SOX7基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在缺氧條件下對HUVECs增殖與遷移功能的影響

吳逸卓, 黃俊鑫, 丁曉維, 于 昱

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心血管發(fā)育與再生醫(yī)學(xué)研究所, 上海 200092)

SOX轉(zhuǎn)錄因子家族在1990年由于哺乳動(dòng)物Y染色體性別決定區(qū)(Sex determining region of Y,SRY)中HMG盒的高度保守性而首次被發(fā)現(xiàn)[1]。按照基因構(gòu)成和功能可分為9個(gè)家族(A、B1、B2、C、D、E、F、G、H)[2]。其中SOX7通常在轉(zhuǎn)錄水平上參與胚胎脈管系統(tǒng)的發(fā)育[3]。在E7.5的小鼠胚胎中,SOX7+的細(xì)胞占內(nèi)皮前體細(xì)胞中ETV2+/FLK1+/CD41-細(xì)胞的97%,說明SOX7可能是早期血管發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子[4]。在動(dòng)脈粥樣硬化病變早期,血管內(nèi)膜增厚,出現(xiàn)缺氧環(huán)境,血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生改變[5],而SOX7是內(nèi)皮相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控血管功能。研究顯示,SOX7突變體斑馬魚的脈管系統(tǒng)出現(xiàn)顯著的血管異位連接[6]。在高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中,SOX7促進(jìn)血管形成異常[7]。因此,SOX7與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的聯(lián)系有待深入探索。本研究通過構(gòu)建SOX7穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,分析缺氧條件下SOX7對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)功能的影響,以期進(jìn)一步探究SOX7對動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人胚腎細(xì)胞系(293T細(xì)胞)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVECs)、pcDNA3.1(+)-SOX7質(zhì)粒、pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen慢病毒過表達(dá)載體(以下簡稱pHAGE空載體)及相關(guān)輔助質(zhì)粒(psPAX2和pMD2.G)由新華醫(yī)院心血管發(fā)育與再生醫(yī)學(xué)研究所保存。

1.2 試劑與儀器NheI-HF(貨號(hào):R3131V)、NotI-HF(貨號(hào):R3189V)均購自美國NEB公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(離心柱型)(貨號(hào):DP118-02)、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(離心柱型)(貨號(hào):DP117)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(增強(qiáng)型)(貨號(hào):DP219-02)均購自天根生化科技(北京)有限公司;ClonExpress II One Step Cloning Kit(貨號(hào):C112-01)、Ultra Gelred(貨號(hào):GR501-AA)、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(貨號(hào):Q411-02)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Agarose(Low EEO)(貨號(hào):ST004Q)、BeyoPureTMLB Broth with Agar(premixed powder)(貨號(hào):ST158)、BeyoPureTMLB Broth(premixed powder)(貨號(hào):ST156)、Ampicillin(100 mg/mL,1 000×)(貨號(hào):ST008)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號(hào):A0208)、CCK-8試劑盒(貨號(hào):C0039)、polybrene(貨號(hào):C0351)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;高糖DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào):L110KJ)、0.25%胰酶EDTA溶液(貨號(hào):S310KJ)購自上海源培生物科技股份有限公司;SOX7 Polyclonal antibody(貨號(hào):23925-1-AP)、GAPDH Monoclonal antibody(貨號(hào):60004-1-Ig)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Stbl3感受態(tài)細(xì)胞(新賽美生物,貨號(hào):MC012);PEI 250000(美國,Polysciences公司,貨號(hào):24314-2);胎牛血清(以色列,BI公司,貨號(hào):04-001-1ACS);PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(貨號(hào):RR036A)、RNAiso Plus(貨號(hào):9109)購自日本TaKaRa公司。超凈工作臺(tái)(型號(hào):51900900)、三氣培養(yǎng)箱(型號(hào):51033781)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;熒光顯微鏡(德國,ZEISS公司,型號(hào):Axio Vert.A1);梯度PCR儀(型號(hào):C1000)、熒光定量PCR儀(型號(hào):CFX96)、垂直電泳儀(型號(hào):1658000)、膜轉(zhuǎn)移裝置(型號(hào):1703930)、化學(xué)發(fā)光成像儀(型號(hào):12003154)均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;高速離心機(jī)(德國,Eppendorf公司,型號(hào):5424R);多功能酶標(biāo)儀(瑞士,TECAN公司,型號(hào):spark)。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建SOX7過表達(dá)載體 使用限制性內(nèi)切酶NheI-HF和NotI-HF雙酶切pHAGE空載體,通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒得到線性的載體骨架。以pcDNA3.1(+)-SOX7和pHAGE載體為模版設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增SOX7。SOX7引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。使用Clon Express II One Step Cloning Kit進(jìn)行同源重組后轉(zhuǎn)化涂板。挑克隆搖菌,測序得到正確的重組載體。

表1 PCR引物序列設(shè)計(jì)

1.3.2 慢病毒包裝及濃縮使用 PEI250000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。以10 cm培養(yǎng)皿為例,500 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中加入9 μg質(zhì)粒(穿梭質(zhì)粒∶psPAX2∶pMD2.G =3∶2∶1比例),另取500 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基加入27 μL PEI250000(濃度為1 μg/μL),靜置5 min。將兩者混勻,繼續(xù)靜置15 min,加入培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染后6 h換液,在48 h、72 h時(shí)取上清,使用0.45 μm濾網(wǎng)過濾。加入10% PEG6000混勻,4℃靜置1.5 h,每20 min上下顛倒。預(yù)冷離心機(jī),8 000 r/min,離心10 min。去除上清,使用無血清DMEM重懸沉淀,分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 慢病毒感染HUVEC 取對數(shù)生長期的HUVECs接種至10 cm培養(yǎng)皿中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)50%時(shí),分別加入濃縮后的pHAGE慢病毒懸液和SOX7-pHAGE慢病毒懸液,各100 μL,同時(shí)各加入8 μL polybrene,感染24 h后換液。感染后48～72 h在激發(fā)波長為488 nm的熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光。以上步驟重復(fù)數(shù)次,直至可觀測到綠色熒光。

1.3.4 qPCR檢測mRNA表達(dá)水平 將細(xì)胞接種至6孔板中,用RNAiso PLUS提取RNA并測定濃度。取1 μg的RNA和5 μL 5×PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time),DEPC水補(bǔ)足至10 μL,按照設(shè)定程序在PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR體系:ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(5 μL)、10 μmol/L的Primer-F和Primer-R各0.2 μL、DEPC水(5.4 μL)、未稀釋的cDNA(1 μL),按照設(shè)定程序在PCR儀進(jìn)行熒光定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 免疫印跡(Western blot)檢測 蛋白表達(dá)水平將細(xì)胞接種至6孔板中,使用放射免疫沉淀蛋白裂解液提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。使用10%聚丙烯酰胺凝膠于80 V恒壓電泳,直至溴酚藍(lán)電泳至凝膠底部,后250 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min。室溫,5%BSA溶液封閉75 min,TBST洗膜5 min×3次,加入一抗,4℃孵育14～16 h,第二天使用TBST洗膜5 min×3次,加入二抗,室溫孵育1 h。繼續(xù)使用TBST洗膜5 min×3次后,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.3.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HUVECs,用胰酶(0.25%)37℃消化,對細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù),并稀釋至2.5×105個(gè)/mL。在6孔板每孔中接種2 mL細(xì)胞懸液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞密度達(dá)100%。次日,使用同一槍頭在培養(yǎng)皿底部劃痕,PBS洗4次,清除漂浮細(xì)胞,加入無血清DMEM,分別置于37℃、5%CO2和37℃、5%CO2、1%O2培養(yǎng)箱培養(yǎng),0、24 h拍照記錄。劃痕結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 根據(jù)梁慧敏等[8]的研究結(jié)果,本研究以48 h為節(jié)點(diǎn)研究缺氧條件下SOX7對HUVECs增殖功能的影響。取對數(shù)生長期的HUVECs,用胰酶(0.25%)37℃消化,對細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)后稀釋至2×104個(gè)/mL,96孔板每孔接種100 μL,分別置于37℃、5%CO2和37℃、5%CO2、1%O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。去除原培養(yǎng)液,PBS清洗,加入100 μL含10%CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基,在原培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育1 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm處測定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1SOX7重組慢病毒載體的構(gòu)建通過對PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物進(jìn)行電泳,可看到長度分別為7 724 bp的載體片段條帶和1 167 bp的SOX7基因條帶,見圖1。SOX7-pHAGE重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果證實(shí),SOX7基因成功插入至限制性內(nèi)切酶NotI位點(diǎn)(GCGGCCGC)和NheI位點(diǎn)(GCTAGC)之間,見圖2、3。

注： A, pHAGE空載體雙酶切產(chǎn)物膠圖; B, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠圖。

圖2 SOX7-pHAGE重組質(zhì)粒圖譜

圖3 SOX7-pHAGE重組質(zhì)粒的DNA測序峰圖

2.2SOX7重組慢病毒載體mRNA和蛋白表達(dá)的驗(yàn)證與pHAGE空載體的SOX7比較,SOX7- pHAGE重組質(zhì)粒在mRNA水平上顯著升高約111.4倍(P=0.002 8),在蛋白質(zhì)水平上出現(xiàn)過表達(dá)條帶。空載體未檢測出條帶,而SOX7- pHAGE重組質(zhì)粒檢測到清晰條帶,見圖4。

注:A,qPCR檢測SOX7 mRNA表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖; B, Western blot檢測SOX7蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 構(gòu)建SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株在激發(fā)波長為488 nm處的熒光顯微鏡下可觀察到SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株發(fā)出綠色熒光,見圖5。qPCR和Western blot結(jié)果顯示,SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株中SOX7在mRNA水平上顯著升高68.2倍(P=0.003 0),在蛋白水平上顯著升高1.7倍(P=0.004 3),SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞系構(gòu)建成功,見圖6。

圖5 慢病毒感染HUVECs后的熒光表達(dá)結(jié)果(40×)

注：A,qPCR檢測SOX7 mRNA表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖; B,Western blot檢測SOX7蛋白表達(dá)電泳圖;與空載體穩(wěn)定感染細(xì)胞株比較,P=0.003 0,P=0.004 3。

2.4 缺氧條件下SOX7對HUVECs遷移的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在缺氧條件下,空載體穩(wěn)定感染細(xì)胞株的遷移能力降低至常氧條件的0.88倍(P=0.007 6),而SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株則可改善細(xì)胞的遷移能力,使其增強(qiáng)約1.2倍(P=0.004 4)。在常氧條件下,空載體穩(wěn)定感染細(xì)胞株與SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株對遷移能力無影響(P>0.999 9),見圖7。

注:A-B,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖;與pHAGE空載體比較,P=0.007 6, P=0.004 4。

2.5 缺氧條件下SOX7對HUVECs增殖的影響在缺氧條件下,空載體穩(wěn)定感染細(xì)胞株的增殖能力減弱至常氧水平的0.7倍(P=0.007 6),而SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株可以回補(bǔ)細(xì)胞增殖能力,使增殖能力增強(qiáng)1.4倍(P=0.022 8)。在常氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株可促進(jìn)細(xì)胞增殖,與空載體穩(wěn)定感染細(xì)胞株比較增加1.3倍(P=0.008 7),見圖8。

圖8 SOX7對HUVECs增殖的影響

3 討論

SOX7定位于8p23.1,在各類生物的基因組中具有高度保守性[9]。除調(diào)控血管發(fā)育和維持血管功能外,SOX7在其他領(lǐng)域中也有許多重要的發(fā)現(xiàn)。在乳腺癌[10]、前列腺癌[11]中SOX7表達(dá)水平下調(diào),可作為腫瘤抑制因子及重要的腫瘤標(biāo)志物。在人肺癌相關(guān)細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中,SOX7通過上調(diào)P38和凋亡途徑相關(guān)的基因來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)SOX7也可抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中促凋亡蛋白的降解[12]。除此之外,SOX7在胚胎發(fā)育(特別是心血管系統(tǒng)的發(fā)育)中也具有重要作用。有研究顯示,SOX7單倍體功能不全導(dǎo)致先天性膈疝發(fā)生,而缺失SOX7的第二外顯子后胚胎在膈肌發(fā)育前死亡,并伴有心包囊擴(kuò)張和卵黃囊異常重塑[13]。小鼠胚胎從E7.5發(fā)育至E10.5,胚胎出現(xiàn)了廣泛的血管發(fā)育異常[14]。在心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞中特異性敲除SOX7使心內(nèi)膜墊發(fā)育不良,引起房室間隔缺損[15]。SOX7也促進(jìn)心肌致密化,參與冠狀動(dòng)脈發(fā)育[16]。

本研究通過構(gòu)建SOX7-pHAGE重組質(zhì)粒和SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株,為研究動(dòng)脈粥樣硬化中SOX7調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能提供了理論基礎(chǔ)。在肺癌細(xì)胞中,過表達(dá)SOX7后細(xì)胞的遷移和增殖能力減低[17],而在乳腺癌細(xì)胞中,缺失SOX7后細(xì)胞的遷移和增殖能力增加[10]。SOX7在不同腫瘤細(xì)胞中可抑制細(xì)胞增殖和遷移能力,但涉及內(nèi)皮細(xì)胞尤其是缺氧造模的疾病模型下的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。因此,本研究重點(diǎn)關(guān)注SOX7對缺氧情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移能力的影響。結(jié)果顯示,在常氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株對其遷移能力沒有影響,但促進(jìn)了細(xì)胞增殖能力。這與Xu等[10]的研究結(jié)果一致。而在缺氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株可有效回補(bǔ)HUVECs的遷移和增殖能力,改善血管功能。

綜上所述,本研究構(gòu)建了SOX7- pHAGE重組質(zhì)粒和SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株。發(fā)現(xiàn)在常氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株可促進(jìn)HUVECs的增殖能力;在缺氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細(xì)胞株可回補(bǔ)HUVECs被抑制的遷移和增殖能力,這為研究SOX7在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能提供了細(xì)胞層面的依據(jù)。但本研究僅限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),對SOX7在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制仍需進(jìn)行深入的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。