茶葉中吡咯里西啶生物堿殘留量檢測方法及研究現狀

摘要：綜述了茶葉中吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）殘留量的檢測方法，包括比色法、毛細管電泳法、免疫學方法、色譜分析法等，并總結了國內外茶葉中PAs殘留研究現狀，分析了茶葉中PAs的毒性作用以及國內外關于PAs的限量標準。我國目前尚缺乏茶葉中PAs的檢測標準，迫切需要制定與歐盟規定相符的21種PAs的檢測標準，并展開茶葉PAs污染水平監測與風險評估研究，為確保我國茶葉質量安全，積極應對歐盟貿易壁壘提供強有力的技術保障。

關鍵詞：茶葉；吡咯里西啶生物堿；殘留；檢測方法

中圖分類號：TS272.5；Q946.88" " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "文章編號：1000－3150 （2024）03-12-9

Research Progress on Detection Methods and Current Status of Residual Pyrrolizidine Alkaloids in Tea

JIAO Yanna1， PENG Mengxiang1， LIANG Xiang1， MAO Xian1， XIAO Zhongning1， ZENG Liang2， LIU Zhonghua3*

1. Technology Center of Changsha Customs/Hunan Key Laboratory of Food Safety Science amp; Technology， Changsha 410004， China;

2. School of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China; 3. Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China

Abstract： This article reviewed the detection methods for the residual pyrrolizidine alkaloids （PAs） in tea， including colorimetric methods， capillary electrophoresis， immunological methods， chromatographic analysis， and discussed their current status and future trends. Additionally， it summarized the current research on PAs residues in tea both domestically and internationally， analyzed the toxic effects of PAs in tea， and examined the limit standards of existing PAs globally. Considering the lack of detection standards for PAs in Chinese tea， it is urgent to develop detection standards for at least 21 types of PAs， in accordance with the European Union regulations. Furthermore， research on monitoring the contamination levels of PAs in tea and conducting risk assessments is crucial. In order to ensure the quality and safety of tea in our country and actively respond to EU trade barriers， strong technical support was provided.

Keywords： tea， pyrrolizidine alkaloids， contamination， detection methods

植物通過次級代謝產生吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs），這些化合物具有防御作用。其中的不飽和PAs及很大一部分PAs的氮氧化物（PANOs）具有多種毒性，是常見的內源性毒素，目前已在6 000余種植物中鑒定出600多種不同的PAs及PANOs，其中大概有120種具有肝毒性，一些PAs還有致癌、致突變和致畸胎的毒性，長期過量攝入可導致肝癌^[1]。

PAs已被發現廣泛存在于茶葉、蜂蜜等多種食品中，由于攝入含PAs的草藥及食品引發中毒事件逐年遞增，其污染問題成為日漸關注的食品安全問題^[2]。目前，在奧地利、德國、比利時等許多歐洲國家已經對茶葉中PAs或PANOs的污染源與污染途徑進行了大量的研究，建立了較為完善的茶葉檢測與監督體系。2023年，歐盟發布了（EU）2023/915法規，規定了茶葉中PAs含量限值為150 μg/kg，成為繼農藥殘留之后的又一新型技術壁壘^[3]。根據歐洲對PAs的監測，大多數茶葉及代用茶中均檢出1種或多種PAs，部分樣品殘留量超過了歐盟實施的限量標準。茶葉中PAs污染的主要來源可能是茶園中的雜草，這也是導致各國茶葉樣品中PAs污染水平、污染種類差異大的主要原因^[4]。目前，我國對茶葉中PAs污染來源與水平尚不清晰且我國茶葉中PAs的種類與歐洲國家關注的茶葉中PAs種類并不一致。這就需要對我國茶葉中的PAs種類進行非靶向篩查與鑒定，并開展健康風險評估，為我國實施茶葉質量安全管控提供數據支撐。

在PAs定量分析技術方面，高靈敏度和高選擇性的液相色譜和高分辨質譜聯用技術得到廣泛運用，將成為今后PAs技術開發的主要方向，但目前技術體系尚不成熟，特別是適用于茶葉中21種PAs/PANOs（表1）的檢測技術尚未得到充分研究，不能滿足輸歐茶葉中21種PAs的檢測需求。故進行茶葉中PAs殘留水平的研究及建立茶葉中PAs的檢測技術顯得尤為重要。

1" PAs化學結構和毒性

PAs在結構上由千里光次堿（Necine）和千里光次酸（Necic acid）兩個基本部分組成（圖1），其中千里光次堿的吡咯環結構為PA的母核。母核中的氮原子氧化形成相應的PANOs與PAs同時存在于植物體內，PAs的毒性高于PANOs，PANOs可以轉化為相應的PAs。根據母核1，2位碳原子之間形成的鍵是否飽和，可分為飽和PAs與不飽和PAs。飽和型PAs主要為闊葉千里光次堿（Platynecine），表現為無毒或毒性較弱；不飽和PAs根據千里光次堿基結構差異，分為倒千里光堿型、天芥菜堿型、奧索千里光裂堿3種類型（圖2），由于其毒性和致病性，這些類型的PAs成為關注的熱點^[5]。

PAs的毒性與其結構緊密相關，目前普遍認為脫氫吡咯里西啶生物堿（Dehydropyrrolizidine alkaloids，DHPA）為PAs在體內的主要致毒結構，是經細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）3A代謝脫氫生成^[6]。DHPA具有較強的親電子性，較易與胞內親核類物質（如DNA、RNA、蛋白質）加合，形成加合物，造成肝細胞損傷及凋亡^[7]。PAs衍生的吡咯-蛋白加合物是引發肝毒性的主要因素。Ruan等^[8-9]根據吡咯-蛋白加合物的濃度來評估PAs的毒性程度，結果證明倒千里光堿型PAs的毒性大于奧索千里光裂堿型。同時根據產生的吡咯蛋白加合物數量，進一步將倒千里光堿型PAs按毒性大小排序：開環雙酯gt;12元閉環雙酯gt;11元閉環雙酯gt;開環單酯。

2" PAs檢測分析

近年來，隨著科技進步，茶葉中PAs檢測技術也在不斷發展和完善，逐步形成了從常量定性到痕量定量檢測的技術體系，主要包括比色法、毛細管電泳法、免疫學方法、色譜分析法。

2.1" 比色法

比色法是早期研究者用來測定植物中PAs的方法，檢測原理是基于顯色反應，其中產生的絡合物具有特定的吸收波長，通過分光光度計進行測定。梁威等^[10]使用Ehrilich試劑與藥材中PAs衍生物進行反應，形成酒紅色物質，在565 nm存在強吸收峰，該方法檢出限為1.02 mg/L；Birecka等^[11]使用甲基橙與離子化的PAs反應形成黃色絡合物后，在525 nm處有吸收峰，方法所得檢出限為0.5 mg/L。比色分析實驗操作簡便，但僅適用于PAs總量的檢測，存在選擇性低、靈敏度低、檢出限高等缺陷，難以滿足痕量分析條件和要求。

2.2" 毛細管電泳法

毛細管電泳法（CE）是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，根據植物樣品中各組分間淌度和分配行為上的差異而實現PAs分離和測定的方法。朱雷等用動態pH連接掃描毛細管電泳法測定了中草藥款冬中4種有毒的PAs，檢出限可達0.03 mg/L。該方法也是早期研究者建立的方法，無法滿足痕量檢測分析需求。

2.3" 免疫學方法

酶聯免疫吸附法（ELISA）是基于抗原抗體的免疫檢測方法，具有高選擇性、高特異性、檢測成本低等優點，被廣泛應用于對PAs的快速定性。采用ELISA結合特異性抗原可以針對某個特定PAs進行分析檢測，如Sakamoto等^[13]通過將野百合堿的水解產物惹卓裂堿與牛血清白蛋白的連續賴氨酸殘基偶聯，制備了對野百合堿具有高特異性的單克隆抗體（MAb 4B8），使用ELISA檢測的低限可達48.8 pg/mL。該方法中單克隆抗體制備步驟較為繁瑣，耗時較長且不具有普適性，因此免疫學分析方法主要用于PAs的毒理學研究。

2.4" 色譜分析法

有學者統計發現，80%的PAs相關研究文獻采用了色譜分析方法^[14]，主要包括高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）和氣相色譜串聯質譜（GC-MS）。因為這些方法的樣品制備相對簡單，且可以測量各種物化特性的物質，具有靈敏度高、穩定性高、分離度高的優點，這些都是食品安全控制方案中必需的特性。

GC-MS聯用技術，可用于除了奧索千里光裂堿外大多數PAs的檢測^[15-16]。但由于PANOs在揮發溫度下不太穩定，因此不能直接進行分析，需要通過化學衍化如使用Zn⁺/H⁺將PANOs還原為游離PAs進行檢測，該方法被稱為求和參數法，最早由Kempf等提出。求和參數法的優點在于漏檢率低，在無需所有對照品的情況下就能更準確地反映出被分析產品的污染程度。但是衍生化過程耗時繁瑣，不符合現代高通量檢測需求。近年來，研究人員通過改進前處理技術努力提高PAs的檢測效率，如Kowalczyk等^[17]使用七氟丁酸酐（Heptafluorobutyric anhydride，HFBA）進行衍生，70 ℃下30 min即可完成反應。

LC-MS聯用技術可以彌補GC-MS在處理熱不穩定物質方面的缺陷。無需進行衍生化處理，可直接用于檢測，成為當前PAs最主流的檢測分析方法。PAs屬于極性化合物，色譜柱固定相通常選擇反相色譜柱，使用的質量檢測器主要為三重四極桿（TQ-MS），表2列舉了茶飲基質中PAs/PANOsLC-MS分析的主要條件。

LC-MS聯用技術也存在一定的不足，比如基質干擾、色譜峰分離度差、分析物的共洗脫現象等。Kaltner等^[18]觀察到異構體基團的峰是不可分離的，大部分被共洗脫下來。Marianna等^[24]建立的茶葉中20種PAs的LC-MS/MS方法中，有13種化合物與1個或多個同分異構體在色譜中共流出，因此不能完全準確定量。因此Urban等^[25]和Van de Schans等^[26]分別提出了以2D-HPLC和2D-HPLC-MS/MS的方法來解決這一問題，二維技術的使用可以顯著提高分離度和分辨率，對于PAs的檢出限低至0.7 μg/kg。

液質聯用技術通常只能檢測設定的MS/MS目標，對于市場上無相應標準物質的PAs/PANOs，還存在較大的遺漏性和不確定性。為了解決這一問題，高分辨質譜（HRMS）由于其精準質量數測定優勢，逐漸應用到MS中形成新的檢測方法。LC和HRMS聯用，可以全面獲取樣品中未知PAs的精確相對分子質量和碎片離子信息，可鑒定未知PAs的結構，區分同分異構體，是對多種PAs篩選鑒定和痕量分析的有效手段。Rizzo等^[27-28]建立了一種基于UHPLC-HRMS/MS方法的分析平臺，可高通量靶向篩選和鑒定復雜食物基質中的118種PAs。超高效液相色譜-四極桿/軌道阱質譜（UPLC-Q Exactive-MS）與超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）是用于復雜樣品中的生物堿結構解析和確證分析的主要技術。Zhang等^[29]建立的超高效液相色譜-四極桿-軌道質譜技術（UPLC-Q-Orbitrap/MS）方法，利用基于特征破碎模式和千里光次堿母核結構建立大量的MS-dd-MS2全掃描數據，可在無對照品情況下鑒定野百合中PAs。Nuria等^[30]建立的LC-Q-Orbitrap HRMS分析方法可同時分析干茶和中草藥中30種PAs，定量限為5 μg/kg，準確度可達87%～111%。Jeong等^[31]建立了可快速準確測定琉璃苣、款冬堯、紫草、聚合草9種PAs的UPLC-ESI-Q-TOF-MS法，檢出限為0.4～2.0 ng/mL，定量限為0.6～6.0 ng/mL。許秀麗等^[32]利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS），在正離子模式下采用全掃描-數據非依賴性采集（Full scan/data independent acquisition，Full MS/DIA）模式，可定量分析茶葉中15種PAs。Martinello等^[33]研究發現混合四極桿軌道阱高分辨質譜比Q-TOF-MS和TOF-MS分辨值更高。

目前，我國對歐盟21種PAs還未建立一套成熟的檢測標準。萬靜宜等^[34]建立的茶葉中21種PAs檢測方法，雖然可同時實現歐盟規定的21種PAs的檢測，但該方法前處理耗時較長，需要靜置過夜。因此需進一步優化前處理條件，如比較QuEChERS方法和固相萃取小柱法對PAs化合物的提取和凈化效果，建立快速高效的前處理技術；優化色譜條件使各組分得到有效分離，考察色譜柱種類（必要時采用5-F苯基柱、雙苯基柱等對同分異構體分離度更高的色譜柱）、流動相組成等條件對分離效果的影響；優化質譜條件改善目標組分的質譜響應，考察噴霧電壓和毛細管溫度等參數對目標物質譜響應的影響。

3" 國內外茶葉中PAs殘留研究現狀

3.1" 國內茶葉中PAs殘留研究狀況

PAs是茶葉中的新型污染物，其來源尚未完全明確。Han等^[35]對370個茶葉（包括紅茶、綠茶、黑茶）、15個菊花及189個當地茶園的雜草樣品進行了分析。結果顯示，15.51%的茶葉樣品中檢測到1種或多種PAs，含量最高為151.33 μg/kg；20.63%的雜草樣品檢測到PAs，含量最高達到5 017.06 μg/kg。該研究分析認為，雜草很可能是茶葉中PAs的污染來源。Jiao等^[36]的研究同樣證實了茶葉中的PAs可能來自茶園中的雜草。通過對雜草、茶葉和土壤這3種基質進行檢測，發現從雜草中檢測到了13種PAs，而茶葉和土壤中分別只檢測到了3種和4種。黃旦益等^[37]分析茶葉中PAs來源，發現我國茶園的主要雜草中含有 PAs 植物，如 一點紅、勝紅薊、千里光、豬屎豆等。茶葉 PAs 污染風險主要來自于茶園雜草， 人工采摘加工的茶葉不存在 PAs 污染。Nikola等^[38]研究了PAs在不同茶園土壤中的吸附和解吸行為，PAs的吸附和解吸行為受到多種因素的影響，包括化合物的疏水性和土壤的特性。研究發現PAs在茶園土壤中具有高度流動性，這凸顯了采取有效管理策略的必要性，以盡量減少它們從土壤到茶樹的轉移。

由于我國對PAs的研究起步較晚，因此對茶葉中PAs的暴露水平研究非常有限。許秀麗等^[32]對20例市售茶葉樣品中PAs進行了研究，其中只有1例樣品中檢出千里光堿，其余樣品PAs含量都沒有超過方法檢測低限。朱雷^[39]通過對安徽省六大茶葉主產區茶園體系中PAs的測定分析，88份綠茶樣品有59份檢出PAs，檢出率為67.05%，共檢出10種PAs，總PAs含量最高的是主產區5的12號綠茶樣品，為90.50 μg/kg。37份雜草樣品有35份檢出PAs，檢出率為94.59%，15種PAs均有檢出，總PAs含量最高的是主產區4的藿香薊，為74 707.75 μg/kg。采用暴露限值法對茶葉中PAs污染進行風險評估，茶葉中PAs的不同分位點對應的MOE值均大于10 000，說明安徽省茶葉污染風險較低。夏珍珍等^[40]研究了湖北省茶葉中PAs污染概況，同時對其健康風險進行了評估，對湖北省主要的茶葉及茶園中的雜草進行了15種PAs的檢測，對不同茶類、不同季節中的污染情況進行對比分析，并對茶園雜草種類及其PAs含量進行研究分析，確定茶葉中PAs的可能來源。結果顯示，雜草和茶葉中PAs的檢出率分別為79.2%和20.2%，PAs總含量分別為1.86×10⁴～2.67×10⁴ μg/kg和1.15～34.45 μg/kg。根據茶類分，PAs的檢出率從低到高依次為綠茶、黑茶、紅茶；對5個茶葉主產區的PAs檢出率進行比較，大悟最低（恩施和英山地區的茶葉未檢出PAs）、咸寧次之、宜昌最高；對不同季節茶葉的PAs檢出率進行比較，由低到高排序為秋茶、春茶、夏茶。對18種茶園雜草進行分析，發現來自野茼蒿和烏蘞莓中的千里光堿-N-氧化物（JbNO）和倒千里光堿-N-氧化物（ReNO）含量較高；通過暴露邊際（Margin of exposure，MOE）法，對湖北省茶葉的健康風險進行評價，結果顯示，湖北省茶葉中的PAs健康風險較低。不同類型茶葉中PA/PANO的污染水平和形態差異顯著。紅茶的PA/PANO污染比綠茶更嚴重，這種現象可以歸因于茶葉生產過程中PA/PANO的各種污染源和消散模式。Han等^[41]研究了茶加工和沖泡過程中PAs/PANOs的耗散模式和轉化行為。與Pas的加工因子（PF）在0.73～1.15之間相比，PANOs在制茶過程中具有更高的降解率，PF在0.21～0.56之間，其中干燥在PANOs降解中起最重要的作用。此外，在泡茶過程中，PANO的傳輸率（≥75.84%）比PAs（≤56.53%）更高。

3.2" 國外茶葉中PAs殘留研究狀況

目前，對茶葉中PAs的污染來源及水平研究較為系統的國家有奧地利、德國、意大利等歐洲國家。Martins等^[42]通過對茶葉、蜂蜜和牛奶等樣品中PAs含量進行檢測，結果顯示茶葉樣品中PAs的最大含量為215 μg/kg。德國聯邦風險評估研究所檢測了茶葉、花草茶、藥茶中的PAs，結果表明部分茶葉、花草茶產品中的PAs含量比較高^[43]，這一結果引起了各國政府及研究人員的廣泛關注。2023年5月，歐盟正式規定了茶葉和代用茶中PAs的含量不得超過150 μg/kg^[44]，此限量要求是對21種吡咯里西啶類生物堿的總和進行計算，但沒有公布對應的檢測方法。Bodi等^[45]對德國市場上6個茶類及花草茶共274種樣品中的PAs含量進行了分析，其中污染最為嚴重的為博士茶，其PAs平均含量為1 856.4 μg/kg，最高含量達到5 647.2 μg/kg，通過鑒定認為茶園中的雜草PAs植物千里光可能是博士茶PAs的污染源。Marianna^[24]監測了2019年3月至2020年9月在意大利出售的33份茶及花草茶樣品中的20種PAs，其中三分之一的樣品檢出PAs，平均含量為64 μg/kg；最大含量為311 μg/kg；1份馬郁蘭、薄荷、鼠尾草和茴香種子的混合花草茶中PAs含量超過了歐盟規定的PAs最大限量。

4" 茶葉中PAs健康風險

4.1" 茶葉中PAs的毒性作用

茶葉中PAs及其N-氧化物具有肝毒性、肺毒性、腎臟毒性、致癌性、發育毒性等一系列毒性作用。其中，肝臟作為哺乳動物最大的解毒器官，是PA和PA N-氧化物的主要靶器官，長期攝入PAs可誘導引發肝竇阻塞綜合征（HSOS），臨床癥狀表現為肝臟充血和腫脹、肝血管阻塞竇內皮細胞脫離及導致肝功能不全。歐盟規定限量的促黑激素、石松胺、倒千里光堿、天芥菜堿、千里光非靈堿、千里光堿、克氏千里光寧堿均有肝毒性作用^[46-47]，克氏千里光寧堿、毛果天芥菜堿具有致突變毒性^[48]。

不同種類的PAs在肝毒性上表現出不同的強度，Wang等^[49]發現千里光堿（倒千里光堿型）、藍薊定（倒千里光堿型）、天芥菜堿（天芥菜堿型）和克氏千里光寧堿（奧索千里光裂堿型）對HepaRG細胞均表現出毒性作用，毒性大小表現為：千里光堿gt;藍薊定/天芥菜堿gt;克氏千里光寧堿。

一種PAs還可表現出多種毒理特性。Benamar等^[50]報道，藍薊定抑制了乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，半數最大抑制濃度（IC₅₀）為（0.397±0.006） mmol/L。另有研究表明，接觸藍薊定導致肝細胞存活抑制，IC₅₀值為13.79 μg/mL^[51]，單次暴露24 h后，可誘導HepaRG細胞凋亡^[52]。Lin等^[53]報道，斑馬魚胚胎接觸到藍薊定會導致發育毒性，具體表現為延遲孵化和體長縮短。

PAs還具有聯合毒性作用，研究發現混合PAs的肝細胞毒性大于任何單一PA的肝細胞毒性。Wang等^[5]發現促黑激素、促黑激素氮氧化物、石松胺、石松胺氮氧化物、倒千里光堿、倒千里光堿氮氧化物、千里光寧堿和千里光寧堿氮氧化物混合物在低含量（5 μg/mL）下即可對Hep D細胞活力產生顯著抑制作用，而促黑激素單一作用時，當質量濃度達100 μg/mL時才可以誘導Hep D細胞凋亡。

4.2" PAs的限量標準

PAs廣泛存在于日常食品中，長期膳食暴露低劑量PAs伴隨慢性肝損傷風險，已被世界衛生組織列為二類致癌物。鑒于PAs對人體健康具有潛在危險性，食品中PAs的安全性已經成為許多國家和國際組織監管部門關注的焦點，訂立了食品中PAs最大允許量或每日攝入量。《IPCS健康與安全指南第26號：吡咯里西啶類生物堿的健康和安全指南》于1989年由世界衛生組織（WTO）頒布，其建議PAs的攝入量每日不大于15 μg/kg。2011年，歐盟建議不飽和PAs的日攝入量不超過0.007 μg/kg。2016年，歐洲食品安全局發布的PAs膳食暴露的評估報告中指出，歐洲人攝入PAs的主要來源是草藥和茶^[54]。在對食品中PAs含量及其對消費者健康潛在風險的大量研究之后，歐盟委員會發布了法規（EU）2023/915，于2023年5月實施，該法規規定了茶葉中PAs的最大殘留限量為150 μg/kg，該限量為21種PAs的總和。目前我國尚未對食品中PAs含量作出明確的規定，僅在《中國藥典》2020年版“千里光”項中對阿多尼弗林堿的含量作出了規定，要求每克藥材中含量不超過40 μg^[55]。

5" 結語

PAs廣泛存在于食品中，PA及其氧化物具備多種毒性作用，其毒性大小與結構相關。當前，液相色譜-串聯質譜技術應用廣泛，也是痕量分析茶葉中PAs的主要手段，而液相和高分辨質譜聯用技術可應用于有效篩查和鑒定茶葉中未知PAs。長期低劑量暴露PAs將嚴重危及人體健康，為此，歐盟規定了茶葉中PAs的最大殘留限量，對我國茶葉出口造成重大影響。目前我國缺乏茶葉中PAs的檢測標準，因此建議制定茶葉中PAs相關檢測標準，建立一套茶葉中不少于歐盟規定的21種PAs測定的LC-MS/MS檢測方法及茶葉中PAs篩查與鑒定的LC-HRMS方法，篩查與鑒定我國茶葉中的未知PAs，同時對我國出口歐盟的茶葉及進口茶葉進行監測，對其污染特征、含量水平進行本底調查，開展潛在的質量風險評估，為確保我國茶葉質量安全、積極應對歐盟貿易壁壘提供強有力的技術保障。

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基金項目：國家重點研發計劃（2022YFD1600803）

作者簡介：焦艷娜，女，高級工程師，主要從事茶葉質量安全研究。*通信作者，E-mail：zhonghua-liu@hunau.edu