS促進細菌的聚集和牙菌斑的聚集,而SEPS是一種可快速代謝的能量儲備多糖[21-22]。有研究表明IEPS對于菌斑生物膜的成熟是必不可少的,因為高度黏附的IEPS的存在可增加生物膜機械穩定性,并增加細菌在牙齒表面黏附時間[22]。目前測定多糖含量通常采用蒽酮硫酸法或苯酚硫酸法兩種比色法,其中蒽酮-硫酸法可以測定所有的碳水化合物中總多糖含量,對快速測定總多糖含量具有重要意義[23],因此本實驗研究采用蒽酮-硫酸法測定新疆桑白皮藥物作用下細菌細胞膜外多糖含量的變化,研究結果發現新疆桑白皮對致齲細菌生物膜產IEPS、SEPS能力均有良好的抑制作用,并觀察到隨著藥物濃度的增加IEPS與SEPS的比例下降,主要與其對細菌及生物膜的抑制作用有關。

當細菌細胞膜被破壞或細通透性能發現變化時,LDH會被釋放到細胞外即上清液中,上清液中LDH含量隨著被破壞的細菌數目的增加而增加,因此LDH活性常用于檢測生物膜內的細胞損傷[24]。Ca2+的泄漏也可以用來指示生物膜內的細菌細胞損傷,當細菌細胞膜的完整性被破壞時,上清液中Ca2+的含量就會增加[25]。而本研究通過檢測新疆桑白皮提取物作用后生物膜細菌培養液LDH含量和Ca2+濃度,研究結果發現培養液LDH含量和Ca2+濃度與新疆桑白皮藥液濃度成正比,說明隨著藥物濃度的增加藥液對生物膜細菌破壞力也增加,結果均表明新疆桑白皮提取物破壞了生物膜結構。本研究使用活/死細菌活力試劑盒來觀察生物膜內的細菌活力,結果也顯示紅色熒光隨著藥物濃度的增加而增加,特別是在MBIC50或以上,表明細菌細胞膜受損更大,從合并的活細菌圖像中還觀察到隨著藥物濃度的增加,黃色更顯著,隨著藥物濃度的增加生物膜所含活死菌比例明顯下降,從而降低生物代謝能力,進一步證明新疆桑白皮提取物有良好的殺菌和生物膜形成抑制作用。

綜上所述,新疆桑白皮提取物不僅可以抑制主要致齲細菌生物膜的形成、產酸、產糖能力,還能破壞生物膜細菌影響生物膜形態活性。本次研究進一步驗證了新疆桑白皮提取物的防齲作用,為齲病的防治提供了一定的實驗依據。但本實驗存在一些不足,本實驗研究新疆桑白皮提取物防齲作用并且研究其對單菌種生物膜作用的研究,因此對混合菌種生物膜作用以及防齲潛在機制分子水平有待進一步研究。