尿脫落細胞FISH單染色體拷貝大量異常分析

湯永飛,何惠華,閻紅琳,劉 琳,袁靜萍,錢 紅

尿脫落細胞的熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization, FISH)已被應用于尿路上皮癌的篩查診斷,相較于傳統的尿脫落細胞學檢查,具有更高的敏感性和特異性;此外,還可用于尿路上皮癌的療效評估及復發監測。然而,由于尿路上皮癌分子改變的異質性和低級別尿路上皮癌FISH檢測的低敏感性,往往會導致一部分患者漏診。目前,尿脫落細胞FISH陽性診斷標準是計數25個形態異常細胞：≥4個細胞出現2種染色體多倍體;≥4個細胞出現1種染色體多倍體,合并p16基因>12個細胞出現純合子缺失。本文作者在工作實踐中發現5例尿脫落細胞FISH單染色體拷貝大量異常,即僅出現一種染色體單/多倍體或p16基因雜合子缺失,但這種異常細胞數量較大,這種情況應如何判讀仍存在爭議,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年1月～2022年7月武漢大學人民醫院病理科行尿脫落細胞FISH檢測的847例患者臨床病理資料。依據FISH陽性診斷標準,篩選出5例不符合陽性診斷標準、但存在單染色體拷貝大量異常(本研究單染色體拷貝大量異常界定為100個異常細胞中出現>30個單染色體拷貝異常細胞)的5例作為研究對象。另外842例中,FISH檢測結果為陽性143例,陰性690例,可疑陽性9例。

1.2 方法

1.2.1FISH檢測 患者留取晨尿和夜尿(300～500 mL)放置于尿液保存液內,2 000 r/min離心5 min棄上清(留取1～2 mL),加入PBS重懸細胞沉淀,再加入0.075 mol/L氯化鉀低滲液混勻,37 ℃水浴15 min,然后加入2 mL固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1),2 000 r/min離心10 min棄上清;加入10 mL固定液混勻后-20 ℃靜置30 min,選擇合適細胞濃度滴片。老化玻片30 min,37 ℃酶消化6 min,1%多聚甲醛固定10 min,反復沖洗、梯度乙醇脫水、自然晾干,加探針85 ℃變性5 min,37 ℃雜交過夜。洗滌后加DAPI,熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2FISH結果判讀 FISH檢測采用康錄公司的膀胱癌檢測試劑盒,探針包括Ⅰ區標記3、7染色體,對應紅色信號點、綠色信號點;Ⅱ區標記p16基因和17號染色體,對應紅色信號點、綠色信號點。每例需觀察相應區域100個核異質上皮細胞,計數所有異常信號的細胞數目,計數結果均由兩名技術人員分別完成。正常人尿路上皮細胞核為2個紅色信號點和2個綠色信號。尿路上皮細胞核出現紅色或綠色信號數>2個,則認為該信號出現了擴增,但將4倍體排除在外;尿路上皮細胞核出現紅色或綠色信號數為1個或0個,認為染色體單倍體(p16基因雜合子缺失)或p16基因純合子缺失。本研究以各單染色體拷貝異常細胞數>30個為大量異常。

1.2.3尿脫落細胞學檢測 患者留取適量晨尿樣本送我院細胞學室檢查,連續送檢3天。由至少2名高年資病理科醫師完成閱片及最終診斷。

1.2.4組織學檢查 手術切除或經內鏡留取活組織標本,由至少2名高年資病理科醫師完成閱片及最終診斷。

2 結果

2.1 臨床特征5例患者均為男性,年齡41～61歲,平均54歲。所有患者均出現無明顯誘因的無痛性肉眼血尿,時間長短不一,從數天到數月(表1)。1例患者有腰痛。2例患者尿沉渣檢測無異常。5例患者影像學(包括泌尿系超聲、CT、MRI-腎平掃+增強)均提示異常：膀胱或腎臟有占位,考慮腫瘤性病變。1例患者既往有腎盂低級別乳頭狀尿路上皮癌病史。

表1 5例尿液FISH單染色體拷貝大量異常的臨床病理資料

2.2 FISH檢測結果特點5例FISH檢測結果特點各不相同(圖1,表1)：例1顯示Ⅰ區紅色信號為3倍體,即3號染色體擴增,異常細胞數32個,其它無異常;例2顯示Ⅱ區綠色信號為3倍體,即17號染色體擴增,異常細胞數48個,其它無異常;例3顯示Ⅱ區綠色信號為5倍體,即17號染色體擴增,異常細胞數56個,其它無異常;例4顯示Ⅱ區綠色信號為單倍體,即17號染色體單倍體,異常細胞數67個,其它無異常;例5顯示Ⅱ區紅色信號為單拷貝,即p16染色體雜合子缺失,異常細胞數61個,其它無異常。

圖1 5例尿脫落細胞FISH單染色體拷貝大量異常：例1為Ⅰ區3號染色體3倍體擴增;例2為Ⅱ區17號染色體3倍體擴增;例3為Ⅱ區17號染色體5倍體擴增;例4為Ⅱ區17號染色體單倍體;例5為Ⅱ區p16基因雜合子缺失

2.3 尿脫落細胞學檢測尿液脫落細胞學檢測結果顯示：3例為癌細胞,1例為重度核異質細胞,1例為分化尚好的尿路上皮細胞及淋巴細胞(圖1,表1)。

2.4 組織學檢測結果組織學檢測結果均為低級別或高級別乳頭狀尿路上皮癌(圖1,表1),1例為肌層浸潤性,1例不能明確有無肌層浸潤,另3例為非肌層浸潤性。2例為低級別,3例為高級別;4例腫瘤位于膀胱,1例位于腎盂。

3 討論

尿路上皮癌是起源于尿路上皮的惡性腫瘤,包括腎盂癌、輸尿管癌、膀胱癌和尿道癌,以膀胱癌最常見。尿路上皮癌的細胞遺傳學和分子改變具有異質性,其染色體結構和數目的改變非常頻繁。9號染色體上的雜合性缺失(9p,51%;9q,57%;甚至高達70%)是膀胱癌早期最常見的分子遺傳學改變,可見于各階段和級別的膀胱癌中,在低級別非肌層浸潤膀胱癌中更常見。9號染色體p16基因缺失和失活,產生兩個拼接產物INK4A和ARF,通過干擾Rb蛋白和TP53基因功能誘導細胞周期阻滯[1]。另外,發現17號染色體上TP53基因突變或功能喪失更利于肌層浸潤膀胱癌的發生和發展[2]。

約30%膀胱癌出現3號染色體異常,常與其它染色體異常同時存在,包括染色體易位和數目的異常。3號染色體畸變以多倍體形式為主。本文例1表現為大量細胞的3號染色體三倍體擴增。

本文5例中有3例與17號染色體相關。目前己知17號染色體上包含兩個重要基因：抑癌基因TP53和癌基因HER2。因此,尿路上皮癌的17號染色體變異可引起TP53基因功能缺失和HER2基因擴增等表現,從而促進腫瘤的發生[3]。有報道,添加17號染色體多倍體/HER2擴增狀態能提高歐洲泌尿學協會(EAU)非肌層浸潤性膀胱癌危險分層表的預測準確性[4]。也有文獻報道傳統尿路上皮癌易發生17號染色體多倍體和p16基因缺失,而浸潤性膀胱微乳頭型尿路上皮癌更易發生p16基因的擴增[5]。另有文獻報道認為17號染色體數目異常與淺表性膀胱癌復發有關,可作為淺表性膀胱癌復發的預測指標。值得注意的是,其中6例17號染色體單倍體的患者全部復發[6]。因為17號染色體單倍體可能意味著位于17p13的重要的抑癌基因TP53存在缺失,膀胱癌復發概率高。本文例4既往有腎盂低級別乳頭狀尿路上皮癌病史,此次復發尿FISH結果僅表現為17號染色體單倍體。這提示使用尿FISH監測膀胱癌時發現大量17號染色體單倍體,應告知患者復發的可能性極大。

例5尿FISH檢測結果顯示p16基因大量細胞雜合子缺失,但目前尚不清楚丟失1個等位基因會如何影響尿路上皮癌的發生。有一種可能是：1個等位基因的丟失,與突變或高甲基化的另1個等位基因結合在一起,此時p16基因功能已完全喪失,但不能被檢測為純合子缺失。因此,p16基因大量雜合子缺失也可能是膀胱癌的指標,但這種情況并不常見[9]。

目前,尿脫落細胞FISH檢測推薦的陽性診斷標準是計數25個形態異常細胞：≥4個細胞出現2種染色體多倍體;≥4個細胞出現1種染色體多倍體,合并p16基因>12個細胞出現純合子缺失。有文獻提出下列兩種情況也應報告為陽性：同一種染色體存在2種及2種以上異常信號模式(信號點數目,如3個信號點、5個信號點都存在),且每一種異常信號模式細胞數≥4個;p16基因的雜合子缺失≥15%與3、7、17染色體中的1個染色體多倍體≥10%[8]。有實驗室自建閾值,通過計數3、7、17號染色體異常和p16基因缺失的細胞數,并計算出相應異常細胞數所占百分比,根據公式[閾值=平均值(M)+3×標準差(SD)]計算出正常人的閾值[9]。然而,對于尿脫落細胞FISH單染色體拷貝大量異常該如何處理,各文獻報道不一。有文獻建議結合細胞學進行評判[8],也有建議歸為疑似陽性[10],但大多數文獻未提及此或直接判為陰性[9,11]。

雖然目前FISH檢測的敏感性高于脫落細胞學,但對低級別尿路上皮癌的敏感性較低[12]。一項研究顯示FISH檢測對低、高級別膀胱癌的敏感性分別為82.6%和90.1%[9]。另一研究表明尿FISH檢測高級別腫瘤的敏感性為75.6%、特異性為84.8%,低級別腫瘤的敏感性為40.8%、特異性為87.8%[11]。本文5例均經組織病理證實為尿路上皮癌,雖然樣本數較少,但也提示不應忽略大量細胞FISH單染色體拷貝異常的病例。因此,將這些病例歸入可疑陽性較為合適,從而提高尿FISH檢測的敏感性,使患者獲益。在計數25個形態異形細胞后,如為可疑病例,應擴大計數至100個形態異形細胞。結合文獻[10]及本研究,對可疑陽性判讀補充如下：2～3個細胞出現≥2種染色體多倍體(4倍體除外);≥10個細胞出現3、7、17染色體中的1個染色體多倍體(4倍體除外)擴增或所有信號均為4倍體;≥30個細胞出現17號染色體單倍體缺失;≥30個細胞p16基因雜合子缺失。此時,應該建議患者進一步檢查。

綜上所述,尿FISH檢測具有易操作、無創、可靠以及較高的敏感性和特異性等優點,但尿FISH檢測低級別尿路上皮癌的敏感性較高級別腫瘤低很多。因此,在實際工作中不應忽視一些特殊的染色體異常,以提高FISH檢測的敏感性。未來隨著這些病例數的增加,可能會幫助我們對尿FISH和尿路上皮癌有新的認識,從而進一步提高尿FISH的敏感性和特異性,降低醫療成本。