SEPT9基因甲基化水平在膀胱尿路上皮病變鑒別診斷中的應用

王更芳,周曉莉,郭 媛,饒 秋

尿路上皮病變的組織學形態具有多樣性,不同組織學分型對應的臨床結果和生物學行為不同,導致后續的治療和預后存在差異[1-3]。尿路上皮病變的診斷主要依靠組織學檢查,然而有時良、惡性病變在形態上存在重疊,鑒別診斷困難。免疫組化在輔助鑒別診斷方面具有局限性[4]。膀胱鏡活檢組織病理檢查是診斷的金標準,然而,診斷的準確性取決于膀胱鏡醫師和病理醫師的個人經驗,由于取樣誤差,不能排除假陰性的可能。因此,發掘較為客觀、敏感、特異的檢測方法很有必要。DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一,與腫瘤的發生、發展密切相關[5]。DNA甲基化檢測不僅可應用于活檢、冷凍及石蠟包埋組織[6-8],也可應用于癌癥患者的外周血和其他體液,為許多包括泌尿系統惡性腫瘤患者提供了非侵入性分子篩查方法[9-10]。SEPT9屬于GTP結合蛋白,參與細胞膜運輸、胞質分裂、血管生成和細胞增殖[11]。SEPT9已被證實在結直腸癌中具有表觀遺傳修飾作用,檢測血漿中ctDNA SEPT9甲基化可用于早期篩查[12]。有研究發現,尿液中的SEPT9甲基化檢測可作為監測膀胱癌很有前途的標志物[10]。本研究通過對160例尿路上皮病變石蠟組織進行SEPT9甲基化檢測,探討SEPT9甲基化檢測在尿路上皮良、惡性病變中的鑒別診斷意義,嘗試通過聯合使用SEPT9甲基化檢測降低膀胱鏡活檢組織的假陰性率。

1 材料與方法

1.1 組織樣本選取收集2014年1月～2023年12月常州市第二人民醫院膀胱鏡活檢、電切、手術切除的經明確病理診斷的非浸潤性尿路上皮病變160例,由2位經驗豐富的病理診斷醫師對所有切片按WHO(2022)泌尿與男性生殖系統腫瘤分類標準重新閱片。最終診斷為扁平狀尿路上皮病變43例,其中包括尿路上皮急、慢性炎15例,不典型增生11例,異型增生10例,原位癌7例;乳頭狀尿路上皮病變41例,包括乳頭狀瘤3例、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤16例、低級別乳頭狀尿路上皮癌12例、高級別乳頭狀尿路上皮癌10例;內翻性尿路上皮病變76例,包含腺性膀胱炎21例、內翻性尿路上皮乳頭狀瘤20例、內翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤10例、低級別內翻性尿路上皮癌15例、高級別內翻性尿路上皮癌10例。另收集15對尿路上皮癌和癌旁組織進行臨床驗證。癌組織經組織病理確診,而癌旁組織則分別采集離癌組織相對較近和較遠的組織。相對較近的癌旁組織,對照HE染色刮取距離癌組織1～2 cm的正常尿路上皮細胞;相對較遠的癌旁組織,選擇離腫瘤最遠處的遠端切緣尿路上皮組織。另選12對首次膀胱鏡活檢為炎癥或良性病變、后續活檢或電切為癌的組織。對上述組織分別進行SEPT9甲基化檢測。

1.2 SEPT9 DNA甲基化檢測每個病例選取代表性石蠟包埋組織,切取5 μm厚石蠟卷。相對較近的癌旁組織,每個病例選取1個代表性蠟塊,切5 μm厚白片,撈在載玻片上,對照HE染色刮取目的區域以富集1～2 cm范圍內的正常尿路上皮細胞。相對較遠的癌旁組織,則選擇遠端切緣尿路上皮組織切5 μm厚石蠟卷。FFPE DNA提取試劑盒(購自廈門艾德生物公司)提取DNA,為確保DNA樣品的質量,使用安捷倫生物分析儀NanoDrop(賽默飛世爾科技,美國)評估DNA樣品的濃度、純度。確保濃度>10 ng/μL,純度(A260/A280比值)在1.5～2.2之間,質控合格后取100 μL總質量為200 ng的DNA,按SEPT9甲基化處理試劑盒(購自北京博爾誠科技公司)說明書進行亞硫酸鹽轉化處理,最后將DNA按比例加入相應體積的PCR反應液和PCR聚合酶,每次實驗均設陰性和陽性對照,按照說明書上機。使用ABI 7500實時熒光定量PCR儀擴增45個熱循環后讀取數據結果。當內參28≤β-ACTB≤32時,以ΔCt(ΔCtSEPT9=CtSEPT9-Ctβ-ACTB)作為循環閾值,計算SEPT9基因甲基化的相對表達量。

1.3 統計學分析采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析,繪制散點圖。分類資料分析采用χ2檢驗。對SEPT9在各類病變中的甲基化水平進行顯著性分析,以P<0.05為差異有統計學意義。ROC曲線分析計算敏感性、特異性。采用約登指數(敏感性+特異性-1)計算最佳臨界值。當約登指數取最大值0.891時,建立最佳臨界值ΔCt為5.34(P<0.000 1)。SEPT9甲基化ΔCt值≤5.34判為陽性,ΔCt值>5.34判為陰性。

2 結果

2.1 臨床病理特征扁平狀尿路上皮病變：(1)不典型增生,尿路上皮正常或輕度增厚,從基底部到表層結構清晰,極性明顯;細胞增大,胞質豐富,核大小一致;固有層有炎癥反應(圖1)。(2)尿路上皮異型增生,細胞排列輕度紊亂,核大小差異不大(圖2)。(3)尿路上皮原位癌,細胞排列紊亂,極向和黏附性消失,細胞體積增大,多形性明顯,核染色質粗糙或凝塊狀,核仁大而明顯(圖3)。乳頭狀尿路上皮病變：(1)尿路上皮乳頭狀瘤,呈外生性生長,纖維血管軸心被覆正常的尿路上皮,乳頭游離細長,無分枝或有小分支,細胞無異型,無核分裂象(圖4)。(2)低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤,與乳頭狀瘤相似,層次增厚(>10層),細胞大小一致,極性明顯,細胞無異型或輕度異型,罕見核分裂象(圖5)。(3)低級別乳頭狀尿路上皮癌,極向輕度紊亂,細胞異型性明顯,可見核分裂象(圖6)。(4)高級別乳頭狀尿路上皮癌,極性紊亂,細胞大小極不一致,核大,核仁明顯,核分裂象易見,核染色質濃縮,細胞間黏附性差(圖7)。內翻性尿路上皮病變：(1)腺性膀胱炎,表面黏膜組織正常或增厚,固有膜內可見Brunn巢,細胞無異型性,無核分裂象(圖8)。(2)內翻性尿路上皮乳頭狀瘤,固有膜內乳頭呈小梁狀生長,梁周邊上皮細胞柵欄狀排列,中央為流水樣排列,梁與梁之間相互吻合,細胞無明顯異型(圖9)。(3)內翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤,固有層內尿路上皮明顯增厚(>10層細胞)、無吻合;細胞極向明顯、輕度不典型(圖10)。(4)低級別內翻性尿路上皮癌,固有膜內見寬窄不一、不規則的乳頭狀細胞索或細胞巢,可見纖維脈管軸心;細胞輕度異型,少量核分裂象(圖11);常伴有外生乳頭狀結構。(5)高級別內翻性尿路上皮癌,尿路上皮在固有膜內呈不規則乳頭狀,乳頭相互融合,呈實體狀,表面被覆的腫瘤細胞厚薄不一;細胞大小不一、多形性、排列雜亂;細胞核大、深染,易見核分裂象(圖12),常伴有外生乳頭狀結構。

圖1 尿路上皮不典型增生：上皮細胞增厚,極性明顯,固有層炎細胞浸潤 圖2 尿路上皮異型增生：尿路上皮增厚,細胞排列輕度紊亂 圖3 尿路上皮原位癌：細胞排列紊亂,極性和黏附性消失,多形性明顯 圖4 尿路上皮乳頭狀瘤：外生性生長,纖維血管軸心被覆正常的尿路上皮,乳頭游離細長,無分枝,細胞無異型 圖5 低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤：細胞層數超過10層,大小一致,極性明顯 圖6 低級別乳頭狀尿路上皮癌：極向輕度紊亂,細胞異型性明顯 圖7 高級別乳頭狀尿路上皮癌：極性紊亂,失黏附,核分裂象易見(箭頭) 圖8 腺性膀胱炎：尿路上皮表面黏膜組織正常,固有膜內可見Brunn巢,細胞無異型性 圖9 內翻性尿路上皮乳頭狀瘤：固有膜內乳頭呈小梁狀生長,梁與梁之間相互吻合 圖10 內翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤：固有層內尿路上皮明顯增厚(>10層細胞)、無吻合。細胞大小一致、輕度不典型 圖11 低級別內翻性尿路上皮癌：固有層內見寬窄不一、不規則、無吻合的乳頭狀細胞索或細胞巢,可見纖維脈管軸心。細胞輕度異型 圖12 高級別內翻性尿路上皮癌：固有膜內乳頭相互融合,呈實體狀,細胞大小不一、多形性、核大、深染

2.2 160例尿路上皮病變組織SEPT9甲基化檢測結果43例扁平狀尿路上皮病變中,急、慢性炎性病變SEPT9甲基化檢測均為陰性,不典型增生、異型增生、原位癌SEPT9甲基化陽性率分別為9%(1/11)、100%(10/10)、100%(7/7);41例乳頭狀尿路上皮病變中,3例乳頭狀瘤SEPT9甲基化檢測均為陰性,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤、低、高級別乳頭狀尿路上皮癌SEPT9甲基化陽性率分別為100%(16/16)、92%(11/12)、100%(10/10);76例內翻性尿路上皮病變中,腺性膀胱炎、內翻性尿路上皮乳頭狀瘤、內翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤、低、高級別內翻性尿路上皮癌中SEPT9甲基化陽性率分別為10%(2/21)、5%(1/20)、100%(10/10)、93%(14/15)、100%(10/10)(表1)。良性病變與惡性病變間SEPT9基因甲基化水平差異有統計學意義(P<0.000 1,圖13)。SEPT9甲基化輔助診斷良性病變與低度惡性潛能尿路上皮腫瘤的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為100%、94%、87%和100%;SEPT9甲基化輔助診斷良性病變與惡性病變的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為98%、94%、96%和97%(表2)。

表1 不同類型尿路上皮病變中的SEPT9基因甲基化情況

表2 尿路上皮良惡性病變鑒別診斷中SEPT9甲基化檢測的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值

圖13 尿路上皮良、惡性病變中SEPT9甲基化水平：***P<0.000 1

2.3 尿路上皮癌和癌旁組織中SEPT9甲基化檢測結果15例遠端切緣組織SEPT9甲基化檢測均為陰性,15例癌組織和7例鄰近癌旁組織SEPT9甲基化檢測陽性。15例癌組織中,10例高級別乳頭狀尿路上皮癌均伴有浸潤;另5例低級別乳頭狀尿路上皮癌中有2例伴有浸潤。7例鄰近癌旁組織SEPT9甲基化陽性病例中,6例高級別乳頭狀尿路上皮癌均伴有浸潤,1例低級別乳頭狀尿路上皮癌無浸潤。8例鄰近癌旁組織SEPT9甲基化陰性病例中,4例高級別乳頭狀尿路上皮癌均伴有浸潤,4例低級別乳頭狀尿路上皮癌中2例伴有肌層浸潤,2例無浸潤。部分病例鄰近癌組織的正常尿路上皮細胞發生了DNA甲基化,提示這部分SEPT9甲基化陽性病例表觀遺傳修飾異常,與肌層浸潤無關(圖14)。

圖14 癌組織、鄰近癌旁組織、遠端切緣組織中SEPT9甲基化水平

2.4 初次活檢為炎癥、良性病變而后續活檢、電切為癌的組織SEPT9甲基化檢測結果對12例膀胱鏡活檢未取到癌細胞,而后續活檢、電切證實為尿路上皮癌的組織進行SEPT9甲基化檢測。12例首次活檢病理為炎癥或良性病變的組織中,有8例SEPT9 DNA甲基化檢測為陽性,陽性率為67%(8/12);12例再次活檢、電切病理證實為癌的組織SEPT9甲基化檢測均為陽性,陽性率100%(12/12)。提示SEPT9甲基化陽性而活檢為陰性的病例需密切隨訪,必要時再次活檢(圖15)。

3 討論

扁平狀尿路上皮病變中不典型增生、異型增生、原位癌三者的生物學行為、預后和治療方式均不同。不典型增生屬于反應性、增生性病變;異型增生屬癌前病變,進展為原位癌的可能性為20%;60%～80%的尿路上皮原位癌可能進展為浸潤性癌,并且易復發,需進行灌注治療[13]。因此明確診斷非常必要,但三者的形態學存在重疊。不典型增生,尿路上皮輕度增厚,核大小一致;異型增生,細胞極性稍紊亂,核大小差異不大。兩者界限不明顯,尤其是活檢組織、機械損傷嚴重時因組織小,細胞形態模糊,診斷重復性差。本研究中不典型增生SEPT9甲基化陽性率9%(1/11),異型增生甲基化陽性率100%(10/10),原位癌甲基化陽性率100%(7/7)。提示不典型增生與異型增生在形態學上鑒別診斷困難時,可行SEPT9甲基化檢測輔助診斷。異型增生與原位癌SPET9甲基化檢測結果均為陽性。因此,SPET9甲基化檢測在異型增生和原位癌之間不具有鑒別診斷作用。

膀胱乳頭狀尿路上皮腫瘤在膀胱活檢標本中非常常見。乳頭狀尿路上皮腫瘤分為尿路上皮乳頭狀瘤、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤、低、高級別乳頭狀尿路上皮癌。尿路上皮乳頭狀瘤屬于良性病變,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤具有一定的復發率。有研究顯示隨訪128個月,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤的復發率為20.1%,其中9%患者復發仍為低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤,9.5%患者進展為低級別乳頭狀尿路上皮癌,1.6%患者進展為高級別乳頭狀尿路上皮癌,因此此類病例需密切隨訪[14]。低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤與乳頭狀瘤在形態學上是一個連續的譜帶,并且乳頭狀瘤、不典型增生、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤可共同存在于同一病例中[15]。因此單從形態學上難以鑒別。本組中3例尿路上皮乳頭狀瘤SEPT9甲基化均為陰性,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤SEPT9甲基化陽性率為100%(16/16)。提示尿路上皮乳頭狀瘤與乳頭狀尿路上皮惡性病變的SEPT9甲基化水平存在差異,鑒于本組病例數較少,需累積病例進一步驗證。有研究表明低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤和低級別非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌形態學相似,分子遺傳學改變相同,復發和進展風險也類似[15]。本研究結果也發現,低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤、低、高級別乳頭狀尿路上皮癌中SEPT9甲基化陽性率分別為100%(16/16)、92%(11/12)、100%(10/10),這三種乳頭狀尿路上皮惡性病變之間SEPT9甲基化水平相似。

內翻性尿路上皮病變是病理診斷中的難點[16]。在大多數情況下,腺性膀胱炎在形態學上較容易診斷。然而,在尿路上皮明顯增生的病例中,腺性膀胱炎易與具有內翻性生長模式伴有腺樣結構的尿路上皮癌混淆[17]。內翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤由于細胞大小、極性一致,核分裂象罕見,與內翻性尿路上皮乳頭狀瘤形態學相似,僅在厚度上超過正常尿路上皮細胞層數,鑒別診斷困難。本研究中腺性膀胱炎、內翻性乳頭狀瘤、內翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤SEPT9甲基化陽性率分別為10%(2/21)、5%(1/20)、100%(10/10)。內翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤中SEPT9甲基化陽性率明顯高于良性病變,因此在鑒別困難時SEPT9基因甲基化水平可以作為參考。內翻性低度惡性潛能的尿路上皮腫瘤、低、高級別內翻性尿路上皮癌中SEPT9甲基化陽性率分別為100%(10/10)、93%(14/15)、100%(10/10)。在內翻性惡性病變之間SEPT9表觀遺傳學相似,SEPT9甲基化檢測無鑒別診斷作用。

本研究中SEPT9甲基化水平在良、惡性病變中差異具有統計學意義。SEPT9甲基化輔助診斷良性病變與低度惡性潛能尿路上皮腫瘤的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為100%、94%、87%和100%。SEPT9甲基化輔助診斷良性病變與惡性病變的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為98%、94%、96%和97%。提示SEPT9基因甲基化可以作為相對敏感、特異的生物標志物來區分尿路上皮良、惡性病變。有研究發現,許多形態學上表現正常的尿路上皮或良性病變存在與尿路上皮惡性病變相似的分子遺傳學改變[18]。而本文在6%(4/70)的良性病變中檢測到SEPT9甲基化陽性,其中包含1例不典型增生,1例腺性膀胱炎腸上皮化生,3年內復發2次,1例旺熾性腺性膀胱炎,1例內翻性乳頭狀瘤。本組SEPT9甲基化陽性的良性病例意義不明確,需進一步隨訪觀察。

本研究還分析了15對癌和癌旁組織中SPET9基因甲基化水平。在癌組織和部分癌旁組織中檢測到SEPT9高水平甲基化,特別是癌旁1～2 cm附近的正常尿路上皮組織,這種變化在顯微鏡下組織學上無法觀察到,但可通過甲基化特異性的PCR檢測到。有研究發現,形態正常的癌旁組織出現特征性的表觀遺傳學改變,可能是癌癥發生的早期因素[19]。Thomsen等[20]的研究顯示,CNV和DNA甲基化改變是尿路上皮癌的主要早期驅動因素。Majewski等[21]的一項研究提示,DNA甲基化的表觀遺傳改變可能導致隨后的基因組改變,DNA甲基化檢測可以識別具有表觀遺傳修飾缺陷的正常尿路上皮細胞。本研究結果顯示15例癌組織和7例鄰近癌旁組織SEPT9基因甲基化陽性,提示部分病例癌旁組織的表觀遺傳修飾異常。

膀胱鏡活檢組織病理檢查是尿路上皮腫瘤分類和診斷的金標準[22]。然而,診斷的準確性取決于膀胱鏡醫師和病理醫師的個人經驗。由于某些病灶較小或較為隱匿,以及部分病例中乳頭狀瘤、不典型增生、尿路上皮癌等組織形態共同存在,導致尿路上皮病變存在異質性。有研究表明,膀胱尿路上皮癌中活檢標本與手術標本腫瘤分級的一致性為63.9%,并且活檢組織有遺漏惡性病變的可能性[23]。另有研究證實,在肺癌穿刺組織中,DNA基因甲基化檢測可以提高肺活檢的診斷準確性,DNA甲基化檢測的優點是客觀、敏感、可允許的活檢檢測范圍廣[8]。本研究對12例膀胱鏡活檢未取到癌細胞而后續再次活檢、電切證實為癌的組織都進行了SEPT9甲基化檢測。結果顯示,12例首次活檢病理無癌細胞的組織中8例SEPT9 DNA甲基化檢測陽性,陽性率為67%(8/12);12例再次活檢病理證實為癌的組織SEPT9甲基化檢測均為陽性。提示當臨床懷疑為惡性病變而膀胱鏡活檢病理證實為炎癥或良性的病例,SEPT9甲基化檢測為陽性時,患者需密切隨訪,必要時再次行膀胱鏡檢查。

綜上,SEPT9甲基化檢測在輔助診斷尿路上皮良、惡性病變中表現出高敏感性、特異性,提示在良、惡性尿路上皮鑒別診斷方面SEPT9甲基化檢測是個良好的輔助方法;同時膀胱鏡活檢病理證實為炎癥或良性病變而SEPT9甲基化檢測為陽性的患者需密切隨訪,必要時再次行膀胱鏡活檢,聯合使用SEPT9甲基化檢測可降低膀胱鏡活檢組織的假陰性率。