基于網絡藥理學和動物實驗探究桑寄生對牙周炎的防治作用

馮 凱, 張文杰, 吳澤鈺,3, 姬曉煒, 趙 今,3

(1新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院)牙體牙髓病科, 2口腔修復種植科; 3新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所, 烏魯木齊 830054)

牙周炎(Periodontitis)又稱為破壞性牙周病,是由菌斑微生物侵犯牙周組織引起的慢性炎癥,可導致牙周支持組織破壞和牙槽骨吸收[1]。研究表明組織破壞是宿主對細菌毒力因子的免疫炎癥反應激活的結果[2]。使用安全有效的藥物控制菌斑微生物,調節過度的宿主免疫反應,限制牙周支持組織的破壞,是牙周炎藥物治療成功的關鍵。近年來中草藥因藥理活性好、副作用少等優點備受關注[3-4]。研究發現多種天然藥物具有抑制牙周病致病菌的生長、控制炎癥、促進組織再生的作用,在治療牙周病方面卓有成效[5-6]。桑寄生為桑寄生科植物桑寄生[Taxilluschinensis(DC.)Danser]干燥帶葉的莖枝,具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎等功效[7]。近年來對桑寄生藥理作用的相關研究顯示其在抗炎、抗骨質疏松等方面具有良好的功效,臨床上主要用于骨關節炎及骨質疏松癥的治療[8],其中主要成分槲皮素已被研究證實對實驗性大鼠牙周炎具有一定的治療效果[9]。本研究基于網絡藥理學分析探究桑寄生治療牙周炎的有效成分、作用靶點和信號通路,通過抑菌及動物實驗探究桑寄生乙醇提取物對牙周炎的防治作用,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥桑寄生(廣東匯群中藥飲片股份有限公司,批號:20230101);組織RNA保存液(北京索萊寶科技有限公司,批號:SR0020);DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:DA1010);4%多聚甲醛組織固定液(北京蘭杰柯科技有限公司,批號:BL539A);EDTA脫鈣液(北京蘭杰柯科技有限公司,批號:BL616B);Trizol試劑(美國Ambion公司,批號:15596026CN);cDNA逆轉錄試劑盒(美國TaKaRa公司,批號:RR047A);PCR試劑盒(美國TaKaRa公司,批號:RR820A);IL-6、TNF-α、MMP-9ELISA試劑盒(美國Elabscience公司,批號:E-EL-R0015、E-EL-R2856、E-EL-R3021);OCN、RUNX2 Antibody(英國BOSTER公司,批號:PB9920、M00442);Goat Anti Rabbit IgG HRP二抗(美國Affinity Biosciences公司,批號:S0001)。

1.2 儀器組織研磨儀(上海凈信實業發展有限公司); PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司);Multiskan GO酶標儀、NaNo-DROP1000核酸蛋白測定儀、熒光定量PCR擴增儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 菌株P.g國際標準菌株 ATCC 33277(北京生物保藏中心)。

1.4 實驗動物42只雄性SPF-SD大鼠,6～8周齡,購自新疆醫科大學醫學動物實驗中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(新)2020-0002。本研究通過新疆醫科大學實驗動物倫理委員會審批(批號:IACUC-20230627-12)。

1.5 桑寄生治療牙周炎的網絡藥理學分析及分子對接驗證

1.5.1 桑寄生有效成分及靶點的篩選與預測以及牙周炎靶點的獲取 通過TCMSP數據庫中檢索得到桑寄生的有效化學成分及相關靶點(OB≥20%、DL≥0.18),經Swiss Target Prediction數據庫預測桑寄生有效成分的治療作用靶點。在Gene Cards、Dis Ge NET和OMIM數據庫中檢索得到牙周炎相關靶點,經 Venny分析獲得共同靶點。

1.5.2 構建PPI網絡并篩選關鍵靶點 將桑寄生治療牙周炎的共同靶點導入STRING數據庫(物種為“Homo sapiens”,置信度得分>0.4)構建PPI網絡。利用Cytoscape 3.10.0軟件將PPI網絡可視化分析,采用Cytohubb插件選取MCC評分前10的基因建立核心靶點網絡。

1.5.3 GO功能和KEGG通路富集分析 采用DAVID數據庫對共同靶點進行GO的生物過程(Biological process, BP)、細胞成分(Cellular component, CC)、分子功能(Molecular function, MF)富集分析及KEGG通路富集分析,設置FDR<0.001,以P<0.001為篩選條件,繪制氣泡圖。

1.5.4 桑寄生“藥物-成分-靶點-通路”網絡的構建與分析 將篩選得到的藥物有效成分、作用靶點、信號通路導入Cytoscape 3.10.0軟件中,繪制桑寄生“藥物-成分-靶點-通路”網絡。

1.5.5 桑寄生有效成分與關鍵靶點的分子對接驗證 PDB數據庫中下載關鍵靶點的3D結構文件,應用PyMOL軟件進行結構預處理。Pub Chem數據庫中下載桑寄生有效成分的mol2結構文件。將處理好的結構文件導入 Auto Dock Tools軟件轉換為pdbqt格式,應用Auto Dock Vina軟件進行分子對接,對分析結果進行可視化處理[10]。

1.6 桑寄生乙醇提取物對P.g的生長抑制作用

1.6.1 桑寄生乙醇提取物及藥液制備 將200 g桑寄生藥材用80%乙醇依次以料液比1∶10、1∶8、1∶6回流提取3次,每次1.5 h,合并3次濾液,將濾液旋轉蒸發濃縮并冷凍干燥(-80℃),獲得桑寄生乙醇提取物粉末。將桑寄生乙醇提取物粉末溶于含1% DMSO 的BHI液體培養基中,配制成濃度為8 g/L的母液。

1.6.2P.g菌液的制備 將P.g菌株接種于BHI瓊脂血平板上,37℃恒溫厭氧培養5～7 d,待表面長出褐色菌落后,挑取直徑約1 mm的單個菌落接種于BHI液體培養基中,培養至對數期,調整菌液濃度至2×107cfu/mL備用。

1.6.3 桑寄生乙醇提取物對P.g的MIC和MBC的測定 實驗組采用二倍稀釋法將8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.062 5 g/L的桑寄生藥液與“1.6.2”項下P.g菌液各1 mL混合均勻,使細菌終濃度為1×107cfu/mL,每個濃度設置相同藥物濃度不含菌液的BHI培養基為對照組,37℃恒溫培養48 h。分別取各濃度實驗組及對照組培養物200 μL加入96孔板中,用酶標儀測定600 nm處吸光度(Optical density, OD)值,當實驗組與對照組OD值差別≤0.05時的最低藥物濃度即為桑寄生對P.g的MIC。從大于MIC濃度的實驗組中蘸取培養物,涂布于BHI瓊脂血平板上培養48 h,觀察菌落數少于5個的最低藥物濃度為桑寄生對P.g的MBC。

1.7 桑寄生乙醇提取物對實驗性大鼠牙周炎的治療作用

1.7.1 實驗性大鼠牙周炎模型的建立 取36只雄性SD大鼠,禁食水8 h后,全身麻醉下用浸有P.g菌液的4-0絲線結扎左上頜第一磨牙建立牙周炎模型。14 d后隨機拍攝空白組和模型組大鼠左上頜第一磨牙X線片。當模型組PD和SBI均大于空白組,X線片上模型組與空白組相比出現明顯的牙槽骨的吸收,表明建模成功。

1.7.2 實驗性牙周炎大鼠分組及藥物干預 取“1.7.1”項下建模成功的牙周炎大鼠36只,隨機分為溶劑組(甘油)、模型組、鹽酸米諾環素組(鹽酸米諾環素軟膏)、桑寄生高劑量組(2倍MIC濃度的桑寄生乙醇提取物甘油溶液)、桑寄生中劑量組(1倍MIC濃度的桑寄生乙醇提取物甘油溶液)、桑寄生低劑量組(1/2倍MIC濃度的桑寄生乙醇提取物甘油溶液),另取6只未建模大鼠為空白組。除空白組和模型組外,從造模第1天開始每天給予20 μL對應藥物局部涂抹結扎處,上藥后禁食水1 h,連續給藥14 d。

1.7.3 指標的記錄 將造模當天定為第0天,從第0天開始每日測量各組大鼠體重,從第1天開始每日測量各組大鼠的左上頜第一磨牙的牙周PD和SBI。記錄各組大鼠的體重、PD、SBI 。

1.7.4 樣本的采集 對各組大鼠全身麻醉腹主動脈采血5 mL,室溫靜置2 h,3 000 r/min,離心10 min收集血清。取血后,立即收集大鼠左側上頜骨,置于組織固定液中固定。將各組部分大鼠左上頜第一磨牙牙齦組織剝離,置于RNA保存液中。

1.7.5 RT-PCR檢測 取各組大鼠牙齦組織分別提取總RNA,按照逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA,按照PCR試劑盒說明書操作進行RT-PCR檢測。以GADPH作為內參基因,PCR產物應用相對Ct法(2-△△Ct)對IL-6、TNF-α、MMP-9、RUNX2、OCN、OPG、RANKL基因表達進行相對定量分析,引物信息見表1。

表1 引物信息

1.7.6 ELISA檢測 取各組凍存的血清按照ELISA試劑盒說明書操作步驟測定血清中IL-6、TNF-α、MMP-9的含量。

1.7.7 HE染色 將固定好的頜骨標本制作石蠟切片,按標準步驟HE染色、封片后,觀察牙周組織炎癥細胞浸潤情況。

1.7.8 免疫組織化學染色 將制作好的頜骨石蠟切片按標準步驟進行免疫組化染色、封片后,顯微鏡下觀察RUNX2、OCN蛋白表達情況。

2 結果

2.1 桑寄生治療牙周炎的網絡藥理學分析及分子對接驗證結果

2.1.1 桑寄生活性成分的篩選結果 將檢索得到桑寄生的46個化學成分根據篩選條件篩選后獲得4種活性成分,見表2。

表2 桑寄生4種主要活性成分及藥理參數

2.1.2 桑寄生治療牙周炎的潛在靶點 對桑寄生的4個活性成分進行檢索后得到545個相關藥物靶點,與檢索得到的4 151個牙周炎疾病相關靶點進行Venny分析后,獲得186個桑寄生治療牙周炎的潛在靶點,見圖1。

圖1 桑寄生-牙周炎共同靶點Venny圖

2.1.3 PPI網絡的構建并獲取 桑寄生治療牙周炎的關鍵靶點將共同靶點導入STRING數據庫構建PPI網絡圖(圖2A),以度值為篩選標準篩選出關鍵靶點30個(圖2B),通過MCC評分得到得分前10的核心靶點為:IL6、TNF、MMP9、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、低氧誘導因子1α(HIF1A)、胱天蛋白酶3(CASP3)、B淋巴細胞瘤2(BCL2)、腫瘤蛋白p53(TP53)、表皮生長因子受體(EGFR)、白細胞介素1β(IL1B),建立核心靶點網絡(圖2C)。

注: A. 桑寄生治療牙周炎靶點的PPI網絡圖; B. 桑寄生治療牙周炎的關鍵靶點; C. 桑寄生治療牙周炎的核心靶點。

2.1.4 GO功能和KEGG通路富集分析結果 利用DAVID數據庫對186個共同靶點進行GO及KEGG富集分析并繪制氣泡圖(圖3)。GO富集分析中BP相關條目涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、DNA模板轉錄的正調控等,CC相關條目涉及質膜、胞質溶膠、細胞質等,MF相關條目涉及蛋白質結合、相同蛋白質結合、酶結合等。KEGG富集得到的主要通路包括癌癥的發病途徑、人巨細胞病毒感染、PI3K-Akt信號通路等。

注: A. GO富集分析-BP; B. GO富集分析-CC; C. GO富集分析-MF; D. KEGG富集分析。

2.1.5 桑寄生“藥物-成分-靶點-通路” 網絡分析通過Cytoscape 3.10.0構建桑寄生“藥物-成分-靶點-通路”網絡圖(圖4),表明桑寄生中的多種有效成分可通過多條信號通路調節作用于多個靶點來達到潛在治療牙周炎的作用。

圖4 桑寄生“藥物-成分-靶點-通路”網絡圖

2.1.6 分子對接驗證結果 將部分桑寄生有效成分與篩選得到的10個關鍵靶點進行分子對接,結果見表3。對分子對接結果進行可視化處理后,部分分子對接模式圖如圖5所示。分析結果表明,桑寄生有效成分與部分關鍵靶點之間展現出良好的結合活性(結合鍵能<-5 kcal/mol)。

注: A. TNF與扁蓄苷分子對接模式; B. IL6與齊墩果酸分子對接模式; C. MMP9與槲皮素分子對接模式

表3 桑寄生有效成分與關鍵靶點結合能預測/(kcal/mol)

2.2 桑寄生乙醇提取物對P.g的MIC和MBC測定結果桑寄生乙醇提取物對P.g的生長具有一定的抑制和殺滅作用,實驗測得桑寄生乙醇提取物對P.g的MIC為0.5 g/L,MBC為2 g/L。

2.3 桑寄生乙醇提取物對實驗性大鼠牙周炎的治療作用效果

2.3.1 成功構建實驗性大鼠牙周炎模型 建模14 d后,隨機拍攝空白組和模型組大鼠左上頜第一磨牙X線片(圖6)。觀察發現模型組大鼠的牙槽骨與空白組相比出現明顯的吸收暗影,表明實驗性大鼠牙周炎模型構建成功。

空白組 模型組

2.3.2 各組大鼠的體重、PD、SBI的比較 在整個實驗周期內各組大鼠體重總體平穩增長。在14 d實驗干預結束后,與空白組比較,模型組和溶劑組大鼠PD和SBI升高,差異有統計學意義(P<0.05),模型組與溶劑組間無明顯差異(P>0.05),表明實驗所用溶劑甘油對大鼠牙周炎無明顯影響。與模型組比較,桑寄生高、中、低劑量組大鼠PD和SBI均降低,差異有統計學意義(P<0.05)。桑寄生高劑量組大鼠PD和SBI與鹽酸米諾環素組相比無明顯差異(P>0.05),見圖7。

注:A.體重變化曲線;B. PD變化曲線;C. SBI變化曲線。

2.3.3 各組大鼠牙齦組織中IL-6、TNF-α、MMP-9、RUNX2、OCN、OPG、RANKL mRNA的相對表達水平 與模型組比較,桑寄生高、中、低劑量組大鼠牙齦組織中IL-6、TNF-α、MMP-9、RANKL mRNA的表達降低,RUNX2、OCN、OPG mRNA的表達升高,差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸米諾環素組比較,桑寄生高劑量組大鼠牙齦組織中RANKL mRNA的表達無統計學差異(P>0.05),桑寄生中劑量組大鼠牙齦組織中MMP-9、RUNX2、OCN、OPG、RANKL mRNA的表達無統計學差異(P>0.05),見圖8。

注：與空白組比較, aP<0.05; 與溶劑組比較, bP<0.05; 與模型組比較, cP<0.05; 與鹽酸米諾環素組比較, dP<0.05; 與桑寄生高劑量組比較, eP<0.05; 與桑寄生中劑量組比較, fP<0.05; 與桑寄生低劑量組比較, gP<0.05。

2.3.4 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、MMP-9的表達情況 與模型組相比,桑寄生高、中、低劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α、MMP-9的表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與鹽酸米諾環素組相比,桑寄生高、中劑量組大鼠血清中TNF-α、MMP-9的表達無統計學差異(P>0.05),見圖9。

注：與空白組比較, aP<0.05; 與溶劑組比較, bP<0.05; 與模型組比較, cP<0.05; 與鹽酸米諾環素組比較, dP<0.05; 與桑寄生高劑量組比較, eP<0.05; 與桑寄生中劑量比較, fP<0.05; 與桑寄生低劑量組比較, gP<0.05。

2.3.5 各組大鼠牙周組織HE染色結果 空白組齦溝上皮組織結構完整,未見明顯角化,纖維排列整齊,無炎癥細胞浸潤,牙槽骨嵴無吸收。而溶劑組與模型組可以觀察到明顯的牙周組織破壞,可見異常角化上皮及大量炎性細胞浸潤,牙齦纖維結構紊亂并出現斷裂,牙槽骨嵴吸收明顯。與模型組相比,各濃度桑寄生藥物組能夠呈藥物濃度依賴性的緩解牙周炎癥細胞浸潤與組織破壞情況。各組大鼠牙周組織HE染色結果如圖10所示。

空白組

2.3.6 各組大鼠牙周組織RUNX2、OCN免疫組化染色結果 免疫組化染色陽性表現為胞漿內的黃褐色顆粒,各組大鼠牙周組織RUNX2、OCN免疫組化染色結果如圖11、12所示。與空白組比較,溶劑組與模型組牙周組織中RUNX2和OCN的表達量明顯降低。與模型組比較,各濃度桑寄生藥物組能夠呈濃度依賴性促進RUNX2、OCN的表達,桑寄生高劑量組促進效果最佳。

空白組

空白組

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法構建桑寄生治療牙周炎的成分靶點通路網絡,篩選出桑寄生治療牙周炎的主要成分、核心靶點以及相關通路。有研究表明桑寄生提取物表現出良好的抗炎活性,在治療骨關節炎和骨質疏松癥中還可發揮良好的骨保護作用[11]。桑寄生提取物還具有抑菌的藥理作用,黃思璐[12]在研究中發現桑寄生提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及青霉菌5種實驗菌株均展現出良好的抑菌活性。本研究結果證明桑寄生乙醇提取物對P.g有良好的抑菌活性。

通過PPI網絡分析發現桑寄生有效成分治療牙周炎的核心靶點包括IL6、TNF、MMP9等10個核心靶點,分子對接結果表明以上靶點與桑寄生的有效成分具有良好的結合能力。TNF-α和IL-6作為重要的炎癥因子,能夠介導炎癥反應,導致牙周組織的破壞并抑制其修復[13]。IL-6和TNF-α可以參與并介導多種信號通路誘導,多種類型的細胞表達以及破骨細胞分化因子,促使破骨細胞的形成,同時抑制成骨細胞的分化,導致骨吸收[14]。有研究發現TNF-α可誘導IL-6的表達,激發炎癥級聯反應,而 IL-6又可與TNF-α協同誘導增加破骨細胞前體的數量,促進破骨細胞前體分化為成熟的破骨細胞發揮作用[15]。MMP-9是一種蛋白水解酶,研究表明其表達與牙周炎活動期牙周組織損傷有關[16],可通過降解牙周組織細胞外基質,激活破骨細胞引起骨吸收,從而破壞牙周支持組織[17]。本研究發現桑寄生乙醇提取物能夠明顯降低牙周炎大鼠牙齦組織以及血清中IL-6、TNF-α、MMP-9的表達,HE染色結果也證明桑寄生乙醇提取物可明顯緩解牙周炎大鼠牙周支持組織炎癥浸潤以及組織破壞情況。Shen等[18]在研究中發現桑寄生主要成分槲皮素可降低關節炎小鼠IL-6、TNF-α的分泌,洪麗萍等[19]也在研究中發現桑寄生總黃酮可降低IL-6、TNF-α水平,馮海洋等[20]研究發現桑寄生提取物能夠下調MMP-9的表達,本研究結果與相關研究結果一致。

KEGG通路富集分析結果表明PI3K-Akt等信號通路是桑寄生治療牙周炎發揮作用的關鍵通路。PI3K-Akt信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡過程中發揮重要作用。多項研究表明PI3K-Akt信號通路及其下游靶蛋白與骨組織代謝之間存在密切關系[21]。RUNX2和OCN是參與成骨細胞分化成熟的重要基因,RUNX2是早期參與誘導成骨細胞分化成熟的激活劑,OCN主要參與基質礦化的過程,可作為成骨細胞成熟的標志[22]。OPG和RANKL與破骨細胞的激活與分化密切相關,RANKL是破骨細胞生成的重要因素,而OPG可與RANKL競爭性結合,阻斷破骨細胞分化與激活,從而減輕骨吸收,因此RANKL/OPG比值對于評價骨吸收程度具有重要意義[23-24]。已有研究表明桑寄生提取物及其主要成分槲皮素均可通過調節OPG、RANKL的表達治療骨質疏松癥[11, 25]。本研究證明桑寄生乙醇提取物能夠促進牙周炎大鼠牙齦組織中RUNX2、OCN、OPG mRNA的表達,并且能夠抑制RANKL mRNA的表達,免疫組化染色結果顯示桑寄生提取物能夠促進牙周炎大鼠牙齦組織中RUNX2、OCN蛋白的表達,這表明桑寄生乙醇提取物可通過調節牙周炎大鼠局部骨穩態,從而緩解牙周骨組織破壞。

綜上所述,本研究證明桑寄生可通過多組分、多靶點、多通路的協同作用治療牙周炎,桑寄生乙醇提取物對P.g具有一定的抑制和殺滅作用,并可通過減輕炎癥反應、調節骨穩態對實驗性大鼠牙周炎產生一定的治療作用。