MMR基因突變的前列腺癌16例臨床病理分析

尹文蓮,張孟尼,陳雪芹,聶 玲,周 橋,陳 鈮

前列腺癌中錯配修復(mismatch repair, MMR)基因突變比例較低,僅占2%～5%[1]。但MMR基因胚系致病突變會增加男性患前列腺癌的風險,且與前列腺癌的不良預后有關(guān),如分化低、遠處轉(zhuǎn)移和晚期前列腺癌等[2-3]。在2023版NCCN指南中,MLH1、MSH2、MSH6和PMS2被推薦作為遺傳性前列腺癌的候選基因[4]。近年來,美國食品和藥物管理局(food and drug administration, FDA)已批準PD-1抑制劑用于治療錯配修復缺陷(mismatch repair deficiency, dMMR)或高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability-high, MSI-H)的相關(guān)實體腫瘤[5]。在MMR突變的前列腺癌研究中,PD-1抑制劑也被證實具有潛在的免疫治療價值[3,6-7]。此外,MMR缺陷的前列腺癌患者對新型內(nèi)分泌治療也較敏感[3],因此檢測前列腺癌患者的MMR缺陷具有重要臨床指導意義。結(jié)直腸癌中MSI-H/dMMR的診斷主要通過MSI-PCR分析或免疫組化染色檢測MMR蛋白表達作為MMR缺陷的初篩手段[8]。目前,前列腺癌中MMR基因突變和蛋白表達相關(guān)性的研究較少,本研究總結(jié)了16例NGS檢出MMR基因突變的前列腺癌的臨床病理特征,并探討MMR基因突變與蛋白表達的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2014年6月～2021年12月四川大學華西醫(yī)院行基因檢測的前列腺癌患者249例。患者年齡43～91歲,平均(67.7±8.6)歲,中位年齡68歲;超過80%的患者初診PSA>20 ng/mL。收集腫瘤石蠟樣本或血液樣本進行NGS檢測,其中16例檢出MMR基因突變。對檢出MMR基因突變患者的石蠟組織樣本進行MMR蛋白免疫組化染色。所有患者的樣本采集和檢查均簽署書面知情同意書。

1.2 基因檢測準備好的組織樣本(腫瘤組織和配對癌旁組織)或血液樣本送思路迪醫(yī)學檢驗有限公司實驗室進行NGS測序。NGS檢測使用定制的NGS panel對156個前列腺癌相關(guān)基因進行高通量測序,包括與癌癥遺傳風險相關(guān)的38個基因,本研究主要關(guān)注MMR通路的相關(guān)基因變異。

1.3 免疫組化16例中有14例獲得石蠟組織樣本,另2例(例4、5)為外院會診病例,未獲得石蠟組織樣本。采用免疫組化EnVision法檢測MLH1(ES05)、PMS2(EP51)、MSH2(RED2)、MSH6(EP49)的表達,一抗均購自北京中杉金橋公司。MMR蛋白免疫組化陽性信號均定位于細胞核。所有病例切片均由2位泌尿男性生殖病理亞專業(yè)組醫(yī)師復片。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征、病理組織學分級及形態(tài)特征16例MMR基因突變的前列腺癌患者年齡55～79歲,中位年齡69歲。患者多因排尿不暢、腹痛或發(fā)現(xiàn)PSA升高就診。1例(6.3%)初診PSA<10 ng/mL,1例(6.3%)初診PSA為10～20 ng/mL,14例(87.5%)初診PSA>20 ng/mL;4例(25%)為局限性前列腺癌,12例(75%)有遠處轉(zhuǎn)移,其中11例為骨轉(zhuǎn)移,1例為多部位轉(zhuǎn)移(骨、肺、肝及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移);12例(75%)患者為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)。

本組16例MMR基因突變病例的組織學形態(tài)以經(jīng)典的腺泡腺癌為主。組織學分級：2例(12.5%)為Gleason評分4+3=7分,ISUP/WHO 2016分級分組第3組;5例(31.2%)為Gleason評分4+4/3+5=8分,ISUP/WHO 2016分級分組第4組;9例(56.3%)為Gleason評分9/10分(4+5/5+4/5+5),ISUP/WHO 2016分級分組第5組。其中7例(43.8%)伴有前列腺導管內(nèi)癌(intraductal carcinoma of the prostate, IDC-P)成分,包括1例疏松篩狀型IDC-P和6例致密篩狀型/實體型IDC-P;2例(28.6%)IDC-P成分占比<10%,5例(71.4%)IDC-P成分占比≥10%。除此之外,1例(6.3%)伴有導管腺癌成分,3例(18.8%)局灶有神經(jīng)內(nèi)分泌表型,6例(37.5%)查見神經(jīng)或血管侵犯,4例(25%)查見前列腺外累及。

2.2 MMR基因突變16例MMR基因突變中,包括8例MMR基因致病性突變和8例臨床意義不明變異。8例致病性突變包括：4例MSH2(2例胚系和2例體系)、3例MSH6(1例胚系和2例體系)和1例MLH3體系突變。8例臨床意義不明變異包括4例MSH6(2例胚系和2例體系)、2例PMS2(1例胚系和1例體系)、2例MLH1(1例胚系和1例體系)和2例MSH2胚系突變,其中有2例分別同時檢出MSH6、MLH1突變和MSH2、MSH6突變。總體而言,MSH6突變率最高(7/16,43.8%),其次是MSH2突變(6/16,37.5%)(表1)。

表1 16例前列腺癌患者的MMR基因突變和蛋白表達

2.3 MMR基因突變與蛋白表達的相關(guān)性14例石蠟組織樣本進行MMR免疫組化染色,其中5例(35.7%)檢出MMR蛋白表達缺失,均表現(xiàn)為MSH2和MSH6蛋白缺失,MLH1和PMS2蛋白無缺失。5例蛋白表達缺失病例中,2例為MSH2致病突變、2例為MSH6致病突變(圖1),1例為MSH6和MLH1臨床意義不明變異。其余2例MMR基因致病突變(例3、8)(圖2)和7例MMR基因臨床意義不明變異未檢出MMR蛋白表達缺失。致病突變病例中NGS與免疫組化結(jié)果匹配率為4/5(80.0%),而意義不明變異中NGS與免疫組化結(jié)果匹配率僅為1/8(12.5%)(表1)。進一步對致病突變中NGS與免疫組化結(jié)果不匹配的例3進行MSI-PCR驗證,結(jié)果證實該例為微衛(wèi)星穩(wěn)定型,與免疫組化結(jié)果一致。

圖1 MMR基因突變患者(例6)的HE和MMR免疫組化染色：A. Gleason評分為5分的區(qū)域;B. 前列腺導管內(nèi)癌形態(tài);C. 腫瘤細胞核表達MLH1,EnVision法;D.腫瘤細胞MSH2表達缺失,血管內(nèi)皮和淋巴細胞為陽性內(nèi)對照,EnVision法;E.腫瘤細胞MSH6表達缺失,血管內(nèi)皮和淋巴細胞為陽性內(nèi)對照,EnVision法;F.腫瘤細胞核表達PMS2,EnVision法 圖2 MMR基因突變患者(例3)的HE和MMR免疫組化染色：A、B. HE形態(tài);C.腫瘤細胞核表達MLH1,EnVision法;D.腫瘤細胞核表達MSH2,EnVision法;E.腫瘤細胞核表達MSH6,EnVision法;F.腫瘤細胞核表達PMS2,EnVision法

2.4 特殊病例例2,69歲,分別于2020年4月和5月在我院確診為前列腺癌和右側(cè)腎盂低級別尿路上皮癌。前列腺癌為T2期,行前列腺癌根治術(shù)。病理診斷為腺泡腺癌,Gleason評分4+3=7分(ISUP/WHO 2016分級分組第2組),腫瘤間質(zhì)可見較多淋巴細胞浸潤;免疫組化顯示MSH2和MSH6表達缺失,MLH1和PMS2無缺失(圖3)。右側(cè)腎盂癌腫瘤最大徑約2.5 cm,右腎盂活檢標本病理診斷為乳頭狀尿路上皮癌(WHO低級別),間質(zhì)可見灶性壞死和鈣化;免疫組化同樣顯示MSH2和MSH6表達缺失,MLH1和PMS2無缺失(圖4)。基因檢測結(jié)果顯示該患者為MSH2胚系致病突變(c.1386+2T>C),但患者無結(jié)直腸癌病史及家族史,而是罕見的以前列腺癌和腎盂尿路上皮癌為臨床表現(xiàn)。

圖3 例2的前列腺癌HE形態(tài)和MMR免疫組化染色：A. HE示前列腺腺癌;B.間質(zhì)見大量淋巴細胞浸潤;C.腫瘤細胞核表達MLH1,EnVision法;D.腫瘤細胞MSH2表達缺失,血管內(nèi)皮和淋巴細胞為陽性內(nèi)對照,EnVision法;E.腫瘤細胞MSH6表達缺失,血管內(nèi)皮和淋巴細胞為陽性內(nèi)對照,EnVision法;F.腫瘤細胞核表達PMS2,EnVision法 圖4 例2的尿路上皮癌HE形態(tài)和MMR免疫組化染色：A. HE示尿路上皮癌(WHO低級別);B.間質(zhì)可見灶性壞死和鈣化;C.腫瘤細胞核表達MLH1,EnVision法;D.腫瘤細胞MSH2表達缺失,血管內(nèi)皮和淋巴細胞為陽性內(nèi)對照,EnVision法;E.腫瘤細胞MSH6表達缺失,血管內(nèi)皮和淋巴細胞為陽性內(nèi)對照,EnVision法;F.腫瘤細胞核表達PMS2,EnVision法

3 討論

DNA損傷修復相關(guān)基因異常是遺傳性前列腺癌發(fā)生的重要誘因之一[9-12]。多數(shù)DNA損傷可通過同源重組和MMR通路得到糾正。其中,MMR機制能修復大部分DNA復制過程中的堿基錯配,MMR基因的正常功能保證了DNA復制的高度保真[13]。MMR系統(tǒng)由一系列特異性修復DNA錯配的修復蛋白組成,包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等家族成員[14]。dMMR是指參與MMR途徑的修復基因發(fā)生突變導致MMR功能下降或缺失,使腫瘤細胞獲得微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)表型,這是多種腫瘤發(fā)展的重要機制,最具代表性的是結(jié)直腸癌和子宮內(nèi)膜癌。MMR基因(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)的胚系致病突變與Lynch綜合征相關(guān),此類患者易患結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌等[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)1例罕見的表現(xiàn)為尿路上皮癌和前列腺癌的MSH2胚系致病突變患者。

Barrow等[18]的研究發(fā)現(xiàn)MMR基因胚系致病突變可使男性患前列腺癌的風險增加2～10倍。在晚期前列腺癌中,MMR基因胚系突變率為2%～5%[1,19]。本組病例中,6.4%(16/249)的病例檢出MMR基因突變,其中3.2%為胚系突變,僅1.2%為MSH2或MSH6的胚系致病突變。經(jīng)隨訪,本組病例MMR基因胚系突變患者及其直系家屬均無結(jié)直腸癌病史,并不屬于Lynch綜合征患者。有研究顯示,MMR基因突變的前列腺癌可能具有某些侵襲性的臨床特征,如較高的Gleason評分、淋巴血管侵犯或較晚的臨床分期[20],本研究結(jié)果也支持該結(jié)論。鑒于PD-1抑制劑能有效治療dMMR/MSI-H的相關(guān)實體腫瘤[21],雖然dMMR在前列腺癌中很少見,其檢測結(jié)果也具有較好的臨床指導價值[5]。

臨床檢測MSI主要通過PCR和免疫組化兩種方法。MSI-PCR用于檢測微衛(wèi)星重復序列的不穩(wěn)定性,而免疫組化用于檢測一種或多種MMR蛋白表達缺失[22-23]。由于免疫組化成本低、檢測方便快捷,且與MSI-PCR檢測具有相似的敏感性和較高的一致性[24],因此實際工作中通常由病理醫(yī)師通過免疫組化評估MMR蛋白表達情況作為檢測dMMR的初篩手段。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是參與MMR系統(tǒng)的主要蛋白,它們形成MLH1/PMS2(MutLα)和MSH2/MSH6(MutSα)的異二聚體發(fā)揮功能[25]。通過免疫組化檢測到相應的蛋白表達缺失可以準確地預測發(fā)生突變或失活的MMR基因。

前列腺癌中MMR的致病突變具有嚴格的判讀標準：只有蛋白質(zhì)截斷突變(移碼、錯義突變或剪接變異)以及基因組缺失或結(jié)構(gòu)重排被認為是有害突變[3]。關(guān)于前列腺癌中MMR基因突變與蛋白表達缺失關(guān)系的研究較少,Antonarakis等[3]的回顧性研究顯示,13例有MMR基因致病突變的前列腺癌中僅8例檢出MMR蛋白缺失或MSI,表明并非所有MMR基因致病突變都會導致MMR蛋白缺失或MSI。本研究也顯示,8例MMR致病突變的前列腺癌中,4例檢測出對應的MSH2和MSH6蛋白表達缺失;另外4例中有2例為外院會診病例無法獲取石蠟組織,1例MLH3致病突變的病例(例8)未檢出上述四項MMR蛋白缺失,還有1例MSH2致病突變(例3)病例也未檢出MMR蛋白表達缺失,MSI-PCR檢測結(jié)果顯示該例為微衛(wèi)星穩(wěn)定型,與免疫組化結(jié)果一致。8例MMR臨床意義不明變異患者中,1例檢出MSH2和MSH6蛋白表達缺失,且MSI-NGS檢測證實此病例為MSI-H。這些數(shù)據(jù)表明,前列腺癌中MMR基因突變與MMR蛋白表達不完全匹配,其中MMR致病突變與蛋白表達缺失的符合率較高,MMR臨床意義不明變異病例與蛋白表達缺失的符合率較低。可能是由于部分病例MMR基因突變確實不影響功能,而保留抗原表達。也可能因為MMR基因非同義突變有時會損傷MMR功能,但卻保留其抗原性,免疫組化檢測無蛋白缺失。另外,MMR通路上的其它基因異常(如MLH3致病突變)也會造成dMMR,但常規(guī)免疫組化只檢測常見的4個MMR蛋白,可能會漏掉其他基因突變所致的dMMR。此外,并非所有失活的MMR基因改變(尤其是結(jié)構(gòu)重排)都可以通過靶向外顯子測序進行檢測[26]。

在前列腺癌的MSI檢測中,傳統(tǒng)的MSI-PCR檢測靈敏度為72.4%,敏感性略顯不足。擴展的18標記微衛(wèi)星(MSI plus)和大panel NGS檢測靈敏度分別為96.6%和93.1%[27]。相較于大panel NGS檢測,MSI plus耗時更短,使用的材料更少,且成本更低,所以MSI plus或許可作為前列腺癌一線的MSI篩查方法[27-28]。但是由于靶向測序可能無法檢測到MMR基因中的失活重排,當基于高突變負荷或MSI而懷疑存在dMMR時,應同時行免疫組化進行驗證[28]。

綜上所述,前列腺癌的dMMR主要由于MSH2和MSH6致病突變導致蛋白功能缺陷,多見于Gleason高分級、臨床高分期和CRPC,常伴有導管內(nèi)癌形態(tài)。前列腺癌的MMR基因突變與蛋白表達缺失不完全匹配,因此單純使用免疫組化進行篩查可能會漏掉部分MMR缺陷的患者,需結(jié)合患者實際情況選擇檢測方法。