氧化條件下姜黃素對豬肉肌原纖維蛋白理化和凝膠特性的影響

常海軍，石源偉，伯朝英，周文斌，胡 渝

（重慶工商大學環境與資源學院，重慶市特色農產品加工儲運工程技術研究中心，重慶 400067）

肌原纖維蛋白占肌肉總蛋白的55%～60%，是肌肉中含量最高的一種蛋白，主要由肌動蛋白和肌球蛋白構成[1]。肌原纖維蛋白的一個重要特性就是在熱加工過程中能形成凝膠，對肉制品的保水性、質構和感官等起著至關重要的作用[2]。然而肉蛋白在運輸、儲存以及加工過程中易受到外界環境的影響發生氧化，導致其物理化學和結構性質的變化，蛋白氧化對肌原纖維蛋白功能特性的改變是影響肉和肉制品品質的主要因素，氧化導致蛋白質分子間共價交聯，可促進凝膠化和乳化的可溶性聚合物或不溶性聚合物的產生，從而降低其凝膠性能，影響產品的質量[3]。植物多酚的介導會影響蛋白質分子間共價鍵交聯，對凝膠保水性、流變學特性、彈性模量、凝膠強度等凝膠特性產生影響，從而影響蛋白凝膠性能[4]。Chen Bo等[5]研究發現添加谷胱甘肽會促進肌原纖維蛋白中二硫鍵的形成，增加蛋白質的交聯作用，提高其凝膠特性，同時研究表明植物多酚類物質會和蛋白質發生共價或非共價修飾作用，進而影響其蛋白凝膠穩定性。

近年來，天然植物多酚因其來源廣泛、價格低廉、種類繁多、安全性高等優點而備受關注。目前，研究以植物多酚為代表的天然抗氧化劑誘導調控肌肉蛋白氧化及對功能特性的影響已成為肉品科學技術領域的研究熱點。姜黃素是從姜科植物根莖中分離的一種具有二酮結構的多酚化合物，是一種廣泛使用的天然活性物質之一[6]，作為一種食品添加劑，姜黃素還具有抗炎、抗癌、抗菌、抗氧化等多種生物活性功能[7]。因副作用小、價格低且容易獲得，姜黃素在食品營養及醫藥方面的重要性逐漸凸顯出來，它的生物學作用成為近年來的研究熱點之一，其中最受關注的是抗氧化作用。

雖然姜黃素在許多方面的生物活性得到廣泛的研究，但是在肉蛋白抗氧化或與蛋白相互作用方面的研究仍較少。目前鮮見針對植物多酚姜黃素用于調控肉蛋白氧化程度提高肉制品品質相關報道，其調控肉蛋白氧化穩定性和凝膠特性機理尚待進一步闡明。因此，本研究以豬肉肌原纖維蛋白為對象，創建Fenton氧化體系模擬肉制品的氧化環境，探究不同濃度水平姜黃素對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠特性的影響，以期為天然多酚類物質在肉制品抗氧化中應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長肌購于重慶市南岸區五公里人人樂超市。剔除可見的脂肪組織后，順著肌纖維方向切成100 g左右的肉條，真空密封包裝后，貯存于4 ℃備用。

十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、氯化鎂（MgCl2）、三氯乙酸、戊二醛、叔丁醇、冰醋酸成都市科龍化工試劑廠；姜黃素（純度≥97%）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、牛血清白蛋白、酒石酸甲鈉（NaKC4H4O6）、氫氧化鈉（NaOH）、L-抗壞血酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸、水溶性VE（Trolox）、尿素、考馬斯亮藍染色液、聚丙烯酰胺 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯化鐵（FeCl3）、雙氧水（H2O2，30%）、β-巰基乙醇 上海阿達瑪斯試劑有限公司；標準蛋白（Marker）北京索萊寶科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MARS40（哈克）旋轉流變儀 賽默飛世爾科技有限公司；S-8020掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；TAXT Plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；CR400色差儀 日本美能達公司；TGL-20高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；LM-861多功能破壁機 廣東順德多蒙電器有限公司；DGG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱上海齊欣科學儀器有限公司；L G J-1 0 冷凍干燥機北京松源華興科技發展有限公司；Ultra-Turrax T25高速均質勻漿機 德國IKA-WERKE公司；V2000可見分光光度計、FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV-1900紫外-可見分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；DYCZ-MINNI2電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取及濃度測定

以豬背最長肌為原材料，參照Cao Yungang等[8]的方法提取肌原纖維蛋白：將冷藏備用的肉切成小塊置于絞肉機中并加入4 倍體積的肌原纖維蛋白提取液（10 mmol/L磷酸鈉、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH 7.0）于點動模式下運行30 s，再于長動模式下運行1 min，勻漿后經冷凍離心（8 000×g、10 min、4 ℃），傾去上清液，所得沉淀再加入4 倍體積的肌原纖維蛋白提取液，重復提取3 次，最后將所得沉淀加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，攪拌均勻并用3 層紗布過濾以除去殘余的結締組織，調節pH值為6.25后離心（8 000×g、10 min、4 ℃），所得白色膏狀沉淀即為肌原纖維蛋白。整個提取過程在0～4 ℃條件下進行，肌原纖維蛋白于4 ℃保存并48 h內使用。采用周非白[9]所述的雙縮脲法測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白作為標準蛋白，制作蛋白質的標準曲線。

1.3.2 氧化介導的姜黃素-肌原纖維蛋白凝膠的制備

凝膠的制備參照Lv Yuanqi等[10]的方法并稍作修改，準確稱取5 g上述1.3.1節中所提取的肌原纖維蛋白于50 mL離心管中，加入20 mL不同濃度梯度姜黃素（0（blank）、5、10、15、20 μmol/L），同時制備不含抗氧化劑但含有氧化因子（5 mmol/L H2O2）的氧化對照組（o x），均質后，于4 ℃氧化反應12 h，再加入1 mL Trolox（終濃度為1 mmol/L）振蕩搖勻，再置于室溫平衡30 min待離心管壁上不再有大量的蛋白樣液后，密封好，將樣品置于水浴鍋中，從室溫（25 ℃左右）緩慢升溫至80 ℃（2 ℃/min）再保溫10 min，取出置于冰水中冷卻至常溫，置于4 ℃環境中貯藏過夜。在測定凝膠性能之前，應該將制得的凝膠樣品取出在常溫中平衡2 h之后再進行下步操作。含0、5、10、15、20 μmol/L姜黃素的組別分別命名為blank、ox+c5、ox+c10、ox+c15、ox+c20。

1.3.3 肌原纖維蛋白凝膠特性測定

1.3.3.1 凝膠白度

凝膠色差值的測定參照Xia Xiufang等[11]的方法，色差儀經自檢、調零、白板校正后，進行凝膠樣品的測定，每個樣品測定3 次，取其平均值。其中L*表示明暗度，數值越大表示越亮，相反則越暗；a*表示紅綠度，正值表示偏紅，負值表示偏綠；b*表示黃藍度，正值表示偏黃，負值表示偏藍。凝膠白度的計算如式（1）：

1.3.3.2 凝膠蒸煮損失與保水性

凝膠蒸煮損失測定：蒸煮前準確稱取離心管的質量記作m0/g，凝膠和離心管的總質量記作m1/g，蒸煮（具體步驟同1.3.2節）后倒掉水分后稱其總質量為m2/g，肌原纖維蛋白凝膠蒸煮損失計算如式（2）：

凝膠保水性的測定：參照熊杰[12]的方法并稍作修改，準確稱取1.3.2節制得的凝膠10 g分裝于離心管中，離心（4 ℃、8 000×g、15 min）除去水分，稱質量，每個樣品重復操作3 次，凝膠保水性的計算如式（3）：

式中：M1為離心后離心管與凝膠的總質量/g；M2為離心前離心管和凝膠的總質量/g；M0為離心管質量/g。

1.3.3.3 凝膠強度與質構

凝膠強度測定：利用質構分析儀測定凝膠的強度，同樣將平衡2 h除去可見的游離水的凝膠置于測試平臺上固定好，進行Return to Start測試。探頭型號：P/0.5，觸發力：5 g，下壓距離：6 mm，測前速率：2 mm/s，測中速率：1 mm/s，測后速率：2 mm/s。

凝膠全質構測定：參照韓馨蕊等[13]的方法并略加修改，利用質構分析儀測定凝膠的全質構，將平衡2 h除去可見的游離水的凝膠置于測試平臺上進行全質構測定。探頭型號：P/75，下壓比：50%，觸發力：5 g，測前速率：2 mm/s，測試速率：1 mm/s，測后速率：1 mm/s。

1.3.4 肌原纖維蛋白凝膠動態流變學特性測定

不同處理方式的樣品凝膠動態流變學特性的測定方法參照Du Juanjuan等[14]描述的方法并稍作修改，肌原纖維蛋白凝膠（0.2 g/mL），經離心（4 ℃、800 r/min、30 s）脫氣后備用。采用振蕩溫度掃描測試模塊，安裝P20/Ti-01210465型轉子，儀器調零后，將脫氣的樣品均勻布滿在儀器平臺上，用硅油密封平板外蛋白質和空氣的接觸位置，以防加熱導致蛋白液蒸發，再進行20～80 ℃的溫度掃描。測定參數：振蕩頻率為0.1 Hz，最大應力為2%，上下板狹縫為1 mm，以2.1 ℃/min的升溫速率加熱樣品，在此過程中記錄凝膠的儲能模量（G’）和損耗模量（G”）。

1.3.5 肌原纖維蛋白凝膠分子間作用力測定

參照Zhang Zhongli等[15]的描述并稍作修改，將1.3.2節制得的凝膠準確稱取2 g加入10 mL S1（0.6 mol/L NaCl），6 000 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h后離心（4 ℃、8 000×g、20 min），4 ℃保留上清液；上述沉淀加入10 mL S2（1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl混合溶液），6 000 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h，相同條件下離心20 min，上清液于4 ℃保存；將上述沉淀加入10 mL S3（8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl混合溶液），6 000 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h，相同條件下離心20 min，上清液于4 ℃保存，重復此操作，將兩次離心的上清液合并，4 ℃保存；繼續向沉淀中加10 mL S4（0.5 mol/Lβ-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素混合液，pH 7），6 000 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h，相同條件下離心20 min，上清液于4 ℃保存，經S4提取后所得沉淀加入2 mL 0.1 mol/L NaOH充分溶解后于4 ℃保存。通過雙縮脲法測其上清液的蛋白含量。其中離子鍵：以溶解于S1的蛋白含量表示；氫鍵：以溶解于S2的蛋白含量表示；疏水鍵：以溶解于S3的蛋白含量表示；二硫鍵：以溶解于S4的蛋白含量表示；非二硫鍵：以經S4提取液后所得沉淀溶于NaOH的蛋白含量表示。

1.3.6 肌原纖維蛋白凝膠微觀結構觀察

參照Zhao Yinyu等[16]描述的方法，將制得的凝膠樣品準確稱取10 g，用小刀切成2 mm×2 mm×5 mm的小條，加入10 mL 2.5%戊二醛溶液（溶于磷酸緩沖液中，pH 6.8）浸泡過夜，固定12 h后加入10 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 6.8）洗滌3 次，每次10 min，隨后依次用體積分數50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液進行脫水處理，每次10 min，再用10 mL無水乙醇脫水，每次10 min，共3 次。脫水完成后再加入10 mL氯仿進行脫脂1 h，再用無水乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V），以及叔丁醇各進行置換1 次，每次15 min，最后將樣品冷凍24 h后于冷凍干燥機中干燥。干燥后的樣品緊貼于掃描電子顯微鏡樣品臺上并噴金處理，加速電壓為2.0 kV，放大30 000 倍進行觀察。

1.3.7 肌原纖維蛋白凝膠電泳

電泳樣品制備參照曹云剛[17]所描述的方法進行，準確稱取5 g蛋白凝膠，研磨之后置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，3 000 r/min均質1 min后于80 ℃水浴1 h，取出冰水冷卻至室溫，離心（3 000×g、15 min），以除去不溶物。將上清液用哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液稀釋至20 mg/mL后用于電泳樣品的制備，其余過程與蛋白樣液電泳操作步驟相同。

1.4 數據處理

每組樣品設置3 個平行組，實驗測試重復3 次，所有數據用表示，利用SPSS 23.0進行誤差及顯著性分析（其中P＜0.05為有統計學意義），用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 肌原纖維蛋白凝膠特性分析

2.1.1 凝膠白度

由圖1可知，與空白對照組相比，氧化后凝膠白度變化不顯著（P＞0.05），說明5 mmol/L H2O2氧化下，蛋白凝膠白度未受到明顯的影響。但是加入姜黃素后，凝膠白度顯著性降低（P＜0.05），且隨著姜黃素濃度的增加，凝膠白度降低，5、10、15、20 μmol/L姜黃素處理后，肌原纖維蛋白凝膠白度與氧化對照組相比，分別下降了2.15、6.59、10.01和11.15，可能與姜黃素與肌原纖維蛋白相互作用有關，姜黃素的加入會導致凝膠保水能力的增加，即凝膠三維網絡結構內的結合水較多，相對而言肌原纖維蛋白表面的自由水含量降低，導致光折射能力下降進而L*值降低，最后導致凝膠白度的降低[18]，其次可能是因為姜黃素是一種自帶黃色程度較深的天然植物多酚類物質，雖然添加的量不多但也會影響凝膠的紅綠度（a*）和黃藍度（b*）值，進而影響其凝膠白度。

圖1 不同處理對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Fig.1 Effects of different treatments on the whiteness of MP gels

研究發現一些植物多酚的加入會產生蛋白凝膠白度下降的現象，如韓馨蕊等[13]認為安石榴苷（黃色）的添加也會導致凝膠白度的降低，劉丹[18]研究發現染料木素在較高濃度條件下使凝膠白度降低，隨著蘆丁和槲皮素濃度的增加，凝膠白度逐漸降低，這可能就是由于酚類物質本身顏色所影響，而沒食子酸和兒茶素出現低濃度條件下使凝膠白度降低、高濃度條件下使凝膠白度增加的現象，這可能是因為低濃度條件下植物多酚與Fe3+螯合，以及酚類物質氧化形成醌類化合物使得凝膠白度降低，而高濃度條件下，兩種酚類物質使得凝膠三維網絡結構崩塌，破壞了蛋白的結構。同時Wang Yingjie等[19]研究發現酚類化合物紫檀芪（白色粉末）也會降低肌原纖維蛋白凝膠的白度，認為是紫檀芪可以顯著提高凝膠特性所致。

2.1.2 蒸煮損失與保水性

蒸煮損失與保水性是評價凝膠品質極為重要的因素之一，可反映凝膠內部結構截留水分能力的大小[20]，如圖2和圖3所示，與空白對照組相比，氧化后凝膠蒸煮損失顯著性增加（P＜0.05），增加了58.18%，凝膠保水性顯著性降低（P＜0.05），降低了15.35%，這與前人的研究結果一致，Cao Yungang[21]和Wang Zhaoming[22]等均發現氧化后凝膠蒸煮損失增加和保水性下降的現象。而姜黃素的添加正好可以減少蒸煮損失的增大與保水性的降低，且隨著姜黃素濃度的增加，對凝膠蒸煮損失的降低和保水性的提高更明顯，當姜黃素濃度為20 μmol/L時，與氧化對照組相比，凝膠蒸煮損失降低了18.61%，凝膠保水性提高了32.31%。該現象可能由以下原因造成：首先，姜黃素是二酮結構的多酚化合物，在一定程度上可以抑制蛋白的氧化，且自身的羥基結構具有良好的親水能力，因而姜黃素的添加可以降低其凝膠的蒸煮損失和提高保水性[23]；其次，姜黃素的添加會引起肌球蛋白的解離，提高體系內離子強度，通過靜電相互作用力增強其凝膠的水合作用，使凝膠網絡結構更加緊密，提高其保水能力，從而降低蒸煮損失，葉浪等[24]研究認為凝膠保水性增強可能是由于肌原纖維蛋白引入磷酸基團，增加了蛋白質分子的電負性，肌動球蛋白解離成肌球蛋白和肌動蛋白的速率增大，疏水基團增多，肌原纖維蛋白凝膠網絡結構空間增大，蛋白質與水分子結合位點增加，使更多水分被保留下來。

圖2 不同處理對肌原纖維蛋白凝膠蒸煮損失的影響Fig.2 Effects of different treatments on the cooking loss of MP gels

圖3 不同處理對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響Fig.3 Effects of different treatments on the water retention capacity of MP gels

2.1.3 凝膠強度

凝膠強度可以反映蛋白凝膠成形能力的大小。由圖4可知，空白對照組的凝膠強度顯著性高于氧化組（P＜0.05），說明5 mmol/L H2O2氧化體系下產生的羥自由基會導致蛋白質原有的結構改變，使得蛋白凝膠成形性降低，這與前人的研究結果一致，程鏡蓉[25]和Feng Xianchao[26]等研究發現羥自由基體系下，蛋白凝膠強度會顯著性下降，而當加入姜黃素之后，肌原纖維蛋白凝膠強度迅速增加，甚至凝膠強度高于空白對照組，5、10、15、20 μmol/L姜黃素處理后，凝膠強度與空白對照組相比分別上升了132.72%、156.41%、170.67%、183.20%，說明姜黃素的加入可以防止羥自由基損壞肌原纖維蛋白凝膠且大大提高肌原纖維蛋白凝膠性能。這可能是因為姜黃素的加入可以提高蛋白質的溶解度，從而使參與蛋白質成膠的大分子物質更多，使得凝膠強度更大；其次姜黃素的加入可以提高凝膠持水性，所以此時凝膠更加飽滿，結構更加穩定致密，故而姜黃素的添加有更強的凝膠強度。Tang Changbo等[27]的研究結果與本研究相反，他們發現迷迭香酸加入后半胱氨酸會與迷迭香酸形成結合物，減少二硫鍵的形成，最終導致凝膠強度的減弱，這可能是由于植物多酚的不同而導致了完全相反的實驗結果。

圖4 不同處理對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響Fig.4 Effects of different treatments on the gel strength of MPs

2.1.4 凝膠質構

不同處理方式對肌原纖維蛋白全質構影響如表1所示。與空白對照組相比，氧化后凝膠的硬度、彈性、凝聚性、膠黏性、咀嚼性和回彈性均出現了顯著性降低的趨勢，其中硬度、彈性、膠黏性和咀嚼性分別降低了28.36%、68.53%、34.77%、37.70%。

表1 不同處理方式對凝膠全質構的影響Table 1 Effects of different treatments on the texture characteristics of MP gels

凝膠硬度是指儀器探頭首次下壓凝膠時，壓力達到的最大值，它是衡量凝膠質構特性的重要指標之一[28]。由表1可知，凝膠的硬度隨著姜黃素濃度的增加整體呈上升趨勢（P＜0.05），其中膠黏性、咀嚼性與硬度的變化趨勢一致，說明姜黃素的添加有利于凝膠的形成。

不同姜黃素添加量對凝膠改善程度也有所不同，當姜黃素濃度為20 μmol/L時，與氧化對照組相比，凝膠硬度、彈性、凝聚性、膠黏性和咀嚼性分別提高了31.08%、8.89%、9.09%、39.88%、55.55%。這可能是因為姜黃素含有2 個鄰甲氧基酚基、2 個烯酮基和1 個酮烯醇的結構，具有較強的親水能力，使得水合作用更強，從而增加了凝膠特性。Sun Lijun等[29]研究了蘋果多酚對魚糜凝膠特性的影響，發現蘋果多酚的羥基結構具有較強的親水能力，可以增加凝膠特性。同時姜黃素的酚羥基結構還可以與蛋白質中的C＝O基團形成氫鍵，增強蛋白質與多酚之間的相互作用[30]。賈娜等[31]研究了在氧化情況下槲皮素對豬肉肌原纖維蛋白凝膠的影響，發現槲皮素會和肌原纖維蛋白結合形成巰基-醌加合產物，增加凝膠強度。

2.2 肌原纖維蛋白凝膠動態流變學特性

肌原纖維蛋白的動態流變學特性可以反映蛋白熱誘導凝膠形成能力的改變[32]。G’也稱為彈性模量，它能夠反映隨著溫度的變化凝膠彈性的變化，G’越大則表示凝膠彈性越好；G”也稱為黏性模量，它是指材料發生形變時，由于黏性形變（不可逆）而損耗的能量大小，用于反映材料黏性的大小，G”越大則表示黏性越大[11]。

如圖5所示，氧化對照組和空白對照組以及樣品組在40～50 ℃熱誘導下凝膠儲能模量均出現了相似的上升趨勢，此時為肌球蛋白溶液中重酶解肌球蛋白（肌球蛋白頭部）的變性開始，肌球蛋白頭部通過二聚作用開始聚集，在二硫鍵和非共價鍵的作用下形成具有彈性的蛋白凝膠網絡結構[33]，而50～60 ℃熱誘導凝膠儲能模量又呈現出下降的現象，此時為酶解肌球蛋白輕鏈的變性溫度，肌球蛋白尾部的解螺旋導致蛋白質的流動性增大，破壞了蛋白質的凝膠網絡結構[34]。當溫度超過60 ℃時，蛋白質因熱變形而展開、折疊、交聯，形成不可逆的凝膠網絡結構，表現為G’的持續上升[35]。

圖5 不同處理方式對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠G’的影響Fig.5 Effects of different treatments on the storage modulus (G’) of heat-induced MP gels

氧化對照組和其他處理組相比，在第一個拐點處（43 ℃左右）之前，蛋白G’均低于其他處理組，這可能是因為在低溫條件下蛋白凝膠結構主要由蛋白質之間的相互作用所影響，而氧化后加速了蛋白質的變性速率，使得蛋白質來不及形成凝膠網絡結構，因而在20～43 ℃氧化對照組的G’更低，加入姜黃素后可以促進蛋白質與蛋白質以及姜黃素與蛋白質之間的相互作用，促進了凝膠網絡結構的形成。而當溫度高于43 ℃后，添加姜黃素的肌原纖維蛋白凝膠的G’高于氧化對照組及空白對照組，同時氧化對照組也高于空白對照組，說明一定的氧化程度有助于蛋白凝膠的形成，可能是因為在一定的氧化條件下會使得蛋白質產生更多的共價鍵，尤其二硫鍵的形成有利于蛋白凝膠化[36]，這一研究結果與程鏡蓉[25]的研究結果相反，可能是因為研究選擇的氧化體系中雙氧水濃度不同。但Cao Yungang等[37]指出，在4 ℃ Fenton氧化體系下氧化12 h后，兩個轉變峰均高于未氧化的空白對照組。于晶超[32]研究了不同雙氧水濃度梯度下形成的氧化體系對蛋白熱誘導凝膠流變特性的影響，發現低濃度條件下有利于蛋白凝膠的形成，而高氧化強度下會破壞凝膠結構，降低凝膠彈性。肌原纖維蛋白熱誘導凝膠G”的變化趨勢與G’一致，當加熱到50 ℃左右時達到第一個最大峰，從50～65 ℃急劇下降，之后隨著溫度的升高G”逐漸上升（圖6）。整個熱誘導加熱過程中，G’始終高于G”，說明蛋白熱誘導形成的凝膠是一個彈性相對較強的蛋白凝膠[14]。

圖6 不同處理方式對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠G”的影響Fig.6 Effects of different treatments on the loss modulus (G”) of heat-induced MP gels

2.3 肌原纖維蛋白凝膠分子間作用力

蛋白凝膠的形成是一個動態的動力學聚集過程，在這個聚集過程，只有吸引力和排斥力處于平衡狀態才能形成保持大量水分在內的高度有序的三維網狀結構的蛋白凝膠[38]。一般認為凝膠網絡結構的形成是由于蛋白質-蛋白質和蛋白質-水相互作用以及相鄰肽鍵之間的相互吸引力和排斥力相互平衡的結果，形成和維持蛋白凝膠結構的力主要有離子鍵、氫鍵、疏水鍵、二硫鍵以及非二硫鍵等作用力[39]。如圖7所示，肌原纖維蛋白氧化后，離子鍵和氫鍵分別下降了20.97%、28.34%，而疏水性作用力、二硫鍵和非二硫鍵則顯著性上升了27.36%、45.25%、59.95%（P＜0.05），這主要是因為氧化后蛋白質表面的凈電荷數會減少，進而減少其表面的離子強度，蛋白質之間的相互斥力減弱，蛋白質的三級網絡結構遭到破壞；其次由于氧化系統中的羥自由基會攻擊肌原纖維蛋白的氨基酸側鏈，降低氫鍵的含量[40]；此外，氧化也會導致肌原纖維蛋白表面疏水性的增強和二硫鍵含量的升高。與氧化對照組進行比較，添加姜黃素都顯著性降低了由于氧化帶來的負面影響，增強了離子鍵、氫鍵的相對含量而降低了表面疏水性、二硫鍵和非二硫鍵相對含量。這些可能都與姜黃素的添加中和了氧化體系中羥自由基以及其他部分的自由基因子，緩解了肌原纖維蛋白的氧化相關，說明姜黃素可以較好地緩解肌原纖維蛋白的氧化，同時有利于穩定蛋白質結構，但是從加入姜黃素后的4 個處理組可以看出，姜黃素添加量對蛋白質離子鍵、氫鍵、表面疏水性的影響較大而對二硫鍵和非二硫鍵的影響較小，這可能是因為前三者的相對含量基數較大。

圖7 不同處理方式對肌原纖維蛋白凝膠分子間作用力的影響Fig.7 Effects of different treatments on intermolecular forces of MP gels

2.4 肌原纖維蛋白凝膠微觀結構

肌原纖維蛋白的有序聚集形成了凝膠網絡結構，通過掃描電子顯微鏡可以直觀地觀察出凝膠的微觀結構，包括凝膠的三維網狀結構，如多孔性、疏松性等，通常情況下凝膠網絡結構的致密性和凝膠的保水性有著密切的關系，可以進一步反映出凝膠的特性[34]。如圖8所示，空白對照組的凝膠結構呈現出連續的蛋白質網絡結構，孔洞較小、結構緊密，而氧化后凝膠結構變得疏松，空隙變大且多，這可能是因為氧化促進了部分蛋白質的交聯聚集，破壞了凝膠的網絡結構[41]。隨著添加姜黃素濃度的增加，肌原纖維蛋白凝膠結構逐漸得到恢復，空隙變小且更加致密，當姜黃素濃度達到15 μmol/L時凝膠結構幾乎與空白組無明顯差別，這可能是因為姜黃素的加入消耗了氧化體系中了羥自由基，減少了蛋白質的氧化，也有可能是因為姜黃素與肌原纖維蛋白發生了某些交聯反應，形成了更加穩定、連續的網絡結構，進而具有較強的凝膠強度[42]。同時也可以得出在該研究濃度范圍內，高濃度姜黃素有利于凝膠網絡結構的形成。

圖8 不同處理對凝膠微觀結構的影響Fig.8 Effects of different treatments on the microstructure of MP gels

2.5 肌原纖維蛋白凝膠電泳

利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）技術對蛋白氧化及添加姜黃素后所引起的蛋白交聯情況進行分析。由圖9可知，肌原纖維蛋白中的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）在非還原條件下氧化12 h后明顯減少，且肌動蛋白（Actin）條帶變淡，同時濃縮膠頂部顏色明顯加深，說明大分子聚集物顯著增多，而在還原條件下，絕大多數的MHC得以恢復，且濃縮膠頂部的大分子聚集物大部分消失，這表明由氧化引起的蛋白質交聯聚集行為主要是由MHC通過二硫鍵形成大分子物質引起[17]。

圖9 非還原（A）和還原（B）條件下肌原纖維蛋白凝膠SDS-PAGE圖Fig.9 SDS-PAGE patterns of MP gels under reducing and nonreducing conditions

在氧化環境中，姜黃素的添加并不能完全阻止蛋白質的聚集，甚至低濃度條件下（5、10 μmol/L姜黃素）與氧化對照組無論是MHC、Actin，還是濃縮膠頂部的聚集情況都相差不大，但是當濃度達到20 μmol/L時，可以清晰看到濃縮膠頂部的聚集物質較少。加入β-巰基乙醇還原后MHC和Actin條帶均得到恢復，表明大部分聚合物都是通過二硫鍵相互作用形成的，同時還原后濃縮膠頂部仍然還有少量的聚集物存在，說明形成的大分子聚集物除了以S—S形式形成外還存在非二硫鍵。通過SDSPAGE可以看出姜黃素對氧化引起的蛋白質凝膠聚集行為具有一定的改善作用。

2.6 各指標間相關性分析

采用相關性熱圖分析肌原纖維蛋白凝膠各指標之間的相關程度見圖10。結果表明，凝膠白度與保水性和凝膠強度呈負相關，蒸煮損失與凝膠質構各指標影響都呈負相關。另外，凝膠分子間疏水鍵、二硫鍵和非二硫鍵與凝膠保水性、凝膠強度和質構都呈負相關，這說明蛋白凝膠形成過程中，分子間作用力對凝膠網絡結構的形成以及凝膠三維網狀結構中水分的保持具有重要作用，可作為評價蛋白凝膠形成過程中的動態力學聚集過程。

圖10 肌原纖維蛋白凝膠各指標間相關性分析Fig.10 Correlation analysis between indicators of MP gels

3 結論

氧化條件下添加姜黃素可使豬肉肌原纖維蛋白凝膠白度顯著降低，促進凝膠強度和保水性的增加以及改善凝膠質構特性，可減緩由氧化而引起的凝膠蒸煮損失的增加；姜黃素的添加可以促進凝膠G’和G”增加；添加姜黃素增加了凝膠蛋白分子間離子鍵和氫鍵的相對含量，而降低了表面疏水性、二硫鍵和非二硫鍵相對含量；氧化后凝膠微觀結構變得疏松、多孔、不結實，而加入姜黃素后凝膠微觀結構得到恢復，高濃度姜黃素（15～20 μmol/L）可使肌原纖維蛋白凝膠微觀結構恢復至未氧化狀態，在一定程度上可以緩解蛋白質由于氧化導致的聚集情況；姜黃素對肌原纖維蛋白凝膠的調控表現為濃度效應，在一定濃度范圍內，隨著姜黃素濃度的增加，對肌原纖維蛋白凝膠的形成有一定的促進作用，濃度越高更有利于提高肌原纖維蛋白凝膠特性。適量的姜黃素可控制肉品中蛋白質的氧化、提高蛋白凝膠特性，從而增強肉制品的質構特性。