HPLC法測定甲硫酸新斯的明原料藥的有關物質

＊趙立成 劉艷飛 彭飛城

（1.中南大學化學化工學院 湖南 410083 2.湖南省藥品檢驗檢測研究院 湖南 410001 3.國家藥品監督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室 湖南 410001）

甲硫酸新斯的明化學名為N,N,N-三甲基-3-[(二甲氨基)甲酰氧基]苯銨甲基硫酸鹽，是一種常用異逆性抗膽堿酯酶藥，常用于內科、婦科及五官科的各種弛緩麻痹、肌肉和神經官能癥，如重癥肌無力、競爭型肌松藥的過量中毒、陣發性室上性心動過速、手術后功能性腸脹氣及尿潴留等病的治療，也能發揮改善眼睛調節功能，減輕眼結膜充血的作用[1-3]。國內文獻報道了甲硫酸新斯的明制劑的HPLC 法測定含量的方法[4-7]，但有關物質研究測定報道很少。2020 年版《中華人民共和國藥典》（ChP 2020）[8]、USP 2022、EP 11.0 和JP 18 均有收載甲硫酸新斯的明質量標準。

僅ChP 2020 和EP 11.0 甲硫酸新斯的明質量標準中設置了有關物質項目，且二者色譜條件基本一致，但僅控制一個特定雜質。此次試驗建立了甲硫酸新斯的明原料藥有關物質的測定法，控制已知雜質個數更多，專屬性強、靈敏度高、雜質控制更全面，能更好地控制本品有關物質。

1.試驗部分

(1)試驗試劑

甲硫酸新斯的明原料藥（批號：NS0010918、NS0010219、NS0010420，生產企業提供）；甲硫酸新斯的明對照品（批號：NEWS2101，純度100%）、雜質A（批號：NSGM/AA249/3A(Hydroxy)/01，含量96.03%）、雜質B（批號：NSGM/AA249/M-1520/01，含量99.88%）、雜質C（批號：NSGM/AA249/2A/01，含量99.84%），均來自MSN Laboratoriies Private Limited；乙腈為色譜純，Honeywell。

(2)試驗儀器

分析天平（XP205），梅特勒-托利多（中國）公司；液相色譜儀（Nexera LC-40），島津公司。

(3)試驗方法

①液相色譜條件

色譜柱：Kromasil 100（250 mm×4.6 mm，5 mm）；檢測器：UV；柱溫：25.0 ℃；波長：210 nm；進樣量：20μL；流速：1.0 mL/min；流動相：以緩沖液（取85% 磷酸2.0 mL，無水1-辛烷磺酸鈉鹽3.0 g，精密稱定，用水溶解并稀釋至1000 mL，用10% 氫氧化鉀溶液調節pH 至4.3）為流動相A。以緩沖液-乙腈（30:70）為流動相B；梯度洗脫（0～2，60%A；2～10，60%A →15%A；10～15，15%A；15～15.5，15%A →60%A；15.5～22，60%A）。

②專屬性試驗

空白溶劑（稀釋劑）：水-乙腈（95:5）。

甲硫酸新斯的明對照品的貯備液：取大約15 mg甲硫酸新斯的明對照品，精密稱定之后，加入100 mL的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，使其溶解（必要時可超聲），放至室溫，并用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。

甲硫酸新斯的明對照品溶液：精密量取1 mL 配制的甲硫酸新斯的明對照品貯備液，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

雜質A 的對照品貯備液：取大約15 mg 雜質A 的對照品，精密稱定之后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，振搖使其溶解（必要時可超聲），放至室溫后，再用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。

雜質B 的對照品貯備液：取大約15 mg 雜質B 的對照品，精密稱定之后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，振搖使其溶解（必要時可超聲），放至室溫，并加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

雜質C 的對照品貯備液：取大約15 mg 雜質C 的對照品，精密稱定之后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，振搖使其溶解（必要時可超聲），放至室溫，并加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

系統適用性溶液：稱取大約15 mg 甲硫酸新斯的明對照品，精密稱定之后，加入100 mL 的棕色量瓶中，精密加入雜質B 的對照品貯備液10μL，加稀釋劑超聲溶解，然后再加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

系統適用性要求：對于系統適用性溶液的色譜圖，新斯的明的峰與雜質B 的峰之間的分離度不得小于3.0；新斯的明峰的理論塔板數應不低于3000，拖尾因子應不大于2.0。對照品溶液色譜圖中，新斯的明峰高的信噪比應不小于50。

供試品溶液：取大約15 mg 供試品，精密稱定后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，振搖使其溶解。加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

精密量取以上溶液各20μL，然后注入高效液相色譜儀，再記錄液相色譜圖。

③精密度與重復性

精密度試驗供試品：選取專屬性項下甲硫酸新斯的明對照品溶液，按方法項下的液相色譜條件進樣分析樣品，連續進樣分析6 次，并記錄其高效液相色譜圖。

重復性試驗供試品：取甲硫酸新斯的明原料藥約15 mg，精密稱定后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入稀釋劑使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻。同樣平行配制6 份。精密量取配制的溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，并記錄液相色譜圖。

④線性關系與校正因子考察

甲硫酸新斯的明對照品貯備液：取專屬性項下甲硫酸新斯的明對照品貯備液。

線性貯備液：精密量取專屬性試驗項下甲硫酸新斯的明對照品貯備液、雜質A、雜質B 及雜質C 對照品貯備液各為5 mL，置于50 mL 的量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述線性貯備液適量，加溶劑稀釋成系列標準曲線溶液。

精密量取上述線性溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，并記錄液相色譜圖。X 軸以濃度為坐標，Y 軸以各成分相對應峰面積為坐標，繪制曲線進行線性回歸。

⑤定量限與檢測限

精密量取“線性關系與校正因子考察”項下線性溶液1.3.4 進行逐級稀釋，按方法項下的色譜條件進樣分析，進樣量20μL，記錄色譜圖。

2.結果與討論

圖1 有關物質系統適用性溶液色譜圖

（1）專屬性試驗。試驗結果表明：空白溶劑不干擾本品有關物質的測定；系統適用性溶液色譜圖中甲硫酸新斯的明峰與雜質B 峰之間的分離度為11.58，甲硫酸新斯的明峰的理論塔板數為13052，甲硫酸新斯的明峰拖尾因子為1.629；甲硫酸新斯的明對照品溶液峰高的信噪比為402.96，符合系統適用性要求。該方法專屬性良好。

（2）精密度與重復性試驗。取甲硫酸新斯的明對照品溶液，以主峰面積計算精密度試驗的RSD，結果為0.44%，表明方法的精密度良好。

圖2 有關物質供試品溶液色譜圖

取甲硫酸新斯的明原料藥，按方法項下平行地制備6 份供試品溶液，再按方法項下的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以甲硫酸新斯的明為對照，乘以相對校正因子以計算各雜質的含量。從該6 份甲硫酸新斯的明原料藥中，均檢出已知雜質A，且雜質A 平均含量為0.001%（RSD=1.6%），而雜質B 與雜質C 均未檢出。其他單個雜質平均含量為0.015%（RSD=2.6%）,各雜質總和平均含量為0.024%（RSD=2.7%），方法的重復性良好。

（3）線性試驗及校正因子考察。以濃度為X 軸，相應的各成分峰面積為Y 軸繪制曲線，接著以各雜質線性方程斜率與甲硫酸新斯的明線性方程斜率的比值計算相對校正因子。試驗結果表明：甲硫酸新斯的明對照品、雜質A、雜質B 及雜質C 的峰面積分別與其濃度具有良好的線性關系。

（4）定量限與檢測限。以各成分色譜峰信噪比為3時的濃度為檢測限，以各成分色譜峰信噪比為10 時的濃度為定量限，結果見表1。

表1 甲硫酸新斯的明、雜質A、雜質B 及雜質C 的線性關系、相對校正因子、定量限及檢測限結果

3.結論

本文建立了HPLC 法測定甲硫酸新斯的明原料藥的有關物質，通過對方法專屬性、重復性、線性范圍、定量限與檢測限等質量標準方法學研究，結果表明該方法靈敏度高、專屬性強、準確度高，本文提供的方法可用于甲硫酸新斯的明的有關物質測定和質量控制。

EP 11.0 甲硫酸新斯的明標準有關物質項采用加校正因子的主成分外標法計算雜質的量，規定雜質B不得過0.01%，其他未知單雜不得過0.10%，總雜不得過0.2%。2020 年版《中國藥典》按主成分自身對照法計算雜質的量，規定雜質A（標準中命名為雜質Ⅰ）不得過1.0%，其他雜質總和不得過0.5%，限度明顯寬于EP 11.0 質量標準。

本試驗通過線性試驗及校正因子考察，得到各個已知雜質的相對校對因子，雜質A 與雜質B 采用相對保留時間定位，解決了雜質對照品較難獲得的問題。采用加校正因子的主成分外標法計算雜質的量，限度參考EP 11.0 標準，限度擬定為“雜質A 不得過0.10%，雜質B 不得過0.01%，雜質C 不得過0.10%，其他單個雜質不得過0.10%，各雜質總和不得過0.20%”，要求較現行標準更為嚴格，有助于更好地控制甲硫酸新斯的明原料質量。本研究將為提高《中國藥典》中原料藥甲硫酸新斯的明系列品種的質量標準提供重要的依據和參考，也可用于其系列品種的質量控制。