新疆桑白皮提取物防齲作用的實驗研究

瑪依奴爾·阿塔吾拉, 吳 龍,2, 阿爾曼·阿卜力孜, 趙 今,2

(1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 (附屬口腔醫(yī)院) 牙體牙髓病科; 2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學研究所, 烏魯木齊 830054)

齲病是最常見的口腔疾病,可影響兒童、青少年、成人以及老年人所有年齡段人群的口腔健康及生活質(zhì)量[1-4]。變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是口腔致齲的主要病原菌, 在齲齒的發(fā)生和發(fā)展中起著核心作用,因此抑制S.mutans及菌斑生物膜的形成對于預(yù)防齲齒,促進口腔健康至關(guān)重要[5-6]。天然藥物及其提取物已成為預(yù)防治療口腔疾病的研究熱點[7], 目前已被證實含有防齲成分的天然藥物包括厚補、 蜂膠、 苦參等[8-9]。桑白皮(MoriCortex)別名桑根皮、桑根白皮、桑皮等,用藥歷史悠久,本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)新疆桑白皮提取物能夠抑制主要致齲細菌浮游狀態(tài)下的生長、產(chǎn)酸、產(chǎn)糖及黏附能力,還對生物膜的形成有一定的抑制作用[10]。本研究采用齲病動物模型評估新疆桑白皮提取物防齲作用的有效性及安全性,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥SW-CJ-2FD超凈工作臺(上海博迅科技有限公司);MCO-15AC 37℃恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋公司);TCS-SP8激光共聚焦熒光顯微鏡 (德國徠卡公司);新疆桑白皮藥材(由新疆醫(yī)科大學天然藥物重點實驗室提供, 經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國藥典》2020版規(guī)定); 氯己定 (Chlorhexidine,CHX, 上海源葉生物科技有限公司, 55-56-1);紫脲酸銨(上海源葉生物科技有限公司, 3051-09-0);羅丹明 B(索萊寶生物科技有限公司,81-88-9)。

1.2 實驗動物42只21 d 齡雄性SPF-SD大鼠,購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心,本研究通過新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批(批號: IACUC-20230627-12)。

1.3 致齲菌及培養(yǎng)基變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans,廣東省微生物培養(yǎng)中心,UA159);腦心浸液培養(yǎng)基(Brain-Heart Infusion, BHI,北京索萊寶科技有限公司, 315G032); 輕唾桿菌肽瓊脂(Mitis Salivarius Bacitricin Agar, MSBA,山東拓普生物工程有限公司, M0740)。

1.4 新疆桑白皮提取物及S.mutans菌懸液的制備取新疆桑白皮藥材適量粉碎過60目篩,按照料液比1∶10(g/mL)用80%乙醇回流提取3次,合并濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥(-80℃),得到粉末,粉末用含1%DMSO的BHI培養(yǎng)基配制濃度為16 g/L的母液,經(jīng)無菌濾器過濾除菌,按倍比稀釋法將母液用蒸餾水分別稀釋至1.0、0.5、0.25 g/L,置于4℃環(huán)境備用。選取S.mutans凍存菌株接種于BHI培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h。觀察菌落生長形態(tài),隨機取單個菌落涂片鏡檢,無污染且生化鑒定為純培養(yǎng)后,相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h,取形態(tài)一致的菌落溶于BHI液體培養(yǎng)基,采用麥氏比濁法標定菌懸液濃度至1×106CFU/mL。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗分組 取42只21 d 齡雄性SPF-SD大鼠,采用隨機數(shù)表法隨機分為6組:新疆桑白皮提取物高、中、低劑量組(1.00、0.50、0.25 g/L新疆桑白皮提取物),陽性對照組(0.12%的氯己定,CHX組);陰性對照組(無菌蒸餾水,CA組);空白對照組(不建模不干預(yù),Control組)。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學動物中心,標準環(huán)境,給予12 h 的光/暗循環(huán)。

1.5.2 齲齒動物模型的建立 參照符合國際Keyes齲病動物模型標準,除Control組其他5組于鼠齡22～24 d進行內(nèi)源性抑菌,飼以均勻混有氨芐西林鈉(每2 g配1 000 g普通飼料)的飼料,含青霉素鉀(80萬單位,1瓶配 200 mL生理鹽水)的飲水[11]。鼠齡25 d起大鼠飼以Diet 2000# 致齲飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)及5%蔗糖水;鼠齡25 d,口腔拭子檢測抑菌效果。鼠齡26～28 d,各組分別用無菌棉簽浸以1×106CFU/mL 濃度S.mutans菌懸液接種于35只大鼠口腔 (500 μL/只)。鼠齡29 d , 所有大鼠取口腔拭子檢測定菌效果。Control組飼以常規(guī)飼料及無菌蒸餾水。

1.5.3 藥物干預(yù) 鼠齡30～50 d , 用無菌棉簽蘸各組對應(yīng)實驗藥液 (1 mL/只) , 分別涂于大鼠磨牙各牙面及口腔黏膜(15 s/象限),余液注入口腔,以確保藥液充分發(fā)揮作用。2次/d(每天8點、20點),連續(xù)21 d。始終由同一人完成干預(yù),干預(yù)結(jié)束后禁食禁水30 min,每日稱重監(jiān)測大鼠的健康狀況。

1.5.4 樣本收集 鼠齡51 d 各組大鼠用10%水合氯醛麻醉,行腹主動脈取血后,給予安樂死。無菌解剖頜骨組織,編號后置于包埋盒內(nèi),高壓蒸汽滅菌(121℃,15 min),去除頜骨周圍附著的牙齦等軟組織,左側(cè)上下頜磨牙標本用于Keyes評分,右側(cè)上下頜磨牙標本用于CLSM。取各組大鼠心、肝、脾、肺和腎等臟器,剝除臟器表面系膜,冰鹽水沖洗,用鹽水浸濕紗布拭去多余水分,稱重并記錄(精確至0.1 g),取口腔同側(cè)5 mm×5 mm頰黏膜,以上組織編號后于4%多聚甲醛溶液固定保存,用于HE染色。

1.6 指標的測定及評價

1.6.1S.mutans水平的測定 分別在鼠齡29、36、43及50 d 時采集各組大鼠口內(nèi)及磨牙牙面菌斑拭子,用BHI液體培養(yǎng)基倍比稀釋 (1∶1 000為稀釋梯度) , 取10 μL均勻涂于BHI瓊脂培養(yǎng)基 (總菌菌落數(shù)) 及MSBA培養(yǎng)基(S.mutans菌落數(shù)), 37℃厭氧培養(yǎng)12 h, 由兩人分別進行菌落計數(shù),計算S.mutans水平=(S.mutans菌落數(shù)/總菌落數(shù))×100%。比較各組間菌落水平,評價新疆桑白皮提取物對齲病的防治是否有效。

1.6.2 Keyes評分 取各組大鼠左側(cè)頜骨,沖洗干凈后用0.4%紫脲酸銨溶液中避光染色18 h,齲損處被紫脲酸胺染成紅色,紫脲酸銨滲入大鼠磨牙的范圍和深度作為齲損的進展范圍和嚴重程度。根據(jù)改良Keyes評分法[11-13]:齲齒進展為E級(釉質(zhì)表層)、Ds級(牙本質(zhì)淺層)、Dm級(牙本質(zhì)中層)以及Dx級(牙本質(zhì)深層)4個級別,用體式顯微鏡成像后,對磨牙光滑面齲損進行計分;將大鼠磨牙沿近遠中矢狀面切開暴露主溝,對窩溝齲損評分,評定不同藥物的抑齲情況。

1.6.3 CLSM檢測 取各組大鼠右側(cè)鼠磨牙沿牙冠近遠中矢狀面切割制成300 μm的牙磨片,37℃避光浸泡于0.1 mmol/L羅丹明B熒光染料24 h,采用CLSM觀察牙磨片的熒光情況,齲損程度越嚴重,穿透過牙磨片的染料越深,則熒光強度亦愈強。

1.6.4 大鼠體重及健康狀況的記錄 實驗期間定時測量各組大鼠體重,檢查大鼠的食物攝入量,注意大鼠毛發(fā)的光澤度等外觀特征,以此來判斷其健康狀況。

1.6.5 臟器系數(shù)的測定 取大鼠主要臟器(心、肝、脾、肺、腎),通過公式計算大鼠臟器系數(shù),臟器系數(shù)=臟器重量/大鼠體重×100%。

1.6.6 HE染色 取各組大鼠主要臟器及頰黏膜行HE染色,顯微鏡下呈像,觀察組織結(jié)構(gòu)有無改變。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS26.0統(tǒng)計學軟件,實驗數(shù)據(jù)若滿足正態(tài)性和方差齊性,采用單因素方差分析,采用LSD法進行兩兩比較;非正態(tài)分布采用Kruskal-Wallis秩和檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠S.mutans水平的比較鼠齡29 d, 與CA組比較,各實驗組S.mutans水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 提示各組均成功接種了S.mutans菌懸液[14]。鼠齡36、43 d,與CA組比較,新疆桑白皮提取物高劑量組S.mutans水平降低,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。鼠齡50 d, 與CA組比較,新疆桑白皮提取物高、中劑量組S.mutans水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖 1。

注： 鼠齡29、50 d的數(shù)據(jù)記為平均值±標準差鼠齡36、45 d的數(shù)據(jù)記為中位數(shù)(IQR)。與桑白皮高劑量組比較,aP<0.05; 與桑白皮中劑量組比較, bP<0.05; 與桑白皮低劑量組比較, cP<0.05; 與CHX組比較, dP<0.05; 與CA組比較, eP<0.05。

2.2 各組大鼠Keyes評分比較CA組磨牙光滑面及窩溝處的顏色改變較其他各組更明顯,見圖2。與CA組比較,新疆桑白皮提取物高、中劑量組磨牙光滑面及窩溝處各級齲損Keys評分均降低,新疆桑白皮提取物低劑量組磨牙光滑面、E級、Ds級、Dm級評分均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

注: 不同顏色的箭頭指向不同程度的齲損;X線片紅色箭頭記為齲損。

注： Surface: 光滑面齲; E: 釉質(zhì)齲; Ds: 牙本質(zhì)淺層齲; Dm: 齲損程度在牙本質(zhì)深度的3/4以內(nèi); Dx: 齲損程度在牙本質(zhì)深度的4/3或全層。Surface、E、Ds、Dm 數(shù)據(jù)記為平均值±標準差數(shù)據(jù)記為中位數(shù)(IQR)。與桑白皮高劑量組比較,aP<0.05; 與桑白皮中劑量組比較, bP<0.05; 與桑白皮低劑量組比較, cP<0.05; 與CHX組比較, dP<0.05; 與CA組比較, eP<0.05。

2.3 各組大鼠牙磨片CLSM檢測在CA組牙磨片中可觀察到釉質(zhì)連續(xù)性中斷,熒光強度及滲透深度均比其他組強,見圖4A。與CA組比較,桑白皮高劑量組和CHX 組滲透入釉質(zhì)或牙本質(zhì)的熒光量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4B。

注：黃色箭頭表示因齲損產(chǎn)生的牙釉質(zhì)表面凹坑及孔隙增寬后的熒光滲透。與桑白皮高劑量組比較,aP<0.05; 與桑白皮中劑量組比較, bP<0.05; 與桑白皮低劑量組比較, cP<0.05; 與CHX組比較, dP<0.05; 與CA組比較, eP<0.05。

2.4 各組大鼠體重及健康狀況在實驗過程中,各組大鼠健康狀況良好, 無死亡個體, 大鼠體重的生長趨勢相似,見圖5。

圖5 干預(yù)期間各組大鼠體重變化圖

2.5 各組大鼠臟器系數(shù)比較與CA組比較,新疆桑白皮提取物中劑量及CHX組心臟臟器系數(shù)增大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖6。

圖6 各組大鼠臟器系數(shù)比較

2.6 各組大鼠主要臟器及頰黏膜HE染色情況各組大鼠主要臟器及頰黏膜HE染色切片均勻,組織學結(jié)構(gòu)未見明顯改變,見圖7。

圖7 各組大鼠主要臟器及頰黏膜HE染色圖(×10倍)

3 討論

目前已有多種天然藥材被證實具有防齲效果,桑白皮是一種具有悠久用藥歷史的天然藥材,在多個文獻中提到具有抗菌抗炎的功效[15-18]。但其在口腔健康領(lǐng)域的應(yīng)用探究還未見報道。因此,本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上通過動物實驗進一步驗證了新疆桑白皮提取物防齲有效性及安全性。

氯己定是為一種廣譜殺菌劑,濃度在0.12%～2%的氯己定溶液常被用于口腔疾病的防治,且治療效果顯著[19-20], 因此本實驗選擇濃度為0.12% CHX溶液作為陽性對照組的用藥。

根據(jù)唾液S.mutans水平的測定結(jié)果,提示新疆桑白皮提取物在一定程度上具有抑制S.mutans繁殖的潛力,但低劑量的新疆桑白皮提取物抗齲效果欠佳。結(jié)合Keyes評分結(jié)果,高、中劑量組新疆桑白皮提取物能有效降低光滑面及窩溝各級齲損,但效果不及氯己定,以上結(jié)果同CLSM觀察結(jié)果一致。心臟臟器系數(shù)結(jié)果顯示,與CA組比較,新疆桑白皮提取物中劑量組及CHX組心臟臟器系數(shù)增大,考慮是因為大鼠水合氯醛麻醉后腹主動脈取血安樂死時, 大鼠心臟內(nèi)部分血液未完全流出, 致組間臟器重量有差異。而在整個實驗過程中,新疆桑白皮提取物未表現(xiàn)出明顯的毒副作用。

綜上所述,新疆桑白皮提取物具有一定的抗齲作用,且毒副作用低,具有成為抗齲劑的潛力,為新疆桑白皮提取物的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。