山茶油干預的阿爾茨海默病小鼠尿液代謝組學分析

王瑞鋒，周 寧，陳 龍，劉 通，郭彭莉，張冰賢，張振凱，曾夢楠，熊維政，鄭曉珂,3，馮衛生,3,*

（1.河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；2.河南綠達山茶油股份有限公司，河南 信陽 465550；3.河南省中藥開發工程技術研究中心，河南 鄭州 450046）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種進行性發展的神經退行性疾病，起病隱匿，多發于老年前期和老年中期，臨床上主要表現為認知功能障礙、行為改變和心理癥狀[1]。到2050年，預計將會有1.52億 人受到癡呆癥的影響，嚴重干擾了人們的日常生活，帶來了巨大的公共健康隱患[2]。AD的病理學特征主要為β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）細胞外沉積形成淀粉樣斑塊以及淀粉樣斑塊誘導的下游Tau蛋白過度磷酸化導致神經纖維纏結[3]。此外，Aβ沉積還會導致免疫系統激活引起促炎癥細胞因子分泌，趨化因子、活性氧、興奮性氨基酸等神經毒素增多，導致神經元損傷和神經退行性病變。AD的具體發病機制仍不清楚，目前被批準用于治療AD的藥物僅能控制癥狀，而不能改變疾病進程，且具有頭暈、頭痛、便秘、高血壓等副作用[4]。研究表明，與癡呆相關的病理變化在臨床癥狀出現之前很長一段時間就已經開始發生，因此尋找新的藥物，在神經退行性過程發生之前進行預防和干預，將成為未來研究的重點[5]。

山茶油是從山茶科（Theaceae）油茶（Camellia oleiferaAbel.）樹種子壓榨獲得，是藥用價值較高的食品保健油，在中國有很長的生產和發展歷史。先秦古書《山海經》中記載“員木，南方油食也”；《本草綱目拾遺》中記載“茶油可潤腸、清胃、解毒、殺菌”；研究表明，山茶油含有豐富的不飽和脂肪酸、酚類、黃酮類、兒茶素、角鯊烯等活性成分，有“東方橄欖油”和“長壽油”之稱[6]。山茶油中所含的油酸等不飽和脂肪酸可以減少AD小鼠腦組織中Aβ產生，抑制Aβ異常積累引起的淀粉樣斑塊沉積[7]；多酚和黃酮類化合物可以增強學習、記憶和神經認知功能，起到改善AD癥狀的作用[8]。課題組前期研究也發現[9]，山茶油可作為營養食品調節脂質代謝，影響微生物-腸道-大腦軸，促進腸道菌群相互作用，調節Aβ25-35小鼠腸道菌群失衡，減輕小鼠大腦中的神經元損傷，減少淀粉樣蛋白和Tau蛋白的數量，增強小鼠記憶和認知能力。

代謝組學是系統生物學的重要組成部分，可通過研究生物體在受到外界干預后，細胞、組織、器官中低分子質量內源性代謝物的差異變化，富集和構建代謝通路，從而探討外界干預與內在代謝物變化的聯系[10]。AD發病機制復雜，系統性的分析方法更適合于全面整體地評價山茶油對AD患者的干預作用。已有研究表明，在AD患者尿液中檢測出一些生物標志物如氧化損傷相關代謝物、單胺類代謝物等可能與AD早期病理變化相關。且尿液代謝物檢測作為一種簡單、無創的研究手段，方便被用于AD早期疾病診斷[11-12]。因此，本研究基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS）技術，對山茶油干預后的AD小鼠進行尿液代謝組學分析，鑒定山茶油治療后小鼠體內代謝物變化情況，并基于差異標志物構建相關的代謝網絡圖，進而探討山茶油對AD的營養保健作用和治療潛力，以期為日常食用山茶油干預AD發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明小鼠（KM；49 d）購自北京維塔星生物科技有限公司，共50 只。實驗環境保證恒溫（（25±2）℃）、相對濕度（60±10）%，光照、黑暗循環12 h，實驗期間小鼠可自由獲得食物和水。所有程序均按照《河南中醫藥大學實驗動物護理與使用指南》進行，所有實驗均經河南中醫藥大學動物倫理委員會批準，批準代碼為DWLL2018080003，于2018年8月15日授予，有效期5 a。

山茶油購自河南綠達山茶油股份有限公司。

鹽酸多奈哌齊片 中國重慶植恩藥業有限公司；Aβ25-35肽 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為LC/MS級）美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

maXis HD Q/TOF四極桿飛行時間質譜儀 德國Bruker公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國Dionex公司；Advantage A10超純水儀 德國Sartorius公司；5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；SK-1快速混勻器 常州國宇儀器制造有限公司；BCD 206TAS低溫冰箱 青島海爾公司；SB-5200DTD超聲波清洗機寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模與給藥

將50 只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、陽性藥組（10 mg/（kgmb·d））、山茶油組（0.5 mL/（kgmb·d））。Aβ25-35肽在37 ℃蒸餾水（1 mg/mL）中孵育7 d，在實驗前立即用無菌生理鹽水稀釋至最終質量濃度。除正常對照組外，其余各組小鼠海馬內注射Aβ25-35，對照組小鼠海馬內注射等量生理鹽水。陽性藥組和山茶油組的小鼠注射干預后第15天，分別開始給予鹽酸多奈哌齊片和山茶油灌胃，連續給藥28 d，正常對照組和模型組均給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.2 尿液樣本的采集與處理

最后一次給藥后，將小鼠置于代謝籠中，收集各組小鼠12 h尿液，置于-80 ℃保存。待UPLC-Q/TOFMS分析，將尿樣在室溫下解凍，3 800 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液300 μL與3 倍體積乙腈混合加入離心管中，沉淀蛋白質。渦旋1 min后，在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL置于進樣小瓶中，放于4 ℃冰箱中備用。質量控制（quality control，QC）樣本為分別從各樣本中吸取30 μL混合而成[13]。實驗序列中每間隔10 個樣本運行一次QC樣本，用于評估UPLC-MS系統的穩定性。

1.3.3 UPLC-Q/TOF-MS檢測條件

采用AcclaimTMRSLC 120 C18色譜柱（2.2 μm，2.1 mm×100 mm）進行色譜分離。流動相為溶劑A（甲酸水溶液，0.1%）和溶劑C（乙腈），梯度洗脫（0～5 min，95%～85% A，5%～15% C；5～8 min，85%～60% A，15%～40% C；8～18 min，60%～30% A，40%～70% C；18～20 min，30%～10% A，70%～90% C；2 0～2 5 min，10%～9 5% A，90%～5% C）。柱溫箱設置為40 ℃，流速為0.3 mL/min。質譜分析采用四極桿飛行時間質譜，在正、負離子模式下進行掃描。掃描范圍：m/z50～1 500，掃描速率：1.0 Hz，霧化器氣體壓力：2.0 bar，干燥氣（N2）流量：8 L/min，去溶劑化溫度：230 ℃，毛細管電壓：3 500 V和3 200 V（正、負離子模式）。實時校正液（甲酸鈉）流速：52 μL/h。

1.4 數據處理與統計分析

將UPLC-Q/TOF-MS 采集到的原始數據導入Profile Analysis軟件中進行峰匹配、降噪、歸一化、修正缺失數據等預處理后，得到Bucket表格。將表格數據導入SIMCA-P14.1軟件中進行無監督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA），得出相應的得分圖。通過得分圖比較模型組和給藥組之間的差異，篩選差異代謝物（變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）＞3、P＜0.05）。利用HMDB（https://hmdb.ca）、MassBank（https://massbank.eu）、MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca）在線數據庫鑒定、篩選潛在生物標志物。通過Compass Quant Analysis軟件（4.8.0版本）對潛在的生物標志物進行半定量分析，Mev軟件（4.9.0版本）進行熱圖聚類分析。最后，使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）對潛在生物標志物進行代謝通路富集并構建代謝通路網絡。

2 結果與分析

2.1 AD小鼠尿液代謝物譜圖分析

將小鼠尿液樣本進行UPLC-Q/TOF-MS分析后，得到在樣品正、負離子模式下的基峰離子流色譜圖，如圖1所示，分離度良好。其中，正離子模式下檢測到199 個化合物，負離子模式下檢測到181 個化合物（正離子模式下33 個獲得命名，負離子模式下15 個獲得命名）。

圖1 小鼠尿液樣品正（A）、負（B）離子模式下的基峰強度色譜圖Fig.1 Base peak intensity chromatograms of mouse urine samples in the positive (A) and negative (B) modes

2.2 AD小鼠尿液樣本PCA

將UPLC-Q/TOF-MS獲得的小鼠各組數據進行預處理和PCA，得到PCA得分圖。如圖2A、B所示，正常對照組、模型組小鼠尿液樣本點各自聚為一類，彼此顯著分離，說明小鼠在注射Aβ25-35肽后體內代謝輪廓顯著變化；如圖2C、D所示，與模型組相比，陽性藥組樣本點明顯接近正常對照組樣本點，說明AD模型建立成功。如圖2E、F所示，在給予山茶油后，小鼠尿液樣本點更接近正常對照組樣本點區域，說明山茶油對AD小鼠體內代謝紊亂有明顯的回調作用。

圖2 小鼠尿液樣本PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of mouse urine samples

2.3 AD小鼠尿樣本潛在生物標志物鑒定

對模型組和給藥組進行OPLS-DA，結果顯示模型組和山茶油組樣本點顯著分離。得到相應的OPLS-DA得分圖、置換檢驗結果圖以及S-plot載荷圖（圖3），置換檢驗結果中橫坐標表示與模型的相似度，縱坐標表示和越接近于1，表明模型擬合程度越高，區分能力越好。該模型，說明模型區分能力較好，模型組和山茶油組之間的組間差異信息較多。較接近于1，表明模型具有良好的預測能力。小于0，說明模型沒有出現過擬合。在S-plot載荷圖中標記為紅色且明顯遠離原點的點，代表潛在代謝物，基于設定的參數VIP＞3、P＜0.05，使用HMBD、MassBank和KEGG數據庫，結合標志物的保留時間、質荷比、二級碎片等鑒定得到內源性生物標志物，模型組與給藥組得到48 個生物標志物（正離子模式下33 個，負離子模式下15 個），如表1所示。

表1 模型組和山茶油組潛在生物標志物及其相關信息Table 1 Information of potential biomarkers from the model and camellia oil groups

圖3 模型組和山茶油給藥組樣本的OPLS-DA得分圖、置換檢驗圖和S-plot載荷圖Fig.3 OPLS-DA score plots,permutation test plots and S-plot loading plots for the model and camellia oil groups

2.4 AD小鼠尿液樣本潛在生物標志物聚類分析

對篩選得出的生物標志物進行相對定量和熱圖聚類分析，如圖4所示，與模型組相比，山茶油組中多數標志物表現出一定程度上的回調，說明山茶油對AD小鼠體內代謝紊亂有一定的回調作用。聚類結果顯示，正常對照組和給藥組聚為一類，再次驗證PCA的結果，即山茶油對AD大鼠體內代謝的紊亂具有改善作用。

圖4 潛在生物標志物在模型組和山茶油組樣本中的熱圖Fig.4 Heatmap of potential biomarkers in the model and camellia oil groups

2.5 AD小鼠尿液樣本代謝通路富集分析與代謝網絡構建

對表1中的所有生物標志物進行KEGG代謝通路富集分析，得到了5 條顯著受干擾的代謝途徑：牛磺酸和次牛磺酸代謝，三羧酸循環，精氨酸和脯氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。構建了與山茶油干預作用相關的代謝通路網絡圖，如圖5所示。

圖5 AD小鼠體內的代謝網絡圖Fig.5 Metabolic network in AD mice

3 討論

山茶油是一種通過壓榨提取的中國傳統食用油，含有豐富的不飽和脂肪酸，已被證實對AD患者神經系統有良好的保護作用[14]。本研究基于代謝組學技術，對山茶油干預后的AD小鼠尿液樣本進行分析，綜合結果發現山茶油主要是通過干預牛磺酸和次牛磺酸代謝，三羧酸循環，精氨酸和脯氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等代謝通路，改善AD小鼠體內代謝的紊亂狀態。谷氨酸是哺乳動物神經系統中重要的興奮性神經遞質，AD患者皮層神經元外存在過量的谷氨酸會引起興奮毒性，導致神經元死亡[15]。牛磺酸是中樞神經系統中廣泛分布的內源性氨基酸，被認為是大腦發育的重要營養因子[16]。牛磺酸可通過激活γ-氨基丁酸和甘氨酸受體，抑制Aβ誘導的谷氨酸水平升高所引起的興奮性毒性[17]。在本研究中，與正常對照組相比，牛磺酸在模型組下調，給予山茶油干預后，小鼠尿液中牛磺酸及其代謝物含量顯著升高，說明山茶油可通過調節牛磺酸和次牛磺酸代謝，降低興奮性毒性，從而緩解Aβ引起的神經損傷，改善AD癥狀。

檸檬酸是線粒體三羧酸循環中的重要中間產物。線粒體功能障礙和腦葡萄糖代謝減退被認為是引發AD的重要影響因素之一，淀粉樣前體蛋白及其裂解產物的異常積累會抑制各種線粒體酶活性，破壞線粒體電子傳遞鏈功能，影響能量供應，導致神經元細胞運轉異常[18-19]。本實驗中，與正常對照組相比，AD小鼠體內檸檬酸含量減少，提示AD小鼠體內三羧酸循環過程紊亂，體內能量代謝受到抑制。本實驗中，給予山茶油后，檸檬酸含量明顯增加，說明山茶油可通過調節三羧酸循環調節機體能量代謝，減輕神經元細胞損傷。

肌酸和肌酸酐是精氨酸和脯氨酸代謝通路中的重要化合物。肌酸是肌酸酐的唯一前體，肌酸轉化為肌酸酐是一個不可逆的過程，在人體內，肌酸酐一般不被代謝而直接由尿液排出體外[20]。肌酸與中樞神經系統的能量供應有關，二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）通過接受磷酸肌酸的磷酸基團合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），維持大腦在快速周轉時ATP的穩態以及較低的ADP濃度，進而提高認知功能[21]。肌酸還具有抗氧化作用，線粒體是氧化應激誘導損傷的主要部位，Aβ的低聚物通過激活NADPH氧化酶誘導皮質神經元產生活性氧，進而誘發神經損傷[22]。肌酸在進入線粒體與ATP結合提供能量過程中可以清除線粒體中的自由基，減少活性氧產生，產生抗氧化作用，減輕神經損傷。本研究中，與正常對照組相比，AD小鼠尿液中肌酸含量下調，給予山茶油后，小鼠尿液中肌酸水平顯著升高，說明山茶油可以通過干預精氨酸和脯氨酸代謝，影響大腦能量供應，減少線粒體中活性氧產生，減輕AD損傷。

S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）是半胱氨酸和蛋氨酸代謝中的重要代謝物。SAH在SAH水解酶的催化下分解為同型半胱氨酸和腺苷。研究表明，同型半胱氨酸含量升高抑制SAH水解酶活性，導致早期AD患者血漿和腦脊液中SAH含量顯著升高。SAH是大多數甲基轉移酶的有效抑制劑，可以通過抑制兒茶酚O-甲基轉移酶和苯乙醇胺N-甲基轉移酶的活性影響認知功能[23]。另有研究表明，二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）可以預防淀粉樣蛋白積累引起的氧化應激和學習能力喪失，但DHA在腦組織中不能合成，需要通過血腦屏障從血液和外周組織向腦組織轉運；SAH可以通過抑制肝臟中磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶的活性，減少紅細胞DHA從肝臟向外周組織和血漿轉運，從而降低腦內DHA濃度，造成認知能力損傷[24-26]。本研究中，與正常對照組相比，AD小鼠尿液中SAH含量上調，在給予山茶油之后，小鼠尿液中SAH含量顯著降低，推測山茶油可以通過干預半胱氨酸和蛋氨酸代謝，改善AD引起的記憶認知功能損傷。

N-乙酰基-L-天冬氨酸（N-acetyl-L-aspartic acid，NAA）在人體內主要集中在神經元細胞的細胞質中，是人腦中含量第二豐富的氨基酸[27]。NAA被認為是AD早期的潛在生物標志物，NAA含量與神經元密度以及完整性密切相關[28]。此外，腦內NAA被天冬氨酸酯酶水解產生足夠高濃度的天冬氨酸和乙酸，乙酸進一步合成乙酰輔酶A，產生的乙酰輔酶A可參與腦細胞線粒體中的能量供應，滿足神經元之間信息傳遞的需要[29-30]。本實驗中，與正常對照組相比，AD小鼠尿液中NAA含量下調，山茶油干預后的小鼠尿液NAA水平顯著提高，提示山茶油可以調節天冬氨酸代謝，增加小鼠體內NAA含量，增強大腦中能量供應，改善AD癥狀。

4 結論

本研究以尿液代謝組學為研究手段，探討了山茶油對AD的干預作用。基于差異代謝物的篩選及相關代謝通路的富集，發現山茶油可通過調節牛磺酸和次牛磺酸代謝，三羧酸循環，精氨酸和脯氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等代謝通路，促進能量代謝、減輕氧化損傷。本研究為日常食用山茶油防治AD提供了數據支撐。