基于多酶恒溫快速擴增-側向流層析聯用技術的肉制品真實性研究

尚 柯，張 彪，張 敏，楊華雨，葉 梅，段慶梓，王 巍，宮亞君

（成都市食品檢驗研究院，四川 成都 611135）

食品真實性以實現消費信任為目標，防止摻假與欺詐[1]，保證食品的安全與可靠，是全球食品安全領域的新熱點[2]，是當前食品安全監管領域的重點、難點?？v觀世界食品產業發展歷程，從初始作坊式發展時期，到工業化生產時期，乃至現代食品產業體系建立時期，從兩千多年前的古代社會到今天的現代社會，全球各個國家和地區食品摻假與欺詐行為一直存在[3-5]?！蛾套哟呵铩绕s下》中“君使服之于內，而禁之于外，猶懸牛首于門而賣馬肉于內也”和宋代釋普濟的《五燈會元》卷十六“懸羊頭，賣狗肉，壞后進，初幾滅”是關于我國食品摻假的最早記載。13世紀意大利即有了食品造假的記載[6]，英國19世紀是牛奶摻假的盛行時期，其中尤以19世紀后半葉最為嚴重[7]，南北戰爭前后，美國也同樣經歷了一個食品摻假肆虐橫行的漫長過程。2013年“馬肉冒充牛肉事件”以來[8]，歐盟建立了食品和飼料快速預備警系統[9]，將食品真實性技術研究列入“歐盟地平線2020計劃”項目重點研究領域；美國藥典委員會建立了食品欺詐數據庫，美國食品保護與防御國家中心創建了經濟利益驅動型摻假食品欺詐數據庫[10]；2014年，我國食品科學界將食品真實性單列出來，與食品安全和食品質量并駕齊驅，成為消費者關注的熱點。

隨著科技的發展，肉制品真實性檢測方法越來越多樣化，基于核酸擴增技術的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、實時熒光PCR等技術可以從樣品中檢測出痕量目標分子，具有靈敏特異等諸多優勢，已經成為食品真實性研究的一個基本和必要的技術手段，并在檢測領域中廣泛應用[11-12]。如GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》[13]、SN/T 3730—2013[14]、SN/T 3731—2013[15]等系列標準已成為目前食品檢測實驗室的常用技術，但是傳統的擴增技術對實驗室、儀器及人員要求較高，不適于基層實驗室及現場檢測的需求，快速、便攜、可應用于即時檢驗的核酸擴增技術相對缺乏[16-17]。近年來，恒溫核酸擴增技術的快速發展促進了核酸擴增技術在現場快檢中的應用，它不需要高溫變性、退火等步驟，對精密儀器依賴程度大大降低，是實現現場快檢有效的技術手段，被廣泛應用于食品安全、臨床診斷、法醫學、農業和流行病學等領域[18-19]。

多酶恒溫快速擴增（multienzyme isothermal rapid amplification，MIRA）技術是在重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術的基礎上發展起來的一種多酶恒溫核酸快速擴增方法[20]，其技術原理如圖1所示。在37 ℃條件下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸，依賴核酸內切酶的作用，加入根據模板設計的特異性分子探針[21-22]，結合封閉式側向流層析（lateral flow dipstick，LFD）技術，實現擴增產物快速檢測[23]。該方法與側流式膠體金法有機結合，不僅能達到簡捷、靈敏、特異檢測的目的，而且能更好地為現場動物源性成分檢測提供可視化應用服務[24-25]。

圖1 MIRA技術原理Fig.1 Principle of MIRA

為了提高肉制品真實性檢測方法的可操作性，建立建全肉制品真實性檢測的快檢方法，本實驗針對肉制品建立了牛、羊、豬、雞、鴨專屬性MIRA-LFD檢測方法，以期為監管部門提供肉制品真實性現場快檢技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用樣品均來自成都市風險監測項目。

細胞/組織基因組提取試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；Qiagen QIAamp DNA mini Kit 德國Qiagen公司；PCR Mix、Marker、Loading緩沖液、Gold View染料 天根生化科技（北京）有限公司；DNA恒溫快速擴增試劑盒 濰坊安普未來生物科技有限公司；側流式膠體金試紙條 德國Milenia Biotec公司；SsoAdvanced? Universal Probes Supermix 美國Bio-Rad公司；RNA酶、淀粉酶 美國Sigma公司；其他試劑為國產分析純；水為滅菌去離子水。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Academic實驗室超純水儀 美國Millipore公司；MM400行星球磨儀 德國Retsch公司；Centrifuge 5427R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ME2002E電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；BSA224S電子天平德國賽多利斯公司；MK3渦懸振蕩器 德國IKA公司；P330核酸蛋白定量儀 德國Implen公司；Thermo-Shaker BG-100干式恒溫器 杭州瑞誠儀器有限公司；熒光定量PCR儀、XR+凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物探針設計

引物及探針均為自行設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，最終確定的引物探針名稱及序列見表1。

表1 引物探針信息Table 1 Sequences of primers and probes

1.3.2 引物探針篩選

1.3.2.1 陽性對照引物組篩選

根據設計的22 條正向引物、23 條反向引物、9 條探針進行交叉組合，陽性對照引物組合共計74 組，電泳反應體系（50 μL）包括29.4 μL的A緩沖液、1.0 μL目標源性核酸模板和2.5 μL B緩沖液、每對引物（10 μmol/L）各0.25 μL，并用去離子水補足50 μL，設立以滅菌去離子水為DNA模板的空白對照組；同時以MIRA試劑盒提供的正對照模板單元作為實驗質控對照。正對照體系配制（由試劑盒提供）：1 μL正對照模版、4 μL正對照引物Mix（包含上/下游引物），其他組分如上體系配制。反應程序為37 ℃、5 min。對反應產物用3%瓊脂糖凝膠進行水平電泳，并用凝膠成像系統記錄結果。

1.3.2.2 空白對照引物組篩選

根據1.3.2.1節的實驗結果，MIRA陽性對照引物探針組合共計96 對，MIRA-LFD膠體金反應體系（50 μL）包括29.4 μL A緩沖液、2.0 μL去離子水和2.5 μL B緩沖液、每對引物（10 μmol/L）各1.0 μL、探針（10 μmol/L）0.3 μL，并用去離子水補足50 μL，設立動物源性成分肉制品為陽性對照，以去離子水為DNA模板的空白對照組。反應程序為37 ℃、5 min。吸取10 μL反應液加入190 μL去離子水中，插入膠體金試紙，通過膠體金試紙直接判讀結果，C線為控制線，T線為檢測線。

1.3.2.3 陰性對照引物組篩選

根據1.3.2.2節的實驗結果，篩選空白對照中未出現檢測線（T線）的引物探針組合33 對，MIRA-LFD膠體金反應體系（50 μL）包括29.4 μL A緩沖液、2.0 μL陰性對照核酸模板和2.5 μL B緩沖液、每對引物（10 μmol/L）各2.0 μL、探針（10 μmol/L）0.6 μL，并用去離子水補足50 μL。其中，陰性對照分別為牛、羊、豬、雞和鴨樣品提取的DNA模板。反應程序為37 ℃、5 min；吸取10 μL反應液加入190 μL去離子水中，插入膠體金試紙，通過膠體金試紙直接判讀結果，C線為控制線，T線為檢測線。其中樣品編號N為牛源性成分，Y為羊源性成分，Z為豬源性成分，C為雞源性成分，D為鴨源性成分檢測，B為相應引物探針的空白對照。

1.3.3 MIRA-LFD檢測方法建立

1.3.3.1 檢測體積篩選

根據1.3.2節篩選確定的引物探針組合，考察不同引物探針體積對MIRA反應體系的影響。MIRA-LFD膠體金反應體系（50 μL）如表2所示。其中，樣品分別為牛、羊、豬、雞和鴨樣品提取的DNA模板。

表2 反應體系組合Table 2 Composition of different reaction systems μL

1.3.3.2 反應溫度篩選

根據確定的反應體系，考察不同溫度對MIRA反應體系的影響，選擇30、37、40、45、50 ℃進行實驗。MIRA-LFD膠體金反應體系（50 μL）包括29.4 μL A緩沖液、1.0 μL不同陽性對照核酸模板和2.5 μL B緩沖液、每對引物各0.25 μL、探針0.075 μL，并用去離子水補足50 μL。反應程序為30、37、40、45、50 ℃，分別進行反應。

1.3.3.3 反應時間篩選

根據以上確定的反應體系和溫度，考察反應時間對MIRA反應體系的影響，選擇1、5、10、15、25 min反應時間進行實驗。MIRA-LFD膠體金反應體系（50 μL）包括29.4 μL A緩沖液、1.0 μL不同陽性對照核酸模板和2.5 μL B緩沖液、每對引物各0.25 μL、探針0.075 μL，并用去離子水補足50 μL。反應溫度為37 ℃，反應時間分別為1、5、10、15、25 min。

1.3.3.4 檢出限確定及MIRA-LFD檢測體系建立

稱取200 mg牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉組織，分別轉移至2.0 mL的離心管中。然后向每個離心管加入400 μL細胞裂解液（由DNA提取試劑盒提供）和20 μL蛋白酶K（由DNA提取試劑盒提供），充分振蕩混勻，置于55 ℃過夜裂解，直至樣品裂解完全。

樣品完全裂解后，以一種動物源性組織裂解液為樣品，以另一種動物源性組織裂解液為本底配制10%、1%、0.1%和0.01%（體積分數）的模擬樣本。分別進行DNA提取，依照實時熒光PCR法（依據GB/T 38164—2019）和MIRA-LFD法進行實驗。

1.3.4 方法學考察

1.3.4.1 快提試劑盒考察

將建立的MIRA-LFD方法與DNA快提試劑盒相結合，考察這兩種方法之間的適應性，并且與現有DNA提取方法比較，樣品信息見表3。

表3 樣品信息及風險監測結果Table 3 Sample information and risk monitoring results

1.3.4.2 靈敏度考察

靈敏度是指方法在實驗條件下達到實際檢出限時，檢出陽性結果的樣品數占總陽性樣品數的百分比，分別選擇牛、羊、豬、雞、鴨的檢測體系進行10 個樣品的靈敏度考察，確定方法的靈敏度。

1.3.4.3 特異性考察

采用快檢方法及其相關產品的交叉反應率反映產品的特異性，即目標源性成分檢出限與非目標源性成分檢出陽性的最小濃度的比值（以百分比計）。分別將目標成分與非目標成分按一定比例混合，評價方法的特異性，記錄檢測結果為陽性的最小濃度。當加入非目標源性成分濃度水平大于或等于檢出限的1 000 倍時，特異性（交叉反應率）視為小于1%。

1.3.4.4 假陽性率與假陰性率考察

按照本方法建立的反應參數、體系、反應條件，對方法進行假陽性率與假陰性率的考察。分別選擇牛、羊、豬、雞、鴨的檢測體系進行5 種物種的假陽性率與假陰性率的考察。樣品來源于日常風險監測，具體情況見表3。

1.4 假陰性率與假陽性率計算

2 結果與分析

2.1 引物探針設計結果

本方法選取被廣泛應用于物種鑒別的線粒體基因細胞色素氧化酶b（cytochrome oxidase b，Cyt b）基因、線粒體細胞色素c氧化酶I亞基（cytochrome coxidase subunit I，Cox I）和線粒體DNA 12S rRNA（12S）作為靶基團，在GenBank數據庫中選擇牛（GU249568.1）、豬（X56295）、羊（AF010406）、雞（MT800504.1）、鴨（U59666.1）的基因序列進行引物和探針的設計（表4）。

表4 引物探針序列比對靶基因Table 4 Target gene-specific primer and probe sequences

在引物設計時，選擇堿基排布隨機性高、GC相對含量在30%～70%之間的引物序列，并且在下游引物的5’端標記biotin修飾基團；對于MIRA法的探針序列，應避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基，長度一般在46～52 nt，在5’端修飾一個FAM標記，在距5’端約30 nt序列位置上標記一個dSpacer（四氫呋喃）作為nfo（核酸內切酶）的識別位點，另外THF距離3’末端約15 nt，并且3’末端標記一個C3 spacer修飾基團。

根據物種序列比對結果，結合MIRA引物探針設計原則，對牛、羊、豬、雞、鴨的引物和探針序列進行高級結構分析比對，以確保其高度的特異性，防止出現二聚體、莖環及發卡等影響檢測效率的結構，共設計22 條正向引物、23 條反向引物、9 條探針。

2.2 引物探針篩選結果

2.2.1 陽性對照篩選研究

根據74 對引物與試劑盒配套陽性對照結果（以鴨源性檢測為例，見圖2），70 對引物組合陽性對照均出現條帶（除N1～N4），但其中D3組合和D6組合空白對照結果出現明顯引物二聚體，因此篩選其他引物組合與相應的探針進行后續實驗。

圖2 鴨源性成分陽性對照篩選結果Fig.2 Results of positive control screening for duck-derived ingredients

2.2.2 空白對照篩選研究

96 對引物探針空白對照篩選結果表明（以牛源性檢測為例，見圖3），33 對引物探針組合空白對照未出現T線，表明未出現非特異結合；其余63 對引物探針均出現T線，因此選擇33 對未出現T線的引物探針組合進行后續實驗。

圖3 牛源性引物探針空白對照篩選結果Fig.3 Results of blank control screening for bovine-derived primers and probes

2.2.3 陰性對照篩選研究

根據33 對引物探針陰性對照結果（以豬源性檢測部分結果為例，見圖4），5 對引物探針組合（分別為牛源性F3R1P1、豬源性F3R4P2、羊源性F3R3P、雞源性BF3BR3BP和鴨源性BF2BR2BP）結果最為理想，無非特異結合現象。

圖4 豬源性引物探針陰性對照篩選結果Fig.4 Results of negative control screening for porcine-derived primers and probes

在此基礎上，分別對5 對引物探針組合增加陰性對照物種數，進一步考察這5 對引物探針組合的特異性，MIRA-LFD結果見圖5。

圖5 陰性對照篩選結果Fig.5 Results of negative control screening

實驗篩選出的5 對引物探針組合在牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、狐貍、貂、貓和海貍鼠為陰性（其中包括引物探針對應的陽性情況）表現出良好的特異性，未出現明顯的非特異性結合，因此將這5 種組合（牛源性F3R1P1、豬源性F3R4P2、羊源性F3R3P、雞源性BF3BR3BP和鴨源性BF2BR2BP）作為該項目檢測牛、羊、豬、雞和鴨源性體系的引物探針組合。

2.3 MIRA-LFD檢測體系建立

2.3.1 反應體積篩選結果

根據圖6結果顯示，各組合C線均出現條帶，組合2中CB、組合3中的YB、組合4中的YB和CB的檢測線T線均出現明顯條帶，說明隨著濃度增高，假陽性結果隨之升高，因此選擇最終確定的引物探針添加量為引物0.25 μL、探針0.075 μL。

圖6 引物探針體積篩選結果Fig.6 Results of screening of primer and probe volumes

2.3.2 反應溫度篩選結果

根據圖7結果顯示，30、37、40 ℃樣品動物源性成分檢測結果T線均出現明顯條帶，但在37 ℃條件下實驗結果最好。40 ℃羊源性、豬源性、雞源性樣品空白對照T線均出現明顯條帶，說明出現了非特異性擴增情況。50 ℃條件下，T線條帶均不明顯，推測50 ℃影響了酶的活性。因此選擇37 ℃作為MIRA-LFD反應的溫度。

圖7 反應溫度篩選結果Fig.7 Results of reaction temperature screening

2.3.3 反應時間篩選結果

根據圖8結果顯示，隨著反應時間的延長，MIRALFD檢測體系中的非特異結合更易出現（圖中空白對照結果）。因此選擇5 min作為MIRA-LFD檢測體系的反應時間。

圖8 反應時間篩選結果Fig.8 Results of reaction time screening

2.3.4 檢出限研究及方法建立

根據圖9結果顯示，熒光定量PCR均檢出混合樣品中的相應動物源性，并且不同稀釋度之間呈良好的梯度，表明上述混樣方法有效。根據圖10結果顯示，膠體金試紙條出現明顯色差，證明可以通過膠體金顏色的深淺判斷樣品中是否含有相應的動物源性成分，其中牛源性成分的檢出限為1%，羊源性成分的檢出限為1%，豬源性成分的檢出限為0.1%，雞源性成分的檢出限為0.1%，鴨源性成分的檢出限為1%，所有方法的檢出限均能達到1%。

圖9 牛、羊、豬、雞、鴨源性成分實時熒光PCR檢出限結果Fig.9 Detection limits of fluorescent real-time PCR for bovine,porcine,ovine,chicken and duck-derive ingredients

圖10 混合樣品牛、羊、豬、雞、鴨成分檢出限Fig.10 Detection limits of bovine,porcine,ovine,chicken and duckderived ingredients in mixed samples

根據以上篩選與研究，最終確定的MIRA-LFD反應體系及條件為：引物（10 μmol/L）各0.25 μL、探針（10 μmol/L）0.075 μL、A緩沖液29.4 μL、B緩沖液2.5 μL、模板DNA 1 μL，滅菌去離子水補足50 μL。37 ℃反應5 min，吸取10 μL反應液加入190 μL去離子水中，插入膠體金試紙，通過膠體金試紙直接判讀結果。本方法的檢出限為1%。

2.4 方法學考察結果

2.4.1 快提試劑盒與傳統試劑盒比對

根據圖11結果顯示，本方法采用DNA快速提取方法與傳統DNA提取方法結果一致，均檢出相應的動物源性成分。

圖11 傳統DNA提取試劑盒與快提試劑盒方法比對結果Fig.11 Comparison of traditional and rapid DNA extraction kits

2.4.2 靈敏度考察結果

靈敏度考察結果見圖12與表5。結果顯示，本實驗建立的牛、豬、羊、雞、鴨方法的靈敏度分別為90%、100%、100%、100%、80%，平均靈敏度為94%。

表5 靈敏度考察數據Table 5 Sensitivity of the method

圖12 靈敏度考察結果圖Fig.12 Results of sensitivity analysis

2.4.3 特異性考察結果

特異性考察結果見圖13與表6。結果顯示，本實驗建立的牛、豬、羊、雞、鴨方法的特異性均達到1%。

表6 特異性考察數據Table 6 Specificity of the method

圖13 特異性考察結果Fig.13 Results of specificity analysis

2.4.4 假陽性率、假陰性率考察結果

假陽性率、假陰性率考察結果見表7。以表3實時熒光PCR結果作為對比依據，結果顯示，本實驗建立的牛源性檢測方法假陽性率為0%，假陰性率為2.56%；豬源性檢測方法假陽性率為7.69%，假陰性率為5.13%；羊源性檢測方法假陽性率為4.76%，假陰性率為0%；雞源性檢測方法假陽性率為0%，假陰性率為10%；鴨源性檢測方法假陽性率為5%，假陰性率為0%；方法的平均假陽性率為3.49%，假陰性率為3.54%。

表7 假陽性率、假陰性率考察Table 7 False positive and false negative rates of the method

3 結論

自2006年Piepenburg等[26]研發出RPA技術以來，RPA技術發展極為迅速[27]，在醫療診斷、農業、食品等方面的應用越來越廣泛，本研究所涉及的MIRA法就以RPA技術為基礎，在一定程度上優化了多酶條件下相關試劑的穩定性，更易于在實際檢測中的應用。鑒于肉類摻假現象的出現，基于DNA的肉類鑒定方法已成為食品真實性鑒定的首選方法[28]。

項目組建立了MIRA-LFD快速檢測方法，本方法可在10 min內動物源性成分檢測，方法的檢出限可達1%；對建立的方法進行靈敏度考察、特異性考察、假陽性率、假陰性率考察[29-30]，該試劑盒平均靈敏度為94%，特異性為1%，方法的平均假陽性率為3.49%、假陰性率為3.54%，均未超過20%，使用市售商業化DNA快速提取試劑進行比對，結果與傳統DNA提取試劑盒一致，說明MIRA-LFD的多酶反應體系適用于DNA快速提取和常規提取方法?？焖貲NA提取方法在時效性、操作性和對實驗人員危害性等方面明顯優于現有DNA提取方法，在提高檢測效率的同時為現場快速檢測提供了一種解決方案，在現場檢測中具有廣闊的應用前景。

項目承擔單位組織中國檢驗檢疫科學研究院農產品安全研究中心、天津海關植物與食品檢測中心、成都海關技術中心3 家單位采用本項目研發的引物探針、膠體金試劑盒及操作說明，對提供的不同基質的樣品進行了豬、牛、羊、雞、鴨源性成分的靈敏度、特異性、假陽性率、假陰性率驗證。聯合驗證的結果表明，該方法的平均靈敏度88%～92%，特異性均達到1%，假陽性率9.70%～14.51%，假陰性率6.56%～14.54%。評價結果均為該試劑盒可靠有效。本研究開發了現場快速可視化檢測肉制品中動物源性成分的方法，該方法特異性強、靈敏度高，同時大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，可用于現場的肉制品真實性鑒別。結果表明，該方法是一種高效、靈敏、特異、高實用性的動物源性成分鑒別方法，為肉制品的真實性鑒定和摻假提供了更加準確和科學的檢測方法，為監管部門提供技術標準與檢測依據，使基層實驗室和現場真實性快檢成為可能。