胞葬作用缺陷在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的研究進展

程陳 張靜 黃萃園 何向宇 楊簡

動脈粥樣硬化易損性斑塊的破裂是急性心肌梗死、缺血性腦卒中等不良心血管事件的主要病理機制[1-3]。研究表明，晚期動脈粥樣硬化病變中胞葬作用受損可能是不穩(wěn)定性斑塊形成的關鍵因素。在晚期動脈粥樣硬化斑塊內，胞葬作用水平僅為正常生理水平的1/20，斑塊內有大量凋亡及壞死細胞，死亡細胞崩解釋放的產物進一步促使炎癥發(fā)展和繼發(fā)性細胞壞死，導致動脈粥樣硬化斑塊擴大、壞死核心形成和斑塊破裂[4]。因此，增強胞葬作用有望成為防治動脈粥樣硬化的新靶點。

1 胞葬作用

胞葬作用是吞噬細胞對凋亡細胞的清除過程。人體內每天有約數(shù)億個細胞發(fā)生凋亡，因此完整有效的胞葬作用對于機體維持穩(wěn)態(tài)及正常功能至關重要[5]。胞葬作用是一個多步驟、復雜且受精確調控的過程，這一過程由專職的吞噬細胞（包括巨噬細胞和樹突狀細胞等）以及非專職的吞噬細胞（如上皮細胞、平滑肌細胞等）介導，并受“找我”信號、“吃我”信號、“不吃我”信號和橋接分子等多種信號分子協(xié)同調控（表1）。此外，吞噬細胞與凋亡細胞的比例、吞噬細胞的功能狀態(tài)和凋亡細胞所處的凋亡階段均是影響胞葬過程的重要因素[6-7]。胞葬過程包括“找我”階段、“吃我”階段、吞噬階段、吞噬后階段。

表1 胞葬作用相關信號分子

1.1 “找我”階段

“找我”階段是胞葬過程中的首要步驟，其作用是向吞噬細胞提供準確的信號，幫助它們快速感知到凋亡細胞并啟動胞葬過程。在此階段中，凋亡細胞釋放出一系列“找我”信號，例如趨化因子CX3C配體1（CX3CL1）、鞘氨醇-1-磷酸、溶血磷脂酰膽堿、三磷酸腺苷（ATP）和三磷酸尿苷（UTP）、嘌呤能受體P2Y2 等，這些信號分別與吞噬細胞表面的受體趨化因子CX3C 受體1、鞘氨醇-1-磷酸受體、G 蛋白偶聯(lián)受體 G2A 家族、G 蛋白偶聯(lián)受體 P2Y 家族特異性結合后，引導吞噬細胞向凋亡細胞遷移和聚集，從而啟動后續(xù)的凋亡細胞清除過程[8]。

1.2 “吃我”階段

“吃我”階段是指吞噬細胞識別凋亡細胞的過程。細胞程序性凋亡后，凋亡細胞表面暴露出“吃我”信號，“吃我”信號可與吞噬細胞表面的受體以“配體-受體”的形式直接結合，也可通過橋接分子與吞噬細胞表面的受體以“配體-橋接分子-受體”的形式間接偶聯(lián)，進而激活胞葬級聯(lián)反應。目前研究較多的“吃我”信號主要為磷脂酰絲氨酸（PtdSer）、鈣網蛋白[9-10]。其中，PtdSer 是最關鍵的“吃我”信號，生理條件下PtdSer 位于質膜內表面，細胞程序性凋亡后，凋亡細胞中的PtdSer 在磷脂轉移酶的作用下翻轉并暴露于質膜的外表面，PtdSer 可直接與吞噬細胞表面的吞噬受體腦特異性新生血管抑制因子-1、穩(wěn)定素、CD300、清道夫受體BI 等結合激活胞葬；另外，PtdSer 也可通過結合橋接分子乳脂球樣表皮生長因子8 被吞噬細胞上的Mer 酪氨酸蛋白激酶受體（MerTK）識別進而激活胞葬[11]。

1.3 吞噬階段

“吃我”信號與吞噬細胞表面的受體結合后，繼而激活小三磷酸鳥苷（GTP）酶Rho 家族中的Rac1，促使巨噬細胞的細胞骨架發(fā)生重組，驅動肌動蛋白在凋亡細胞周圍形成“吞噬杯”結構，這種結構有利于巨噬細胞包裹并吞噬凋亡細胞，從而實現(xiàn)對凋亡細胞的吞噬[12]。另外，健康的活細胞通過釋放“別吃我” 信號防止自身被胞葬細胞吞噬。目前研究較多的非食我信號分子有CD47、CD31、CD24、CD300 等。其中，CD47 是重要的“別吃我”信號分子之一，廣泛表達于幾乎所有正常細胞的表面[13]。健康活細胞表面的CD47 分子與巨噬細胞表面的受體信號調節(jié)蛋白α（SIRPα）結合，促進含SH2 結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶1/2 磷酸化，抑制肌球蛋白在巨噬細胞突觸膜裝配位點的積聚，阻礙巨噬細胞細胞骨架在吞噬體周圍重排，從而抑制巨噬細胞的吞噬作用，防止健康活細胞被吞噬[14]。

1.4 吞噬后階段

吞噬細胞清除凋亡細胞后，細胞內凋亡細胞來源物質（脂質、蛋白質/肽或核酸等）急劇增加。為了應對這種“營養(yǎng)超負荷”，吞噬細胞自身進行代謝重編程，激活多條代謝信號通路，吞噬細胞代謝水平急劇增加，加速對這些代謝產物的消化降解。此時，吞噬細胞通過糖酵解生成大量ATP，促進肌動蛋白聚合和“吞噬杯”形成，以利于后續(xù)胞葬作用的連續(xù)進行[15]。同時巨噬細胞利用從凋亡細胞中攝取的精氨酸和鳥氨酸代謝生成腐胺，腐胺能夠提高Dbl基因（編碼鳥嘌呤核苷酸交換因子）mRNA 的穩(wěn)定性，后者進一步活化Rac1 以驅動肌動蛋白細胞骨架重排，促進之后幾輪的連續(xù)凋亡細胞攝取[16]。此外，凋亡細胞表面的“吃我”信號與受體結合后能激活或上調肝X 受體和ATP 結合盒轉運子A1，促進吞噬細胞膽固醇的代謝與排出[17]。此外，有研究報道，在吞噬后階段，吞噬細胞還能分泌多種抗炎細胞因子抑制局部免疫反應。如凋亡細胞被吞噬清除后生成的甲硫氨酸可進一步轉化為S-腺苷甲硫氨酸，抑制Dusp4基因轉錄，從而導致前列腺素E2、轉化生長因子β 表達水平升高，增強胞葬作用并促進炎癥消退[18]。

2 動脈粥樣硬化過程中胞葬作用缺陷的分子機制

完整有效的胞葬作用可清除斑塊內大量凋亡細胞，防止炎癥發(fā)展和繼發(fā)性細胞壞死，提高斑塊穩(wěn)定性，從而減緩動脈粥樣硬化的進展。目前的研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊中胞葬作用缺陷的分子機制主要與吞噬細胞的吞噬效率降低、凋亡細胞不易識別有關，其中涉及吞噬細胞的絕對數(shù)量、吞噬能力下降、胞葬相關信號分子的紊亂、炎癥激活、遺傳因素等多個環(huán)節(jié)。

2.1 吞噬細胞的工作效率下降

動脈粥樣硬化過程中胞葬作用缺陷可能與多種吞噬細胞的工作效率下降密切相關。巨噬細胞在動脈粥樣硬化斑塊高度促炎與毒性環(huán)境中自身易發(fā)生凋亡或壞死，導致吞噬細胞絕對數(shù)量的減少[19]。此外，動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞的極化更傾向于促炎的M1 表型，而具有高吞噬活性的M2 表型比例降低，導致吞噬細胞的吞噬能力相對降低[20]。多項體外實驗亦表明，動脈粥樣硬化病變進展過程中樹突狀細胞和平滑肌細胞的吞噬能力也降低[21-22]。

2.2 胞葬相關信號分子紊亂

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種胞葬作用相關信號分子與動脈粥樣硬化病變進展過程中胞葬作用缺陷有關。研究表明，在動脈粥樣硬化病變進展過程中，巨噬細胞表面的吞噬相關受體[如MerTK、低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1）、清道夫受體-BI（SR-BI）等]表達缺陷與胞葬作用缺陷密切相關[23]。Garbin等[24]發(fā)現(xiàn)，頸動脈斑塊壞死核心周圍的巨噬細胞中MerTK 蛋白表達顯著下降。Thorp 等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，MerTK 受體敲除小鼠的動脈粥樣硬化病變壞死核心擴大，斑塊內凋亡細胞數(shù)量增加。該團隊進一步研究發(fā)現(xiàn)，晚期動脈粥樣硬化斑塊中解聚素金屬蛋白酶17（ADAM17）的表達增加，ADAM17 使MerTK受體剪切失活，導致巨噬細胞上Mertk 表達降低。此外，剪切后的MerTK 受體胞外段——可溶性 Mer蛋白能夠與MerTK 競爭結合橋接分子Gas6 或TAM激酶配體蛋白S（ProS1），進一步加劇胞葬作用功能缺陷[26]。巨噬細胞通過鳥氨酸脫羧酶（ODC）的作用將從凋亡細胞中攝取的精氨酸代謝生成腐胺，Yurdagul 等[27]的研究表明ODC 依賴性腐胺合成可影響MerTK 表達的基礎水平。骨髓特異性敲除ODC通過阻礙腐胺合成降低H3K9me2/3 水平，抑制凋亡細胞受體MerTK 的基礎表達，進而損害胞葬作用，導致動脈粥樣硬化壞死核心增大、纖維帽變薄。此外，在動脈粥樣硬化病變進展過程中，ADAM17 使巨噬細胞表面的吞噬受體LRP1 切割脫落[28]，后者具有強烈的促炎作用，其上調多種促炎細胞因子[如腫瘤壞死因子（TNF）-α、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1、基質金屬蛋白酶（MMP）-9]的分泌，促進并維持血管炎癥，抑制胞葬作用[29]。有研究顯示，在動脈粥樣硬化斑塊中，凋亡細胞表面“別吃我”分子CD47 表達異常上調，從而躲避吞噬細胞的胞葬作用[13]。另外，在心肌缺血再灌注損傷期間，凋亡細胞同樣表現(xiàn)出CD47 異常高表達，而應用抗CD47 抗體治療可顯著減輕局部的炎癥反應、減少心肌梗死面積、改善心臟功能[30]。此外，Mueller 等[31]發(fā)現(xiàn)接受抗CD47 抗體治療的ApoE/LRP1雙基因敲除小鼠與對照組小鼠相比在動脈粥樣硬化病變大小、壞死核心面積方面沒有差異。這提示抗CD47抗體對于胞葬作用的改善作用依賴于LRP1 的存在。事實上，胞葬作用是涉及多種信號分子協(xié)同調控的吞噬過程，在動脈粥樣硬化病理過程中，致病因素通過損害多個胞葬作用相關信號分子，協(xié)同導致巨噬細胞胞葬作用功能缺陷。Zou 等[32]以體外培養(yǎng)的巨噬細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)氧化型低密度脂蛋白通過mRNA 和微小RNA（miR）調控，下調胞葬受體（過氧化物酶體增殖物激活受體/ 肝X 受體α/ MerTK）、內化分子[溶質載體（SLC）29a1 ]，上調胞葬作用競爭性受體CD300a，抑制胞葬受體-配體結合過程，加速動脈粥樣硬化病變的發(fā)生、發(fā)展。Jin 等[33]報道，TNF-α 誘導蛋白2 敲低能夠通過上調“吃我”受體CD36、清道夫受體-A（SR-A）、SR-B1 表達和下調"別吃我"信號CD47 表達，改善胞葬作用，減輕動脈粥樣硬化病變。Yin 等[34]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，GATA2基因過表達導致多個胞葬階段的功能缺陷，包括凋亡細胞攝取、吞噬體成熟和吞噬體-溶酶體功能障礙等。

2.3 炎癥激活

炎癥激活是導致動脈粥樣硬化過程中胞葬作用缺陷的重要環(huán)節(jié)。在動脈粥樣硬化進展期，胞葬作用缺陷導致凋亡細胞無法被及時清除，斑塊內大量凋亡及壞死細胞累積，死亡細胞崩解釋放的產物促使炎癥發(fā)展和繼發(fā)性細胞壞死，而炎癥激活反過來破壞胞葬信號途徑，進一步抑制胞葬作用，以此在動脈粥樣硬化持續(xù)進展與胞葬作用缺陷之間形成惡性循環(huán)。研究表明，動脈粥樣硬化斑塊中促炎分子TNF-α水平的增加，其可上調凋亡細胞表面的“別吃我”信號分子CD47 的表達，阻止凋亡細胞的清除[13]。此外，晚期動脈粥樣硬化斑塊中的M1 型巨噬細胞可分泌大量促炎細胞因子[如白細胞介素（IL）-6、IL-β 和TNF-α 等]，導致局部炎癥反應加劇，進一步抑制胞葬作用[35]。炎癥信號分子高遷移率族蛋白B1 可通過與整合素β3（αvβ3）結合，抑制MFG-E8 與αvβ3 之間的相互作用，此外，炎癥信號分子高遷移率族蛋白B1 還可抑制ERK 磷酸化和Rac1 激活[36]。另外，動脈粥樣硬化斑塊中Toll 樣受體4 的表達和活化可抑制橋接分子MFG-E8 的合成，同時抑制“吃我”信號配體MerTK、LRP1 活性，進而降低胞葬作用[37]。特異性促炎癥消退介質（SPM）是一類由必需脂肪酸衍生而來的脂質介質。Fredman 等[38]發(fā)現(xiàn)，與穩(wěn)定性斑塊相比，易損斑塊中SPM 家族中解析素D1的水平顯著降低，并伴有白三烯B4的增加。而補充解析素D1 可降低小鼠動脈粥樣硬化病變中的活性氧水平，同時誘導胞葬作用激活，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。最近的研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化過程中補體系統(tǒng)激活，尤其增加C3 水平也可以導致胞葬作用受損。Wang 等[39]的研究表明，血清補體C3 水平在心血管疾病的患者中表達水平升高，此外，C3 的表達定位在人類動脈粥樣硬化斑塊的壞死核心邊緣區(qū)域。機制研究表明，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，C3 由克隆性擴增的血管平滑肌細胞產生，其一方面可通過旁分泌加劇巨噬細胞炎癥反應，另一方面可通過自分泌方式觸發(fā)平滑肌細胞增殖，從而導致動脈粥樣硬化斑塊的進展。Buono 等[40]發(fā)現(xiàn)，與低密度脂蛋白受體（LDLR）敲除小鼠相比，LDLR/C3雙敲除小鼠的動脈粥樣硬化病變壞死核心擴大，斑塊內凋亡細胞數(shù)量增加。提示C3 可能通過調理吞噬凋亡細胞影響動脈粥樣硬化病變發(fā)展。Martin 等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，因子H 可以抑制C3b 下游補體系統(tǒng)的激活。這使得C3b 的功能被限制在吞噬凋亡細胞時，不會引發(fā)過度的免疫反應。此外，因子H 還可以被內化入胞裂解C3 產生C3b 并轉移至細胞表面，進一步加速凋亡細胞的清除。Kiss 等[42]的研究亦表明，補體因子H 通過負性調控C3 的消耗，從而限制補體活化，增強胞葬作用，延緩動脈粥樣硬化發(fā)生。

2.4 遺傳因素

近年來遺傳因素與胞葬缺陷之間的聯(lián)系尤其受到學者們的關注。現(xiàn)已證實，攜帶9p21.3風險等位基因的人群動脈粥樣硬化斑塊內“吃我”信號Calr 的表達降低，導致胞葬作用缺陷[43]。缺乏細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B基因也被證實與胞葬作用缺陷、動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定有關[44]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，缺乏乙醛脫氫酶2 促進Rac2 的泛素化降解，阻礙胞葬并促進動脈粥樣硬化病變的進展[45]。此外，有學者報道rs9349379-G風險等位基因突變導致肌動蛋白結合蛋白磷酸酶和肌動蛋白調節(jié)因子1 表達水平降低，抑制肌動蛋白細胞骨架重組，降低了胞葬作用效率[46]。此外，miR、長鏈非編碼RNA（lncRNA）均被證實與胞葬缺陷有關。在動脈粥樣硬化晚期階段，miR-155 通過靶向抑制B 細胞白血病/淋巴瘤6 的表達，降低RhoA 活性，阻礙巨噬細胞的細胞骨架重組和“吞噬杯”形成，進而損害胞葬作用[47-48]。心肌梗死相關轉錄本（MIAT）通過靶向miR-149-5p 上調CD47，削弱胞葬能力，導致動脈粥樣硬化病變中凋亡細胞積累和斑塊不穩(wěn)定，促進動脈粥樣硬化進展[49]。此外，有研究顯示，敲除巨噬細胞相關動脈粥樣硬化lncRNA 序列（lncRNA MAARS）可通過上調MerTK 受體表達來促進胞葬作用，顯著減少動脈粥樣硬化斑塊面積[50]。

3 針對胞葬作用的干預及治療研究

大量研究證實胞葬作用受損在動脈粥樣硬化斑塊進展中起關鍵作用，因此，靶向增強胞葬作用被視為極具潛力的動脈粥樣硬化治療靶點，具有巨大的應用前景。目前已有多項增強胞葬作用的動脈粥樣硬化干預研究在體外實驗與小鼠模型上顯示了初步成效。

3.1 他汀類藥物

研究表明，他汀類藥物可通過多種途徑調節(jié)胞葬作用。他汀類藥物可以通過抑制負調節(jié)因子RhoA的異丙基化來增強胞葬[51]。此外，他汀類藥物增加過氧化物酶體增殖物激活受體和CD36 水平，促進凋亡細胞的識別，進而增強胞葬作用[52]。Jarr 等[53]在小鼠模型及體外細胞實驗中均證實，他汀類藥物通過抑制“不要吃我”分子CD47 的表達，從而阻斷CD47-SIRPα 軸，增強吞噬細胞的胞葬作用，此外他汀類藥物還可通過抑制NFκB1 p50 的核易位，減輕炎癥反應，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化病變的作用。Cimato等[54]的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以抑制CX3CL1 的表達，減少白細胞的黏附和遷移，從而對炎癥反應具有抑制作用，發(fā)揮穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

3.2 納米藥物載體

隨著納米醫(yī)學技術的快速發(fā)展，基于納米載體的給藥系統(tǒng)備受關注。Chen 等[55]將血小板膜作為包膜材料，開發(fā)了納米粒子藥物輸送系統(tǒng)，其能夠將抗CD47 抗體有效地輸送到動脈粥樣硬化斑塊中，顯著減小動脈粥樣硬化斑塊面積并降低斑塊破裂和晚期血栓形成風險。Sha 等[56]設計了一種基于巨噬細胞膜的仿生納米粒子，其將SIRPα 下游效應分子酪氨酸磷酸酶SHP-1 的小分子抑制劑荷載到納米粒子中，增強巨噬細胞的胞葬作用，抑制動脈粥樣硬化進展。Wang 等[57]構建了一種序貫靶向納米平臺，其能夠上調ABC 轉運蛋白和MerTK 表達，進而促進膽固醇流出、增強胞葬作用，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊。Huang 等[58]合成了一種小干擾RNA 納米顆粒，其能夠選擇性地沉默巨噬細胞中的CaMK Ⅱγ，上調斑塊中MerTK 的表達，提高動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。

3.3 中醫(yī)中藥

石榴果實和皮中含有多種活性成分，如多酚類化合物、花青素等，具有抗氧化、抗炎、降血壓、降血脂、抗癌等多種功效，其已被證明抗動脈粥樣硬化的效果良好。Manickam 等[59]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮提取物可阻止MerTK 脫落，增強巨噬細胞胞葬作用，促使動脈粥樣硬化斑塊壞死面積減少和病變處膠原含量增加，提高斑塊穩(wěn)定性。此外，Zhang 等[60]以LDLR 受體敲除小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)給予冠心康（以瓜蔞薤白半夏湯為基礎的一種治療冠心病的經典中藥方劑）干預12 周后，小鼠動脈粥樣硬化病變面積明顯縮小，其機制可能與冠心康上調Axl、MerTK 和Tyro3 的蛋白表達水平，進而促進細胞吞噬凋亡細胞的能力，增強胞葬作用有關。

3.4 其他

Zou 等[61]的研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞來源的外泌體能夠通過上調胞葬受體（SLC2a1、信號轉導及轉錄激活因子3/Rac1）和下調胞葬作用競爭性受體CD300a 來增強調節(jié)胞葬作用。該研究團隊據此開發(fā)了一種新型血管支架，與裸金屬支架相比，外泌體支架能夠顯著增強胞葬作用，延遲了支架內再狹窄的發(fā)生。Cao 等[62]發(fā)現(xiàn)紫卟啉鈉介導的聲動力療法可通過激活半胱氨酸天冬氨酸酶-3，減少泡沫細胞中CD47 的表達，促進兔動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞胞葬作用，并減輕局部炎癥。Jin 等[63]發(fā)現(xiàn)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 抑制劑VX765 能夠促進巨噬細胞線粒體自噬、增強胞葬作用和M2 型極化，并抑制泡沫細胞形成，從而改善核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3 炎癥小體引起的線粒體損傷、動脈粥樣硬化和血管炎癥反應。此外，Viola 等[64]發(fā)現(xiàn)，應用SPM 家族中的Maresin 1 和Resolvin D2 治療可以促進巨噬細胞的胞葬作用，減少動脈粥樣硬化斑塊中壞死核心含量。

4 結語

胞葬作用是一個多步驟、復雜且精確的過程，涉及多種因素、信號通路、調節(jié)因子的相互作用。越來越多的研究表明，胞葬作用受損在動脈粥樣硬化斑塊進展中起關鍵作用。現(xiàn)有研究認為動脈粥樣硬化過程中胞葬作用缺陷的分子機制可能涉及: （1）吞噬細胞絕對數(shù)量減少和吞噬能力的下降，導致吞噬細胞的工作效率下降； （2）胞葬相關信號分子的紊亂，包括吞噬受體MerTK、LRP1 的脫落，凋亡細胞表面CD47 表達異常上調等；（3）動脈粥樣硬化斑塊組織局部大量凋亡及壞死細胞累積，釋放多種促炎細胞因子，破壞胞葬信號途徑，胞葬作用的失效會進一步引起繼發(fā)性壞死、加劇炎癥反應及自身免疫反應，從而在動脈粥樣硬化的持續(xù)進展和胞葬受損之間形成惡性循環(huán)；（4）遺傳因素，如9p21等位基因突變。目前已有多項針對增強胞葬作用的動脈粥樣硬化干預研究在體外實驗與小鼠模型上顯示了初步成效，隨著胞葬作用及相關信號通路的研究的不斷深入，重新激活胞葬作用有望成為治療動脈粥樣硬化相關性疾病的新靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突