CH25H 調控細胞自噬和凋亡對喉鱗狀細胞癌進展影響

熊華才 許雨欣 鄔振華 胡丹飛 李群 項振飛

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是最常見的類型，約占90%[1]。喉部主要生理功能是吞咽、呼吸和發音，喉癌主要通過手術切除、聯合術前或術后化療、放療等綜合治療方式治療。雖然目前臨床已對喉癌的治療做了大量研究，但喉癌發病率和死亡率依舊較高。在癌癥發展過程中癌細胞存在自噬和凋亡現象[2]。細胞凋亡是一種阻止癌細胞存活的程序性細胞死亡途徑，而自噬通過清除受損的細胞器、蛋白質以及限制細胞生長，從而抑制惡性腫瘤發展，凋亡和自噬是常見的腫瘤抑制機制[3]。

膽固醇25-羥化酶（cholesterol 25-hydroxylase，CH25H）是一種催化膽固醇氧化形成可溶性產物25-羥基膽固醇（25-hydroxycholesterol，25-HC）的酶，參與脂質代謝。也有研究表明，CH25H 在炎癥和免疫應答中發揮多種功能[4]。CH25H 在黑色素細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和膽管癌等惡性腫瘤中發揮重要作用。在黑色素細胞瘤患者的外周血WBC 中觀察到CH25H 丟失，這與轉移和低生存率相關[5]。但CH25H 在LSCC 中的表達模式、腫瘤相關作用及分子機制目前尚不清楚。本研究旨在探討CH25H 在LSCC中的生物學作用和調控機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF 級4 周齡的BALB/c 雄性裸鼠24 只，體重20～25 g，購自杭州醫學院實驗動物中心[動物許可證號：SYXK（浙）2019-0011]，普通飼料喂養。本動物實驗方案經浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會審查通過（批準文號：ZJCLA-IACUC-20040153）。人口腔角質形成細胞（HOK）以及人LSCC 細胞系TU-177、AMC-HN-8 購自上海雅吉生物科技公司，FDLSC-1 購自南京萬木春生物科技公司，過表達慢病毒購自上海吉瑪基因生物科技公司，Dulbecco 改良的Eagle 培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（批號：C11995500BT，規格：500 mL）和FBS（批號：10091148，規格：500 mL）均購自美國Gibco 公司，RIPA裂解液（批號：20-188，規格：100 mL）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（批號：C3117，規格：0.45 μm）購自美國Millipore 公司，二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）試劑盒（批號：P0010S，規格：200次）、Trizol 試劑盒（批號：R0016，規格：100 mL）購自上海碧云天生物技術有限公司，聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）預制膠（批號：PG42015-S，規格：10塊）購自北京索萊寶生物科技公司，實時熒光定量PCR 試劑盒（批號：RR820A，規格：200 次）購自日本TaKaRa 公司，蛋白抗體CH25H（批號：sc-293256，規格：100 μL）購自上海玉博生物科技有限公司，B 淋巴細胞瘤-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）（批號：3498T，規格：20 μL）、Bcl-2 關聯X 蛋白（Bax）（批號：2772T，規格：20 μL）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）（批號：9662S，規格：100 μL）、裂解的caspase-3（C-caspase-3）（批號：9664T，規格：20 μL）、β 肌動蛋白（β-actin）（批號：4970T，規格：20 μL）、微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3（LC3）Ⅰ、LC3Ⅱ（批號：3868T，規格：20 μL），Beclin-1（批號：3738S，規格：100 μL）、p62（批號：5114T，規格：20 μL）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）（批號：9271T，規格：20 μL）、磷酸化Akt（p-Akt）（批號：4060T，規格：20 μL）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）（批號：4292S，規格：100 μL）和磷酸化PI3K（p-PI3K）（批號：4228T，規格：20 μL）均購自美國CST 公司，聚凝胺（批號：BL628A，規格：500 μL）購自中國蘭杰柯科技有限公司；自動細胞計數儀（型號：TC10）購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 細胞培養和轉染 在含10%FBS 的DMEM 培養基中培養HOK、FD-LSC-1、TU177、AMC-HN-8 細胞，細胞均在37 ℃、5%CO2條件下培養。通過5 μg/mL 聚凝胺介導慢病毒轉染LSCC 細胞株并用嘌呤霉素篩選出穩定表達CH25H 的轉染細胞株AMC-HN-8/CH25H。慢病毒空白載體AMC-HN-8/Mock 作為對照，未做轉染處理為AMC-HN-8。使用自動細胞計數儀進行細胞計數。

1.3 LSCC 移植瘤動物模型的構建和觀察 采用隨機數字表法將裸鼠分為AMC-HN-8 組、AMC-HN-8/Mock 組、AMC-HN-8/CH25H 組，每組8 只。取AMCHN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 組對數生長期細胞，經胰酶消化，重新細胞計數，使細胞懸浮液濃度調整至2.0×107個/mL，各取0.5 mL 細胞懸浮液依次接種于3 組裸鼠右側腋下，每天檢查裸鼠瘤體生長情況，瘤體長出為造模成功。每隔1 周用游標卡尺測量裸鼠右側腋下原位腫瘤的長徑（L）與短徑（W），計算原位腫瘤的近似體積（V），V=0.5×（L×W2）。接種5 周后，斷頸處死裸鼠切取原位腫瘤，測定重量并切取部分腫瘤用于后續實驗。

1.4 CH25H mRNA 表達水平檢測 采用Trizol 法提取細胞總RNA，經反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA。反應參數:95 ℃預變性5 min，96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35 個循環。引物序列如下，CH25H-F：5'- GGCATACCAAGTGTC-CTTCTAAGC-3'；CH25H-R: 5'-AACACCCTACACCCAGATTCCTC-3'；βactin-F：5'-CAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAG-3'；βactin- R：5'- CGCAACTAAGTCATAGTCCGCCTAG- 3'。以β-actin 為內參，使用2-ΔΔCt法計算CH25H mRNA 相對表達水平。

1.5 CH25H、Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達的檢測 采用Western blot 法。RIPA 裂解液提取AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H組LSCC 細胞和裸鼠瘤體組織總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE。采用濕轉法轉膜，5%脫脂牛奶（TBST 溶解）37 ℃封閉1 h。將PVDF 膜置于CH25H、Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和β-actin 一抗溶液（1∶2 000）4 ℃過夜，PBST 洗膜（6×5 min）；將膜置于辣根過氧化物酶結合的二抗溶液（1∶5 000）中37 ℃孵育1.5 h，PBST 洗膜（6×5 min）后，化學發光顯色劑顯色，凝膠成像系統曝光成像，結果以相對灰度值表示。

1.6 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術檢測。收集AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H組轉染24、48、72 h 后的LSCC 細胞，根據試劑盒說明書使用Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒分析細胞凋亡，1 000×g 離心后棄上清液，加入195 μL 結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 染色液，避光孵育15 min后上機檢測細胞凋亡率。

1.7 細胞自噬檢測 采用免疫熒光法。將AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 組LSCC 細胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，然后用0.1%Triton X-100 4 ℃滲透細胞10 min。用含有2%FBS 白蛋白的PBS 在室溫下飽和1 h 后，用LC3Ⅱ一抗抗體進行免疫熒光處理，然后用Alexa Fluor 488 偶聯免疫球蛋白和DAPI 進行免疫熒光處理。采用Olympus Fluoview 1000共聚焦顯微鏡觀察自噬蛋白LC3Ⅱ熒光染色情況。

1.8 統計學處理 采用GraphPad Prism 9.0 統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HOK 與LSCC 細胞CH25H mRNA 的相對表達水平比較 相較HOK 正常細胞，FD-LSC-1、TU177、AMC-HN-8 3 種LSCC 細胞中CH25H 相對表達水平均明顯下調（均P＜0.05），其中AMC-HN-8 水平最低，見圖1，選取其進行后續實驗。

圖1 HOK 和LSCC 細胞系（FD-LSC-1、TU177、AMC-HN-8）中CH25H 表達水平的比較

2.2 CH25H 對喉鱗癌AMC-HN-8 細胞凋亡率和凋亡蛋白的影響 AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組CH25H表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），AMC-HN-8/CH25H組CH25H表達水平明顯上調（P＜0.05），見圖2A、B。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。AMC-HN-8/CH25H組24、48、72 h 的細胞凋亡率均明顯高于AMC-HN-8/Mock 組（P＜0.05），見圖2C。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock組Bax、Bcl-2 和C-caspase-3 蛋白表達差異均無統計學意義（均P＞0.05）；與AMC-HN-8/Mock 組比較，AMC-HN-8/CH25H組Bax、C-caspase-3蛋白表達均明顯上調（均P＜0.05），Bcl-2 蛋白明顯下調（P＜0.05），見圖2D、2E。

圖2 CH25H 促進喉鱗癌AMC-HN-8 細胞凋亡（A：CH25H 表達的電泳圖；B：3 組細胞CH25H 的表達水平；C：3 組細胞不同時點凋亡率的比較；D：Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3 蛋白表達的電泳圖；E：Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3 蛋白表達水平比較）

2.3 CH25H 對AMC-HN-8 細胞自噬蛋白的影響AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組LC3Ⅱ、Beclin-1 和p62 蛋白表達差異均無統計學意義（均P＞0.05）。相較AMC-HN-8/Mock 組，AMC-HN-8/CH25H 組LC3Ⅱ和Beclin-1 表達水平明顯上調（P＜0.05），p62 明顯下調（P＜0.05），見圖3A（插頁）。免疫熒光結果顯示，與AMC-HN-8/Mock 組比較，AMC-HN-8/CH25H 組LC3Ⅱ標記的自噬小體數量增加，見圖3B（插頁）。

圖3 過表達CH25H 促進喉鱗癌AMC-HN-8 細胞自噬（A：CH25H 對LSCC 細胞自噬蛋白影響的電泳圖及表達水平比較；B：3 組細胞LC3Ⅱ表達的染色結果，免疫熒光染色×400）

2.4 CH25H 對AMC-HN-8 細胞PI3K/Akt 信號通路蛋白的影響 Western blot 檢測p-PI3K、PI3K、p-Akt 和Akt 信號通路蛋白表達水平發現，AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平差異均無統計學意義（均P＞0.05）。與AMC-HN-8/Mock組比較，AMC-HN-8/CH25H 組p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平下調，見圖4。

圖4 3 組細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達的電泳圖及表達水平比較

2.5 CH25H 對裸鼠移植瘤體積和重量的影響 接種AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H細胞后第5 周處死裸鼠切取的移植瘤見圖5A（插頁）。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組裸鼠移植瘤CH25H 表達水平差異無統計學意義，AMC-HN-8/CH25H 組CH25H 表達水平明顯上調（P＜0.05），見圖5B（插頁）。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 裸鼠瘤體體積、重量差異均無統計學意義，而與AMC-HN-8/Mock 組比較，AMC-HN-8/CH25H 組裸鼠瘤體體積和重量顯著減小（均P＜0.05），過表達CH25H 裸鼠移植瘤生長速度顯著減緩（P＜0.05），見圖5C、D（插頁）。

圖5 CH25H 影響喉鱗癌細胞體內生長（A：第5 周移植瘤裸鼠及移植瘤裸鼠右側腋下原位移植瘤；B：CH25H 在AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 移植瘤中的表達水平；C：裸鼠移植瘤體積的變化；D：第5 周裸鼠移植瘤重量的比較）

2.6 CH25H 對裸鼠移植瘤細胞自噬蛋白、凋亡蛋白和PI3K/Akt 信號通路蛋白的影響 AMC-HN-8 和AMCHN-8/Mock 組Bax、Bcl-2、C-caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62 蛋白表達水平的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。與AMC-HN-8/CH25H 組比較，AMC-HN-8/Mock 組Bax、C-caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1 表達上調，Bcl-2、p62 表達下調，見圖6A、B、D、E。同時檢測PI3K/Akt 信號通路相關蛋白發現，AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組p-PI3K 和p-Akt蛋白表達水平差異無統計學意義（均P＞0.05）。與AMC-HN-8/Mock組比較，AMC-HN-8/CH25H 組p-PI3K 和p-Akt 表達水平下調，見圖6C、F。

圖6 CH25H 通過抑制PI3K/Akt 信號通路調控喉鱗癌細胞自噬和凋亡（A、D：凋亡蛋白表達的電泳圖及表達水平比較；B、E：自噬蛋白表達的電泳圖及表達水平比較；C、F：PI3K/Akt 信號通路蛋白表達的電泳圖及表達水平比較）

3 討論

研究報道CH25H 通過25-HC 可在不同的生物過程中發揮重要作用，對25-HC 的相關研究已確定25-HC 具有抗病毒和抗炎作用[4]。此外，CH25H 可以抑制細胞毒性T 淋巴細胞的胞吞作用，促進細胞毒性T 淋巴細胞活性，即促進抗腫瘤免疫反應，進而抑制腫瘤生長[6]。CH25H 可以作為乳腺癌患者預測因子[7]。甲基化異常基因CH25H 和其他3 個基因可以作為肺鱗癌預后風險模型預測患者的預后[8]。而本研究發現CH25H 可以平衡腫瘤細胞自噬和凋亡。

細胞凋亡通過清除病變細胞來維持組織穩態，促進細胞凋亡可以抑制腫瘤細胞的生長，從而抑制腫瘤的發生和發展，誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤的重要手段。癌細胞表現出對凋亡的抵抗，以維持其不受控制的增殖。具有調節凋亡活性的分子都有可能成為一種潛在的抗癌靶標[9]。Bcl-2 具有抗凋亡作用，Bax 誘導凋亡，C-caspase-3 的激活則被視為凋亡細胞死亡的標志[10-11]。本研究中CH25H 上調后抑制了LSCC 細胞中Bcl-2 表達，同時促進了Bax 和C-caspase-3 表達，促進了腫瘤細胞凋亡。

自噬是真核細胞中一種保守的細胞內反應，其生理功能是清除衰老細胞和細胞內受損蛋白，維持饑餓時氨基酸庫的穩定。近年來研究發現，自噬與腫瘤的發生、發展密切相關，自噬激活有助于清除腫瘤細胞[12]。然而，有研究表明自噬也會維持腫瘤細胞的生存，說明自噬在腫瘤的發生、發展中起著抑制和促進的雙重作用，但本研究中CH25H 的表達在清除LSCC細胞中發揮著促進自噬的作用。自噬的特征包括誘導、成核、延伸、成熟和破壞等多個動態過程。其中，延伸對于完全自噬體的形成至關重要，而從LC3Ⅰ到LC3Ⅱ是延伸過程中的重要轉變，LC3Ⅱ和Beclin-1 是自噬通量的標志，分別參與自噬囊泡的起始和關閉。此外，當自噬被激活時，自噬底物p62 會被下調[13]。本研究中CH25H 上調后抑制了LSCC 細胞中p62 表達，同時促進了LC3Ⅱ和Beclin-1 表達。

PI3K/Akt 通路是一種主要的細胞內信號轉導通路，參與調節細胞周期、細胞增殖、自噬、凋亡、代謝和血管生成[14-15]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路在自噬和凋亡過程中起著至關重要的作用，抑制mTOR 通路可增強自噬體的產生，調節細胞存活和死亡。一些抗癌藥物通過抑制PI3K/Akt 通路誘導細胞凋亡和自噬。還有證據表明，自噬和凋亡之間的相互作用是通過PI3K/Akt 信號通路[16]。在腫瘤發生過程中PI3K/Akt 通路經常過度激活[17]，這與本研究結果一致，在LSCC 細胞中PI3K/Akt 通路被過渡激活，CH25H 通過抑制PI3K/Akt 信號通路進而影響細胞自噬和凋亡。

綜上所述，本研究探討了CH25H 在LSCC 細胞自噬和凋亡發揮的作用，發現CH25H 可通過PI3K/Akt通路調控LSCC 細胞凋亡和自噬進而影響LSCC 進展，這可能為LSCC 相關治療提供極有前景的分子靶點。