金針菇多糖通過調節髓系細胞生成緩解苯并[a]芘染毒小鼠血管炎癥

牛澤淼，李 鑫，陳 寧，梁振華，趙 娟，呂 品，張 巖，付程浩,*

（1.河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學藥學院，河北 石家莊 050017；3.河北醫科大學教學實驗中心，河北 石家莊 050017；4.河北省食品檢驗研究院 河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050227）

食用菌多糖是大型可食用真菌的主要活性物質之一，有明確報道的食用菌多糖種類已超過百種，例如香菇多糖、靈芝多糖、秀珍菇多糖、金針菇多糖等[1-2]。研究表明，金針菇多糖（Flammulina velutipespolysaccharide，FVP）具有抗腫瘤、免疫調節、抗炎、抗氧化、抗衰老和改善腸道菌群等多種潛在的生物活性功能[1,3-4]。Ma Sheng等[5]的研究顯示，FVP可以增強小鼠抗氧化能力，減少血清中炎癥因子白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，緩解腸炎表型，并指出這一過程可能是通過抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3-與凋亡相關的斑點樣蛋白-Caspase-1軸的信號轉導實現的。有研究發現，FVP可以通過調節特定的腸道微生物來改善小鼠潰瘍性結腸炎的癥狀，還可調節小鼠腸道菌群的組成增強免疫反應[6-8]。此外，FVP可調節Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4-核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路改善炎癥、氧化應激和細胞凋亡，減輕葡聚糖硫酸鈉鹽引起的炎癥性腸病和肝損傷[9-10]。

食品在熏制、烘烤和煎炸過程中會產生大量的多環芳烴類致癌物，苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）是多環芳烴的典型代表，分子式為C20H12[11]。此外，BaP還存在于汽車尾氣、香煙煙霧、煤焦油中，主要經由食物攝入、呼吸、皮膚暴露進入人體[12]。早在1930年，BaP就因其致癌活性而廣為人知[13]。近年來，BaP引發的心血管損傷引起了人們的關注。研究表明，血管壁的內皮細胞和平滑肌細胞是BaP的重要靶細胞[14]，BaP進入細胞后，能夠與芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）結合，在AhR核轉位器的協助下一起控制異物代謝酶的表達，如細胞色素（cytochrome，CYP）家族基因CYP1A1和CYP1B1[15]。同時，胞內的BaP在CYP1A1介導的生物轉化過程中生成二羥環氧苯并芘（benzo[a]pyrene dihydrodiol epoxide，BPDE）進而形成BPDE-DNA加合物，誘導細胞基因突變[16]。此外，BaP還可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路、NF-κB信號通路、有絲分裂原激活蛋白激酶信號通路、氨基末端激酶信號通路上調血管細胞黏附分子-1、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等炎癥因子的表達，引發血管炎癥損傷[12,17-18]。

炎癥因子對促炎細胞的調控和募集是血管炎癥損傷的核心事件，其中造血祖細胞的增殖和分化直接影響著炎癥細胞生成[19-21]。研究顯示，TNF-α和巨噬細胞集落刺激因子共同調控造血c-Kit+Sca-1+祖細胞的分化和粒細胞的生成，增加外周循環中性粒細胞的水平，加重心血管疾病的風險[21]。最近有證據顯示，橙皮素能夠下調BaP引發的人臍靜脈內皮細胞系（EAhy 926）中AhR活化，減少IL-1β和TNF-α分子產生，延緩低密度脂蛋白積累，從而緩解動脈粥樣硬化的發展[22]。Gdula-Argasińska等[23]指出消退素D1處理會下調CYP1A1基因表達和蛋白活性，抑制環氧合酶2和前列腺素E合成酶蛋白生成，具有修復人臍靜脈內皮細胞損傷的潛力。

目前，尚不清楚FVP是否具有調節BaP引發的血管炎癥損傷的潛能。因此，本研究在動物水平檢測了FVP灌胃前后BaP處理組小鼠血管炎癥分子的表達水平，以及體內造血祖細胞和循環促炎細胞的水平，并在細胞水平進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 周齡SPF級雄性C57/BL6小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司，生產許可證號SYXK（遼）2018-0003；Raw264.7細胞 中國武漢普諾賽生命科技有限公司。

BaP（純度＞96%）美國Sigma公司；2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）探針 美國Cayman Chemical公司；IL-6、細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、MCP-1單克隆抗體 沈陽萬類生物科技有限公司；c-Kit、Sca-1、Ly6G、Ly6C、CD11b、CD45、F4/80、CD16/32單克隆抗體 美國Biolegend公司；微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒 南京建成公司；胎牛血清 德國Biotech公司；胰酶、DMEM培養基 美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8試劑盒 上海圣爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TDL-50B低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；Avanti J-30I高速離心機 美國Beckman Coulter公司；Guava easyCyte系列微毛細管細胞分析儀、Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司；DEL-100酶聯免疫分析儀杭州米歐儀器有限公司；BD FACSVerse流式細胞儀美國BD公司；DM2000 LED微細胞顯微鏡 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 FVP提取

參考已發表的文獻[4,24]從金針菇子實體中提取FVP。取干燥的金針菇粉，經石油醚常溫浸提3 次，陰干溶劑；加入2 倍體積70%乙醇溶液常溫浸提24 h，重復3 次，陰干溶劑；金針菇粉按照料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，90 ℃提取3 h，重復提取3 次，合并濾液后進行減壓濃縮，加入95%乙醇溶液調整終體積分數為75%，靜置醇沉24 h后過濾收集多糖沉淀。沉淀分別用無水乙醇、丙酮、石油醚淋洗2 次，陰干溶劑后復溶于蒸餾水，得粗多糖溶液。使用Sevag試劑法（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V/V）除蛋白，重復除蛋白10 次[4,24]。溶液旋蒸除去氯仿，進行二次醇沉，加入95%乙醇至終體積分數75%，靜置24 h，收集沉淀溶于蒸餾水后使用透析袋（8 000～14 000 Da）于4 ℃透析4 d，每隔5 h換一次蒸餾水，冷凍干燥后得FVP。

1.3.2 動物飼養與處理

40 只體質量為18～20 g的雄性C57/BL6小鼠適應性飼養一周后，隨機分為5 組，每組8 只。分別為對照組，BaP（200 mg/（kgmb·d））處理組，FVP灌胃低劑量組（50 mg/（kgmb·d））、中劑量組（100 mg/（kgmb·d））及高劑量組（200 mg/（kgmb·d））（分別記為FVP 50+BaP組、FVP 100+BaP組、FVP 200+BaP組，FVP后面的數據表示FVP灌胃的劑量，下同）。FVP劑量按小鼠體質量計算，溶于120 μL三蒸水后灌胃FVP組小鼠，同時對照組和BaP組給予同等體積的三蒸水，連續飼養12 d；第12天，FVP組預先BaP灌胃12 h后再進行FVP灌胃，BaP組灌胃200 mg/kg的BaP，對照組灌胃等體積三蒸水，持續3 d。

1.3.3 病理切片、染色及炎癥因子表達水平的測定

使用4%多聚甲醛固定小鼠胸腹主動脈30 min，隨后使用OTC包埋劑包埋動脈組織，-80 ℃冷凍2 h后通過冰凍切片機制成5 μm的切片；預冷丙酮固定切片，使用蘇木精染色，鹽酸乙醇分化液分化，促藍液反藍，伊紅染色，每染色一次使用流水清洗一次，通過分級乙醇脫水，并在二甲苯中清洗，最后樹膠封片，在顯微鏡下觀察。使用切片進行免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色前置于室溫1 h修復抗原，預冷丙酮固定30 min，使用內源性過氧化物酶阻斷，山羊血清封閉，一抗（IL-6、MCP-1和ICAM-1）4 ℃孵育過夜，生物素標記山羊抗小鼠IgG抗體，辣根酶標記鏈霉素卵白素，DAB顯色液顯色，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化液分化，通過分級乙醇脫水，并在二甲苯中清洗，最后樹膠封片，在顯微鏡下觀察。使用Image Pro Plus軟件統計抗體染色區并計算平均光密度值（mean fluorescence intensity，MFI），并計算各組抗體的相對表達量。

1.3.4 流式細胞術檢測促炎細胞及骨髓造血細胞亞群比例變化

按文獻[25-26]方法收集脾臟、骨髓和血液中的免疫細胞，調整細胞濃度為106cell/100 μL。孵育抗體，使用BD FACSVerse流式細胞儀上機檢測，數據通過FlowJo V10軟件進行分析。通過CD11b+Ly6ChighLy6G-識別單核細胞，C D 11 b+F 4/8 0+識別巨噬細胞，CD11b+Ly6ClowLy6G+識別中性粒細胞，c-Kit+Sca-1+識別造血祖細胞，c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32high識別粒細胞巨噬細胞祖細胞（granulocyte macrophage progenitor，GMP），c-Kit+Sca-1-識別造血干細胞，c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32mid識別普通髓系祖細胞（common myeloid progenitor，CMP）。

1.3.5 細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平測定

將Raw264.7細胞密度調整為2×104個/mL，在6 孔板中按照每孔2 mL接種細胞懸液。置于含5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h，使細胞貼壁生長。吸去上清液，分別加入含不同質量濃度（0、30、60、125、250 μg/mL）FVP的DMEM培養基2 mL，繼續在培養箱中培養2 h后，除對照孔其余5 孔使用1 μg/mL BaP處理繼續培養2 h或10 h，然后每孔加入1 μL DCFH-DA熒光染色劑，孵育30 min使用Guava easyCyte系列微毛細管細胞分析儀上機測定異硫氰酸酯（fluoresceine isothiocyanate，FITC）熒光強度。通過FlowJo V10軟件計算出每組的MFI。

1.3.6 MDA含量檢測

根據MDA測試盒說明書使用各組（對照組、BaP組、FVP 30+BaP組、FVP 60+BaP組、FVP 125+BaP組、FVP 250+BaP組）100 μL細胞上清液與其余試劑按比例混勻，并設立空白管。將各組試管渦旋混勻，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻，按每孔100 μL將各組混合液加入96 孔板，使用酶標儀測定各組532 nm波長處吸光度。按照說明書公式計算MDA濃度。

1.3.7 SOD活力檢測

根據SOD測試盒說明書使用各組（對照組、BaP組、FVP 30+BaP組、FVP 60+BaP組、FVP 125+BaP組、FVP 250+BaP組）20 μL細胞勻漿上清液與其余試劑按比例混勻加入96 孔板，并設立空白孔。將各孔混勻，37 ℃烘箱孵育20 min，450 nm波長處酶標儀讀數，測定各組吸光度。按照說明書公式計算SOD活力。

1.4 數據統計分析

所有細胞實驗至少重復3 次，動物實驗中每種處理至少7 只動物。所有數據結果均采用表示，采用GraphPad Prism 8和Microsoft Excel 2021軟件進行數據統計分析，并采用ordinary One-way ANOVA檢驗法進行顯著性分析，P＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 FVP灌胃對BaP誘發的血管炎癥因子表達水平的影響

研究結果顯示，與對照組小鼠相比，BaP染毒小鼠的血管組織IL-6、MCP-1和ICAM-1分子的相對表達水平至少增加1 倍（圖1）。使用50、100、200 mg/kg的FVP預先灌胃之后BaP染毒小鼠的血管組織表達IL-6、MCP-1和ICAM-1分子的表達水平顯著降低，且具有劑量依賴性（圖1）。上述結果提示，FVP灌胃能夠顯著下調BaP染毒小鼠血管組織炎癥分子的表達。

圖1 FVP灌胃對BaP誘發的血管炎癥因子表達水平的影響Fig.1 Effect of FVP gavage on the expression of vascular inflammatory cytokinesin BaP-induced mice

2.2 FVP灌胃對BaP誘發的外周促炎細胞積累的影響

研究結果顯示，與對照組相比，BaP染毒小鼠外周血中單核細胞（CD11b+Ly6ChighLy6G-）、巨噬細胞（CD11b+F4/80+）和中性粒細胞（CD11b+Ly6ClowLy6G+）比例以及脾臟中巨噬細胞和中性粒細胞比例顯著增加（圖2）。與炎癥分子表達下降相一致的是，50、100 mg/kg FVP灌胃后外周血中單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞以及脾臟中巨噬細胞和中性粒細胞比例大幅下降。同時200 mg/kg FVP灌胃后脾臟中中性粒細胞和巨噬細胞比例也大幅下降。然而，200 mg/kg FVP灌胃后外周血中3 種促炎細胞比例和脾臟中單核細胞比例與BaP染毒組無顯著差異。此外，上述3 種類型促炎細胞比例上調與FVP灌胃劑量增加正相關。上述結果提示，較低劑量的FVP灌胃能夠顯著下調BaP染毒小鼠外周血和脾臟中3 種促炎細胞比例。

圖2 FVP灌胃對BaP誘發的外周促炎細胞積累的影響Fig.2 Effect of FVP gavage on BaP-induced accumulation of proinflammatory cells

2.3 FVP灌胃對BaP誘發的骨髓造血作用紊亂的影響

研究結果顯示，與對照組相比，BaP染毒小鼠骨髓中造血祖細胞（c-Kit+Sca-1+）的比例增加了近2 倍，同時GMP（c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32high）的比例增加近1.5 倍；與之相反的是，BaP染毒小鼠骨髓中造血干細胞（c-Kit+Sca-1-）和CMP（c-Kit+Sca-1-CD34+CD16/32mid）的比例下降，其中MCP下降超過一半。而FVP灌胃逆轉了這一現象，造血祖細胞比例下降至與對照組接近，且50 mg/kg FVP灌胃后GMP和造血干細胞的比例基本恢復至正常水平，200 mg/kg FVP灌胃后MCP比例相較BaP染毒小鼠明顯增加，接近正常小鼠骨髓細胞構成的比例（圖3）。以上結果提示FVP灌胃使骨髓造血細胞的構成回歸至健康對照組水平，顯著改善了BaP誘發的骨髓造血系統紊亂。

圖3 FVP灌胃對BaP誘發骨髓造血作用紊亂的影響Fig.3 Effect of FVP gavage on BaP-induced hemopoietic disorder in bone marrow

2.4 FVP預處理對BaP誘發Raw264.7細胞氧化應激的影響

研究結果顯示，1 μg/mL BaP處理2 h不可誘發Raw264.7細胞產生明顯的氧化應激，BaP處理時間延長至10 h可誘發Raw264.7細胞產生明顯的氧化應激，BaP組DCFH-DA的MFI較對照組增加近百倍，125 μg/mL和250 μg/mL FVP預處理組DCFH-DA的M F I 較BaP 組顯著下降（圖4 A）。同時M D A 檢測結果表明，BaP處理10 h后細胞上清液中MDA含量增加2 倍以上，FVP預處理組細胞上清液中MDA含量較BaP組顯著降低，其中60 μg/mL FVP預處理組下降最明顯，接近正常對照水平，其余FVP預處理組較BaP組下降約16%（圖4B）。SOD檢測結果表明，對照組細胞勻漿上清液中SOD活力為23 U/mL左右，而BaP處理10 h后細胞勻漿上清液中SOD活力下降至約19 U/mL，FVP預處理組細胞勻漿上清液中SOD活力較BaP組顯著改善，其中60 μg/mL FVP預處理組改善最明顯，接近正常對照水平，其余FVP預處理組細胞勻漿上清液中SOD活力恢復至約21 U/mL（圖4C）。結果提示，FVP預處理能夠顯著抑制BaP引發Raw264.7細胞的氧化應激水平。

圖4 FVP預處理對BaP誘發Raw264.7細胞氧化應激水平的影響Fig.4 Effect of FVP pretreatment on oxidative stress in Raw264.7 cells induced by BaP

3 討論

BaP是一類備受世界各國關注的食源性污染物，主要在食品熏、炸、燒、烤等加工過程中產生，通過飲食、飲水、皮膚暴露等方式被人體攝入[16]。研究顯示，主動脈是BaP的靶器官之一。BaP可通過誘導細胞氧化應激、凋亡、細胞周期紊亂、自噬、炎癥損傷等細胞損傷事件增加心血管疾病的風險[27-28]。研究表明，FVP具有免疫調節、抗炎和改善腸道菌群等多種潛在的生物活性[2]。例如，Ma Sheng等[5]的研究顯示，FVP可以增強小鼠抗氧化能力，減少血清中炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的含量，緩解腸炎表型。為明確FVP處理后BaP染毒小鼠血管炎癥損傷的變化情況，本研究通過免疫組化技術分析了經不同劑量FVP灌胃后BaP染毒小鼠模型胸主動脈血管組織炎癥損傷相關分子（IL-6、MCP-1和ICAM-1）的表達水平（圖1）。結果顯示，FVP灌胃可顯著改善BaP染毒小鼠血管組織炎癥相關因子表達及外周炎癥細胞的積累，且具有劑量依賴性。血管炎癥損傷過程中，促炎細胞的募集是損傷程度的重要過程，表現為外周促炎細胞的增多[19-21]。本研究使用多色流式細胞術檢測了FVP灌胃后的BaP染毒小鼠單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的比例變化，進一步分析FVP對促炎細胞募集的影響。結果顯示，FVP灌胃顯著改善了BaP染毒小鼠外周血中單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞比例以及脾臟中巨噬細胞和中性粒細胞比例（圖2）。這些結果共同提示，FVP能夠改善BaP誘導的血管炎癥損傷，并且這一功效可能是通過其免疫調節活性達成。

然而，多項研究表明FVP能夠通過激活TLR2-NF-κB抑制激酶α軸促進B細胞或Raw264.7細胞激活，發揮免疫激活、抗腫瘤等功能[29]。本實驗機制探究結果發現，FVP不能顯著抑制BaP染毒Raw264.7細胞模型IL-6、TNF-α等促炎基因的表達（結果未展示），這提示FVP可能通過其他途徑抑制促炎細胞的募集和血管炎癥反應。炎癥細胞因子主要來源于成熟血細胞，也是炎癥損傷的關鍵下游效應因子[30-31]。成熟血細胞由骨髓中的造血干細胞發育而來[32]，因此造血系統的變化顯著影響機體的炎癥損傷。本研究結果表明BaP染毒小鼠血管炎癥發生的同時，伴隨著骨髓中造血祖細胞和粒細胞巨噬細胞祖細胞比例的增加，以及造血干細胞和普通髓系祖細胞比例的降低，提示造血系統紊亂。而FVP灌胃顯著改善了造血系統紊亂，使造血祖細胞的構成回歸至健康對照組水平（圖3），這提示FVP可能通過逆轉造血系統紊亂，延緩血管炎癥損傷的發生發展。

此外，在炎癥發展過程中，減少ROS的生成是減輕炎性損傷的一種潛在策略[33]。ROS生成是氧化應激的主要特征，低濃度的ROS有助于細胞生理活動的調節，而過量的ROS可通過氧化脂質分子、激活炎性信號通路等機制介導血管重塑性疾病的發生發展[34-35]。本研究結果顯示，FVP預處理可以顯著抑制BaP染毒Raw264.7細胞模型中ROS和MDA的產生，增強細胞SOD的活力（圖4）。這與之前的研究一致，Wu Ming等[36]發現FVP在體外具有對羥自由基、超氧化物自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除作用和還原力；Hu Yuning等[37]的結果顯示與白色金針菇菌株相比，黃色菌株中經80%乙醇沉淀的多糖組分具有最強的抗氧化活性，表明不同品種或FVP的不同組分具有多樣性的生物活性。上述結果提示具有復雜結構的天然活性成分可能通過多靶點、多通路最終使細胞改變應激或病理狀態，回歸穩態。

4 結論

本研究探討了FVP處理對BaP染毒小鼠胸腹主動脈炎癥標志物表達、外周血和脾臟中促炎細胞比例變化及骨髓造血細胞亞群構成變化的影響，并在細胞層面檢查了FVP處理對BaP共培養后Raw264.7細胞的炎癥損傷。結果表明，FVP處理能顯著抑制BaP誘導的小鼠主動脈炎癥介質（IL-6、MCP-1、ICAM-1）的表達，緩解外周免疫器官中的促炎細胞（巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞）的積累。同時，FVP處理顯著改善了BaP引起的骨髓中造血祖細胞亞群構成的紊亂狀態。以上研究結果提示，FVP能夠通過維持造血系統穩態，緩解BaP對機體的炎癥損傷，細胞層面上，FVP處理后可抑制BaP誘導Raw264.7細胞的氧化應激水平。綜上所述，FVP可能具有良好的抗炎和心血管保護作用，這為開發相關的功能食品或藥品提供了參考。