高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯

戴嶸德，劉 峰，傅武勝,4, ，黃思婷，楊貴芝，劉文菁

（1.福建醫科大學公共衛生學院，福建 福州 350122；2.福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350012；3.寧夏疾病預防控制中心，寧夏 銀川 750000；4.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；5.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

母乳是嬰幼兒的最佳食物，母乳富含甘油三酯（triacylglycerols，TAG）等各類營養成分，TAG中最豐富的是1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1,3-dioleyl-2-palmitoyl-glycerol，OPO）和1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯（1-oleate-2-palmitate-3-linoleate-glycerol，OPL）等2位棕櫚酸（sn2-棕櫚酸）[1-3]。因此，OPO的添加在一定程度上彌補了嬰幼兒配方奶粉與母乳之間TAG成分的差異，OPO具有促進脂肪、鈣、鎂等礦物質的吸收[4-6]，軟化糞便[7]，改善腸道菌群[8-10]，減少嬰幼兒哭鬧及腸絞痛頻率等作用[11-13]，但歐洲食品安全局，歐洲兒科胃腸病學、肝病學和營養學學會并未認同sn2-棕櫚酸的上述作用；美國食品藥品監督管理局認定OPO屬于GRAS級（即一般公認為安全）[4,14-15]。2008年原衛生部批準了OPO為食品營養強化劑[16]，2012年進一步規范其允許添加量為24～96 g/kg[17]，要求以OPO純品計；2015年發布了GB 30604—2015《食品營養強化劑 1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯》，明確添加劑產品中OPO相對含量≥40%（以C52TAG質量計），在附錄A中給出了測定OPO的氣相色譜-氫離子火焰檢測器（gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID）法[18]。

在檢測過程中，需要將OPO的同分異構體1,2-二油酸-3-棕櫚酸甘油三酯（1,2-dioleyl-3-palmitoylglycerol，OOP）與OPO分離開，主要的檢測方法有高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）檢測法[19-21]、GC-FID法[22-23]、液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[24]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[25]等。研究表明，GC-FID、GC-MS尚無法實現二者的充分分離，文獻報道HPLC-ELSD、LC-MS/MS法可以一定程度實現二者的分離，但分離效果不佳或者保留時間較長[24,26-27]。其中銀離子色譜柱對于同分異構體的分離效果最好[20,28-30]。

銀離子色譜法已經被用于分離TAG的同分異構體，魏婷婷[29]、Adlof[21]等通過串聯兩根銀離子色譜柱測定OOP、OPO，但未實現兩者的基線分離，且分析時間較長；韋偉[20]、宋戈[28]等利用HPLC-ELSD，以二氯甲烷-丙酮為流動相，建立了嬰幼兒配方奶粉（以下簡稱嬰配）樣品中OPO的測定方法，但OOP和OPO仍然分離不完全，有部分色譜峰重疊，無法準確定量。Lisa等[24]根據脂肪酸鏈中雙鍵的數量和位置不同，以己烷-乙腈-異丙醇為流動相，利用3 根銀離子色譜柱串聯測定TAG及其同分異構體的組成，同樣OOP和OPO也未實現基線分離，且多根色譜柱串聯導致分析時間長。

本研究旨在建立嬰配中OPO含量的檢測方法，以期為國家建立相關食品安全標準提供可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OPO（純度為99%，CAS：1716-07-0）、OOP（純度為98%，CAS：2190-30-9）瑞典Larodan AB公司；三棕櫚酸甘油酯（1,2,3-tripalmitoyl glycerol，PPP）（純度為99%，CAS：555-44-2）、1,2-棕櫚酸-3-油酸甘油三酯（1,2-palmitin-3-olein，PPO）（純度為99%，CAS：1867-91-0）、1,3-棕櫚酸-2-油酸甘油酯（1,3-palmitin-2-olein，POP）（純度為99%，CAS：2190-25-2）、1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-硬脂酸甘油酯（1-palmitate-2-linoleate-3-stearateglycerol，PLS）（純度為99%，CAS：2190-12-7）、三油酸甘油三酯（1,2,3-trioleoyl-glycerol，OOO）（純度為99%，CAS：122-32-7）、1-硬脂酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯（1-stearin-2-olein-3-linolein，SOL）（純度為99%，CAS：2680-59-3）、1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯（1-palmitate-2-linoleate-3-oleate-glycerol，PLO）（純度為99%，CAS：2579-00-2）、1,2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯（1,2-dilinoleate-3-palmitate-glycerol，LLP）（純度為99%，CAS：2190-15-0）美國Panphy化學品公司；1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯（1-oleate-2-palmitate-3-linoleate-glycerol，OPL）（純度為99%，CAS：2534-97-6）上海甄準生物科技有限公司。

二氯甲烷、乙腈、正己烷（均為色譜純），氨水（質量分數約25%）、乙醚、石油醚和乙醇（均為分析純）國藥集團化學試劑公司；氨基固相萃取柱（500 mg/6 mL）深圳逗點公司；特殊醫學嬰幼兒配方食品8號樣品 河北省食品檢驗研究院；愛韻天使孕產婦配方乳粉 北京三元食品公司；星飛帆1段嬰幼兒配方奶粉（編號：QZ22202，脂肪標示值：272 g/kg，OPO：60 g/kg）中國飛鶴有限公司；秦益愛貝聰2段嬰幼兒配方奶粉（編號：10097W，脂肪標示值：225 g/kg，OPO：24 g/kg）陜西省定邊縣乳品實業有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

LC-20AD型高效液相色譜儀、ELSD-LT II型蒸發光散射檢測器、SPD-M20A型紫外檢測器 日本Shimadzu 公司；24 位氮吹儀 上海安譜公司；水浴恒溫振蕩器 金壇市精達儀器公司；XM-P10H超聲波清洗機 小美超聲儀器（昆山）公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用公司；34H24R1離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；Luna 5 μm SCX 100A-silver色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）美國Phenomenex公司；Chromspher 5 Lipids銀離子色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）美國Agilent公司；C18色譜柱（5 μm，3.9 mm×150 mm）美國Waters公司。

1.3 OPO的測定方法

1.3.1 脂肪提取

參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》及文獻[31-32]的方法并進行適當調整，主要減少稱樣量。準確稱取嬰幼兒配方乳粉0.5 g（精確至0.001 g），加入2 mL、（65±5）℃水溶解，加入1.0 mL氨水，在（65±5）℃水浴條件下振搖30 min，冷卻至室溫后，加入3.0 mL乙醇混勻。加入乙醚、石油醚各5 mL，均振搖5 min，離心后取上清液到50 mL離心管，再加入乙醚和石油醚重復提取一次。于55 ℃水浴條件下氮吹至干，準確加入3.00 mL正己烷溶解殘余物，充分混勻，備用。

1.3.2 脂肪凈化的優化

氨基固相萃取柱預先用10 mL正己烷活化后，準確移取2.00 mL上述溶液上柱，比較不同洗脫溶劑（二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、乙酸乙酯、10%二氯甲烷-正己烷）對溶液凈化效果（用吸光度表示）及回收率的影響，在上述基礎上比較不同比例二氯甲烷-正己烷（2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%）洗脫溶液對回收率的影響，并考察了不同體積洗脫溶液（2、4、6、8、10 mL）對回收率的影響，將上樣后的流出液和洗脫液一同收集，于55 ℃水浴氮吹至干；準確加入2.00 mL正己烷渦旋混勻，精確取出200 μL，用正己烷定容至1.00 mL，渦旋混勻，過0.22 μm有機濾膜，供液相色譜測定。

1.3.3 液相色譜條件的優化

色譜柱條件優化：比較Luna 5 μm SCX 100A-silver色譜柱（以下簡稱Luna 色譜柱）（5 μm，250 mm×4.6 mm）、Chromspher 5 Lipids銀離子色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）、C18色譜柱（5 μm，3.9 mm×150 mm）的分離效果。

流動相條件優化：比較不同比例（0.5%、0.55%、0.6%、0.7%）乙腈的正己烷（現配現用，超聲30 min）的分離效果。

ELSD條件優化：比較不同漂移管溫度（40、60、80 ℃）、不同氮氣流速（1.2、1.4、1.6、2.0 L/min）對信噪比（RSN）的影響。

其他固定條件：進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流速：1.2 mL/min，洗脫時間：30 min。

1.4 數據處理

使用島津公司LabSolutions工作站對色譜數據進行處理，用Excel 2019進行數據預處理，使用SPSS 27.0.1統計并分析數據，并用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 ELSD參數優化

TAG沒有熒光特性，在紫外波長（＜210 nm）條件下才有較弱的吸收，因此紫外檢測器和熒光檢測器不適合用于OPO的定性和定量測定[29]。國內外分析TAG大多采用LC-MS/MS法，本研究選擇ELSD作為信號的檢測手段。

ELSD中影響待測物靈敏度的參數主要是漂移管的蒸發溫度和氮氣流速，蒸發溫度升高將促進流動相的快速揮發，使得噪音降低。比較漂移管3 種溫度（40、60、80 ℃）發現，當溫度為60 ℃時，OPO的RSN最大（圖1a），所以確定最佳溫度為60 ℃。對于氮氣流速而言，在控制其他條件不變的前提下，載氣流速越大，霧化時的液滴尺寸越小，其散射光減少，相應的響應信號越小，最佳氣體流量應該是在可接受的低噪音基線條件下產生最大峰面積時的流量。實驗表明，氮氣流速低（1.2、1.4 L/min）時，背景信號高，導致噪聲變大，進而引起靈敏度下降；當流速為1.6 L/min時，OPO的RSN最大；流速達到2.0 L/min時，流速過大，OPO可能容易被吹走，導致RSN明顯下降（圖1b），故確定氮氣的最佳流速為1.6 L/min。

圖1 漂移管溫度和N2流速對信噪比（RSN）的影響Fig.1 Influence of drift tube temperature and nitrogen gas flow rate on signal-to-noise ratio

2.2 色譜條件的優化

比較C18色譜柱、Luna色譜柱、Chromspher 5 Lipids銀離子色譜柱對OOP和OPO的分離效果。從實驗結果來看，C18色譜柱在二氯甲烷和乙腈為流動相進行梯度洗脫時，無法實現OOP和OPO的完全分離，文獻[28]的結果也表明，C18色譜柱難以將TAG的同分異構體分離開。對于Luna色譜柱，采用二氯甲烷-丙酮、乙腈-正己烷等梯度洗脫兩種條件進行實驗。結果表明，乙腈-正己烷體系的分離效果更好，故選擇該體系進行繼續優化，包括Agilent色譜柱的優化。

使用Luna色譜柱，以乙腈-正己烷體系為流動相，通過調整該體系中的乙腈的比例提高OOP和OPO的分離度，對比乙腈比例為1.0%、0.8%、0.7%、0.6%的乙腈-正己烷，結果顯示，含0.7%乙腈的正己烷能夠將OPO和OOP完全分開，分離度約為1.6，保留時間為20 min，OPO的RSN約為16；含0.6%乙腈的正己烷也能夠將二者充分分離，分離度約為1.9，但保留時間較長，尤其OPO響應較低，其RSN僅為2.0，遠低于含0.7%乙腈的正己烷洗脫效果。綜合考慮，初步選擇含0.7%乙腈的正己烷為流動相。但該色譜柱用于實際樣品分離時，無法實現OOP和OPO的基線分離，且OPO色譜峰附近有許多干擾峰，無法準確測定OPO的含量。

使用Chromspher 5 Lipids銀離子色譜柱，流動相比例以Luna色譜柱的體系為參考，對比含不同比例乙腈的乙腈-正己烷為流動相，分別進樣標準溶液和嬰配樣品，結果見圖2、3。用0.55%乙腈-正己烷的流動相時，目標物的分離度高，達到基線分離，保留時間較0.5%乙腈-正己烷為流動相時更短，且實際樣品OOP和OPO也能實現有效分離，因此選擇0.55%乙腈-正己烷為流動相。

圖2 不同比例乙腈條件下標準溶液和嬰配樣品中OPO和OOP的分離度Fig.2 Effect of various acetonitrile and n-hexane mixtures on the separation of OPO and OOP in standard solutions and infant formula

圖3 混合標準溶液及嬰配中OOP和OPO的色譜圖Fig.3 Chromatograms of OOP and OPO in standard solutions and infant formula

用雙泵按照等度輸送流動相時，發現OOP和OPO的保留時間和峰面積不夠穩定，這可能與乙腈和正己烷之間溶解性低有關，因此流動相使用前充分超聲，以提高兩者的互溶程度；同時存放流動相的試劑瓶應采用安全蓋，以降低因蒸發引起的溶劑比例改變。結果顯示，當超聲達到30 min，其保留時間、峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為5.38%、0.65%，變化小且重復性好。

實際樣品中TAG種類眾多，在母乳和嬰配樣品分析中報道了以下幾種。總碳數為48的飽和TAG 48:0，如PPP；總碳數為50、雙鍵為1的TAG 50:1，如PPO、POP；TAG 52:2，如OOP、OPO、PLS和TAG 52:4，如LLP，TAG 54:3，如OOO、SOL，TAG 52:3，如OPL、PLO等[33-34]。飽和、單不飽和和三不飽和的TAG在銀離子色譜分離中預計不會與OPO、OOP重疊[35]，但仍然必須排除OPO、OOP與樣品中可能存在的其他不飽和TAG重疊的可能性，如PLS及其區域異構體。因此，利用現有標準品證實，在優化后的條件下，這些TAG異構體（PLS、OOP、PLO、OPL、OOO、LLP）在銀離子柱中能與OPO明顯分離（圖4），PLS能與OPO、OOP有效分離，且OPL及其同分異構體也不對OPO的分離產生影響，可以認為該條件下OPO的色譜峰不存在其他TAG的干擾。

圖4 HPLC-ELSD測定中OPO與其他TAG分離的色譜圖Fig.4 HPLC-ELSD chromatogram showing separation of OPO from other TAGs

2.3 樣品前處理優化

在實際樣品檢測過程中，發現進樣樣品有一定程度的基質效應，且對后續進樣結果及色譜柱柱效產生影響[36]。因此，本研究采用氨基固相萃取柱對樣品凈化。比較不同洗脫溶劑（圖5），以10%二氯甲烷-正己烷為流動相時，洗脫液的紫外吸收最低，且回收率符合要求，說明其含有的具有紫外吸收的雜質較少。在此基礎上，進一步比較了不同比例二氯甲烷-正己烷的洗脫效果（圖6），OPO的回收率在40.5%～104.5%之間，當二氯甲烷占正己烷比例達到10%時，回收率效果最佳。

圖5 洗脫溶劑對雜質去除效果及OPO回收率的影響Fig.5 Effects of neat and mixed solvents on the removal of impurities and on the recovery of OPO

圖6 洗脫溶劑中二氯甲烷比例對OPO回收率的影響Fig.6 Effect of various dichloromethane and n-hexane mixtures on OPO recovery

用占比為10%二氯甲烷-正己烷洗脫，每2 mL收集1 管進行測定，結果表明，當洗脫液達到8 mL時，OPO的回收率接近100%，并基本保持穩定，為使目標物得到充分洗脫，因此最終選擇10 mL占比為10%的二氯甲烷-正己烷為洗脫劑。

2.4 提取次數的考察

首先采用加標實驗考察樣品中OPO的回收率，樣品提取1 次時OPO的回收率約為77.4%，提取2 次時OPO的回收率約為102.6%，提取3 次時OPO的回收率約為102.16%，這初步說明兩次提取即可滿足OPO的回收率要求。考慮加標實驗有一定的局限性，因此更進一步考察實際嬰配樣品脂肪、OPO提取的情況。用飛鶴嬰配樣品（IF1）和愛貝聰嬰配樣品（IF2）進行對比實驗，兩種奶粉的脂肪及OPO含量詳見1.1節，結果如圖7所示。兩種奶粉第一次提取的脂肪量占嬰配中脂肪含量標示值的82.3%～94.4%，符合標準要求[37]。前兩次提取脂肪總量之和占提取總量的99.2%（IF1）、94.4%（IF2），提取OPO總量之和占提取總量的100%、95.9%。第3次提取時，IF1、IF2中脂肪的提取率分別為0.8%、5.5%，OPO的提取率分別為0%、4.1%，造成這兩種嬰配中脂肪和OPO提取率有一定差異的原因可能是兩者的脂肪來源及制作工藝不同。提取兩次時，IF1、IF2中OPO含量分別為19.25、11.14 g/kg，分別占產品標示值的32.1%、46.4%（根據初步了解，很大可能為采用GC-FID法得到值或推測值）。綜上，第3次所提取的脂肪含量及OPO含量較低，只占總量的0%～5.5%，對測定結果影響不大，可忽略不計。考慮有機溶劑節約和工作效率，因此確定提取2 次可滿足要求。

圖7 提取次數對脂肪和OPO提取率的影響Fig.7 Impact of number of extraction cycles on the extraction efficiencies of fat and OPO

2.5 溶液膜過濾的考察

考察尼龍、聚四氟乙烯和聚偏氟乙烯3 種微孔濾膜（規格均為13 mm、0.22 μm）的過濾效果，OPO的回收率結果顯示，3 種濾膜對于OPO的回收率影響小，均能滿足要求。

2.6 方法驗證

2.6.1 線性范圍、檢出限和定量限

根據最佳儀器條件進行實驗，以OPO標準品質量濃度（C）的對數值lgC（x）與峰面積（A）的對數值lgA（y）繪制線性回歸曲線，其線性方程為y＝1.7795x+1.762 3，決定系數R2＝0.999 6，線性范圍25～500 μg/mL。選擇OPO未檢出的嬰配樣品提取脂肪后，溶液以氨基固相萃取柱凈化后，加入OPO進行實驗，以3 倍信噪比（RSN＝3）確定檢出限（limit of detection，LOD），以10 倍信噪比（RSN＝10）確定為定量限（limit of quantitation，LOQ），OPO的LOD為0.30 g/kg，LOQ為0.90 g/kg。

2.6.2 正確度和精密度

以未檢出OPO的1段嬰配（陜HZ2020）為基質，進行5 個含量水平（1、2、10、24、96 g/kg）的加標回收實驗（n＝6），覆蓋了LOQ，符合GB 14880—2012《食品營養強化劑使用標準》中允許強化量要求，結果見表1。OPO的回收率均值在97.1%～104.2%之間，RSD范圍為1.2%～2.9%。

表1 嬰配樣品中OPO的加標回收率和RSD結果（n ＝6）Table 1 Recoveries and RSDs of OPO from spiked infant formula (n=6)

福建省疾病預防控制中心（Lab4）邀請青島海關技術中心（Lab1）、福建省產品質量檢驗研究院（Lab2）、莆田市疾病預防控制中心（Lab3）參加了實驗室間協同性驗證，分別對嬰配（IF3）、特膳奶粉（IF4）、調制乳粉（IF5）這3 種基質進行24、96 g/kg兩種水平的加標實驗，結果如圖8所示。可以看出，4 家實驗室的平均回收率和RSD均符合GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的要求[38]，說明本方法檢測OPO結果準確可靠。

圖8 實驗室間協同性驗證OPO回收率和精密度結果Fig.8 Recoveries and RSDs of OPO in infant formula in interlaboratory collaborative validation

2.7 實際樣品分析

利用研制的方法對我國39 份OPO強化嬰配進行OPO檢測，OPO含量占產品標示值比例如表2、圖9所示；對比3 個段數（0～6、6～12、12～24 月齡）嬰配之間該比值差異不大。本次調查OPO強化后嬰配中OPO含量在5～20 g/kg之間，僅為OPO標示值（26～68 g/kg）的28.4%～59.7%，這可能主要因為本實驗HPLC法測定特異性強，能將OPO與其同分異構體OOP分開。據了解，目前較多采用食品營養強化劑標準GB 30604—2015[18]附錄A中GC-FID法測定產品中OPO含量。從該方法分析原理可知，由于使用的氣相色譜柱（DB-1 HT）無法將OPO和OOP分離開，測得結果為3 個脂肪酰基中總碳數為52的C52TAG的總含量；本實驗室研究表明，嬰配中普遍含有較高含量的OOP，因此用GC-FID法測定OPO時，測定結果將明顯偏高。

表2 市售嬰配中OPO含量占標示值的比例Table 2 Percentages of measured OPO contents relative to the labelled values of 39 commercial samples of infant formula

圖9 HPLC法調查39 份市售嬰配中OPO含量占產品標簽標示值的比例Fig.9 Percentages of OPO contents measured by HPLC relative to the label values of 39 commercial samples of infant formula

進一步研究表明，本法既能夠將OPO與OOP分離，也能將OPO與其他C52TAG分離開，能測定單一的OPO物質；所調查OPO強化嬰兒、幼兒、學齡前配方奶粉中的OPO均能與OOP類干擾物較好地分離，這說明本方法能較好適用于嬰幼兒食品中OPO含量的測定，并滿足GB 14880—2012[17]測定OPO純品的要求。

3 結論

本方法通過優化銀離子色譜柱的分離條件，成功實現了OPO與其同分異構體OOP，以及其他C52甘油三酯的分離，優化了ELSD的參數，建立了HPLC法，可精確測定嬰配中OPO的含量，方法重復性好、準確度高，較好滿足了嬰配中OPO的檢測需求；測定方法用于調查我國16 個品牌共39 份市售嬰配中OPO的含量，結果表明，全部樣品中以HPLC法測定的OPO含量僅為產品標簽標示值的28.4%～59.7%，含量普遍較低，這很大程度因為測定方法之間的原理不同。