非小細胞肺癌組織中circBIRC6、APPBP2表達及臨床預后意義

陳麗萍 籍強 陳艷紅 史永興 馮平 林衛(wèi)佳 項保利 趙建清

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常見的類型,占所有肺癌的85%以上,據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)報道,2020年全球肺癌新發(fā)病例2206771例,死亡1796144例,我國肺癌新發(fā)病例815563例,死亡714699例,發(fā)病率和死亡率均居全球首位[1]。尋找相關(guān)標志物評估NSCLC患者臨床預后非常重要。研究表明,環(huán)狀核糖核酸(circular ribonucleic acid,circRNA)能通過調(diào)控多種靶基因在NSCLC進程中發(fā)揮重要作用[2]。桿狀病毒IAP重復序列6(baculoviral IAP repeat containing 6,BIRC6)是新近發(fā)現(xiàn)的一種circRNA,研究報道circBIRC6與肝細胞癌患者預后有關(guān)[3]。同時有學者指出,在NSCLC中異常表達,并與肺癌細胞惡性進展密切相關(guān)[4]。β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白2(amyloid beta precursor protein binding protein 2,APPBP2)是一種膜內(nèi)在蛋白,能通過轉(zhuǎn)運和/或加工淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)調(diào)控腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[5]。相關(guān)研究指出,APPBP2與結(jié)直腸癌患者預后有關(guān)[6]。本研究擬探討NSCLC組織中circBIRC6、APPBP2表達及臨床預后意義,為促進NSCLC患者預后提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年6月～2020年1月90例在河北北方學院附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除的NSCLC組織及癌旁組織(距離癌組織≥3cm),女25例、男65例;年齡范圍27～75歲,平均(60.47±8.36)歲;40例吸煙;病理類型:29例腺癌、53例鱗癌、8例腺鱗癌;表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變:陽性46例、陰性44例;腫瘤大小:≥5cm的患者為17例、<5cm的患者為73例;分化程度:31例低分化、59例中高分化;TNM分期[7]:14例Ⅰ期、29例Ⅱ期、47例Ⅲ期;45例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。納入標準:(1)經(jīng)病理檢查確診為NSCLC。(2)接受根治性或姑息性切除。(3)患者或家屬簽署同意書。排除標準:(1)非初診或入院前已接受抗腫瘤治療。(2)不可手術(shù)切除或術(shù)前接受化療。(3)合并其他肺部疾病。(4)合并急慢性感染。(5)合并其他部位惡性腫瘤。(6)不能耐受手術(shù)。(7)臨床或隨訪資料不完整。(8)合并自身免疫性疾病。(9)年齡<18歲。(10)合并精神疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(W2023041)。

二、方法

使用總核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)提取試劑盒(試劑盒購自江西艾博因生物科技有限公司,貨號:IBIO-C1764)從NSCLC組織及癌旁組織中提取總RNA,紫外分光光度計(儀器購自上海譜元儀器有限公司,型號:Alpha-1860Plus)驗證RNA純度和完整性合格后,使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司,貨號:RR036A)將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA。使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應系統(tǒng)(儀器購自賽默飛世爾科技公司,型號:7500 Fast)并按照聚合酶鏈式反應試劑盒(試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司,貨號:RFT164-JMA)說明書進行擴增。反應體系:單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄液1μL、2×聚合酶鏈式反應緩沖液10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、去離子水7μL,總體積20 μL;熱循環(huán)參數(shù):先95℃預變性5min,然后循環(huán)40次94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s。收集熒光信號,通過2-ΔΔCT法計算組織中circBIRC6、APPBP2相對表達量。引物序列由北京擎科生物科技股份有限公司設(shè)計和合成:circBIRC6上游引物:5′-CCACAGATACAAGTGACACTGC-3′、下游引物:5′-CTGGAGTTTGCAGAGCAGTG-3′;APPBP2上游引物:5′-CGCT-GTCGTGGACAACTACAT-3′、下游引物:5′-ATAAGCG-TCCCTGTTGGTAAAG-3′;內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游引物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

三、隨訪和分組

通過電話或門診方式對NSCLC患者隨訪3年(3～6個月/次),隨訪終止事件為患者死亡或隨訪終點時間(2023年1月),統(tǒng)計3年總生存率。根據(jù)NSCLC組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達均值分為高/低表達組。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、NSCLC組織和癌旁組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達比較

NSCLC組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達高于癌旁組織(P<0.05)(見表1)。

表1 NSCLC組織和癌旁組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達比較

二、NSCLC組織中circBIRC6與APPBP2 mRNA表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示,NSCLC組織中circBIRC6與APPBP2 mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.817,P<0.001)(見圖1)。

圖1 NSCLC組織中circBIRC6與APPBP2 mRNA表達的相關(guān)性圖

三、circBIRC6、APPBP2 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

NSCLC患者不同分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達比較有差異(P<0.05),不同性別、年齡、吸煙、病理類型、EGFR基因突變、腫瘤大小組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達比較無差異(P>0.05)(見表2)。

表2 circBIRC6、APPBP2 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

四、不同EGFR基因突變、TNM分期和circBIRC6、APPBP2 mRNA表達與NSCLC患者總生存率的關(guān)系

隨訪3年,90例NSCLC患者3年總生存率為55.56%(50/90)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,EGFR基因突變陽性(46例)總生存率為50.00%(23/46)與EGFR基因突變陰性(44例)的61.36%(27/44)比較無差異(Log-rank χ2=0.824,P=0.364,圖2A)。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(43例)NSCLC患者總生存率為79.07%(34/43)高于Ⅲ期(47例)NSCLC患者的34.04%(16/47);(Log-rank χ2=15.005,P<0.001,圖2B)。circBIRC6高表達組(≥10.97,46例)總生存率為45.65%(21/46)低于低表達組(<10.97,44例)的65.91%(29/44);APPBP2 mRNA高表達組(≥2.48,45例)總生存率為46.67%(21/45)低于低表達組(<2.48,45例)的64.44%(29/45)(Log-rank χ2=5.203、4.718,P=0.023、0.030,圖2C-D)。

圖2 NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線A:EGFR基因突變陽性/陰性NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線;B:不同分期NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線;C:circBIRC6高/低表達NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線;D:APPBP2 mRNA高/低表達NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線

五、NSCLC患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析

將失訪患者排除,以隨訪時間為時間變量,性別(男/女=1/0)、年齡(≥60歲/<60歲=1/0)、吸煙(是/否=1/0)、病理類型(腺鱗癌/鱗癌/腺癌=3/2/1)、EGFR基因突變(陽性/陰性=1/0)、腫瘤大小(≥5cm/<5cm=1/0)、分化程度(低分化/中高分化=1/0)、TNM分期(Ⅲ期/Ⅰ～Ⅱ期=1/0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是/否=1/0)、circBIRC6(≥10.97/<10.97=1/0)、APPBP2 mRNA(≥2.48/<2.48=1/0)為自變量,生存狀態(tài)(死亡/存活=1/0)為因變量,選擇“Enter”法建立單因素和多因素Cox回歸模型。結(jié)果顯示:低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和circBIRC6≥10.97、APPBP2 mRNA≥2.48為NSCLC患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)(見表3)。

表3 NSCLC患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析

討 論

NSCLC是除小細胞肺癌以外所有起源于支氣管粘膜上皮的惡性腫瘤的統(tǒng)稱,以氣短、咯血和反復咳嗽等為主要臨床表現(xiàn),目前認為其誘發(fā)原因包括吸煙、油煙、環(huán)境污染、慢性肺部疾病史、肺癌家族史、職業(yè)致癌物質(zhì)暴露史等[8]。近年來隨著居民健康意識的提高和低劑量螺旋計算機斷層掃描的開展,早期NSCLC診斷率有所提高,但初診晚期仍然占75%[8-9]。盡管近年來腫瘤分子生物學的進展使晚期NSCLC靶向和免疫治療取得極大進展,NSCLC患者預后有所改善,但療效隨著治療時間延長和患者數(shù)量增加逐漸降低,NSCLC患者總體預后依然很差[10-11]。尋找NSCLC預后影響因素,對指導患者個體化治療和促進預后改善具有重要意義。

circRNA是一類新型的非編碼RNA,最初被認為是RNA剪接錯誤而出現(xiàn)的副產(chǎn)物,近年研究發(fā)現(xiàn)circRNA具有高度穩(wěn)定性和保守性,可以通過與線性微小RNA(microRNA,miRNA)相互競爭對mRNA進行螯合,或直接與RNA結(jié)合蛋白相互作用,或miRNA海綿競爭性干擾miRNA與mRNA結(jié)合等多種機制參與腫瘤過程[12]。circBIRC6是人染色體2p22.3上的一種circRNA,是凋亡抑制蛋白家族中相對分子量巨大的成員,能作為泛素連接酶促進凋亡蛋白的蛋白酶體降解,促進細胞存活[13]。基于circRNA的抗凋亡作用,近年來被多種研究報道參與惡性腫瘤過程。如circBIRC6能靶向下調(diào)miR-449b-5p促進胃癌細胞增殖、周期進展和抑制其凋亡[14];circBIRC6能靶向下調(diào)miR-495-3p上調(diào)X-盒結(jié)合蛋白1,促進膀胱癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15];circBIRC6能靶向下調(diào)miR-367-3p促進卵巢癌順鉑耐藥和抑制癌細胞凋亡[16]。研究提示,circBIRC6在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。同時有實驗顯示,下調(diào)circBIRC6表達能抑制NSCLC細胞增殖、分化、遷移、侵襲和促進凋亡[17-18]。然而關(guān)于circBIRC6在臨床NSCLC癌組織的表達意義尚不清楚。結(jié)果顯示,NSCLC組織中circBIRC6高表達,提示circBIRC6高表達可能參與NSCLC發(fā)生,符合上述研究結(jié)果。結(jié)果還顯示,NSCLC組織中circBIRC6表達與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),circBIRC6高表達患者3年總生存率顯著降低,是NSCLC患者死亡的獨立危險因素,進一步說明circBIRC6高表達參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。其機制可能是circBIRC6能靶向miR-944上調(diào)程序性細胞死亡配體1表達,抑制腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞對NSCLC細胞的殺傷作用,促進NSCLC細胞存活和持續(xù)惡性發(fā)展,進而導致患者預后降低[19]。

APP是一種跨膜糖蛋白,既往常被作為阿爾茨海默病的重要參與者,近年研究發(fā)現(xiàn)APP不僅在神經(jīng)中大量表達,在各種非神經(jīng)組織中也表達豐富,能影響細胞增殖、分化、遷移和存活,在結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌、甲狀旁腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中過表達,并影響著癌細胞進程[20]。APPBP2是一種與微管相互作用,并在功能與APP轉(zhuǎn)運和加工相關(guān)有關(guān)的膜內(nèi)在蛋白,基于APPBP2對APP的調(diào)控作用,且APPBP2自身也能影響微管活動和功能,因此有學者推測APPBP2在惡性腫瘤中扮演重要角色[5]。有學者通過基因組鑒定發(fā)現(xiàn),APPBP2異常表達與乳腺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)[21-22]。實驗指出,下調(diào)APPBP2能增強NSCLC細胞對靶向藥物的敏感性,抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲[23]。然而關(guān)于APPBP2在臨床NSCLC癌組織的表達意義尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,NSCLC組織中APPBP2高表達,提示APPBP2高表達可能參與NSCLC發(fā)生。結(jié)果還顯示,NSCLC組織中APPBP2表達與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),APPBP2高表達患者3年總生存率顯著降低,是NSCLC患者死亡的獨立危險因素,進一步說明APPBP2高表達參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。其機制可能是APPBP2高表達能促進APP大量合成,通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路,促進NSCLC惡性進展[24]。同時APPBP2高表達也會導致微管功能異常,改變細胞骨架結(jié)構(gòu),促進NSCLC細胞持續(xù)分裂、增殖和遷移[5]。

本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),NSCLC組織中circBIRC6與APPBP2 mRNA表達呈正相關(guān),提示circBIRC6與APPBP2可能共同參與NSCLC進程而影響患者預后。最近Ni等[25]通過雙熒光素酶報告基因檢測也發(fā)現(xiàn),NSCLC中circBIRC6能通過海綿miR-217促進APPBP2表達,敲低circBIRC6則會抑制APPBP2表達,進而抑制NSCLC細胞增殖、侵襲和存活。此外本研究結(jié)果還顯示,EGFR基因突變陽性/陰性NSCLC患者總生存率并無差異,考慮原因是EGFR基因突變雖然對EGFR靶向治療更敏感,但針對部分EGFR基因突變亞型作用較差,因此可能影響療效,這與既往研究報道結(jié)果相符[26]。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者總生存率高于Ⅲ期患者,且TNM分期Ⅲ期為NSCLC患者死亡的獨立危險因素,說明TNM分期能顯著影響NSCLC患者預后。其原因可能是TNM分期越高反映腫瘤細胞的侵襲性更強,惡性程度更高,因此會降低總生存率,并增加死亡風險。

綜上所述,NSCLC組織中circBIRC6、APPBP2 mRNA表達升高,與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后有關(guān)。但本研究樣本量較少和隨訪時間較短,其結(jié)果還需多中心研究進一步擴張樣本量和延長隨訪時間進行驗證。