血清外泌體miRNA-21、miRNA-214聯(lián)合檢測(cè)在骨質(zhì)疏松癥診斷中的價(jià)值

祁彩虹,李 麗,廖 璞△

1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科,四川瀘州 646000;2.重慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 401147

骨質(zhì)疏松癥(OP)是因骨組織質(zhì)量和密度減少,從而導(dǎo)致骨骼脆弱易碎的一種普遍存在的骨骼疾病[1]。隨著人口老齡化進(jìn)程加劇,OP已成為全球流行病之一,其發(fā)病率僅次于心血管疾病和糖尿病,在慢性病中排名第3位。2018年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的首個(gè)我國(guó)OP流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)50歲以上人群的OP患病率為19.2%,而65歲以上人群的患病率高達(dá)32.0%[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè),到2050年我國(guó)骨質(zhì)疏松性骨折患者將達(dá)600萬(wàn)例,相應(yīng)的醫(yī)療費(fèi)用將達(dá)254億美元/年[3]。我國(guó)每年有數(shù)百萬(wàn)人因OP導(dǎo)致骨折,其中約1/5的患者因骨折并發(fā)癥而死亡,約一半的存活者會(huì)面臨不同程度的殘疾,這給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[2,4]。因此,為了提高OP患者生活質(zhì)量,早期診斷必不可少。

目前,OP的診斷常通過(guò)測(cè)量骨密度并結(jié)合患者的家族史和臨床癥狀來(lái)進(jìn)行綜合評(píng)估[5-6]。外泌體微小RNA(miRNA)是一類(lèi)具有基因表達(dá)調(diào)控功能的小分子RNA,通過(guò)調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程,在靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[7]。外泌體miRNAs可以通過(guò)調(diào)節(jié)OP患者骨細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程來(lái)調(diào)控骨形成與骨吸收的平衡,從而影響骨組織的代謝和再生。研究發(fā)現(xiàn),與OP相關(guān)的外泌體miRNAs在血液、尿液和骨髓液等體液中的表達(dá)水平發(fā)生了變化,表明其在OP的早期診斷、治療監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷中可能作為潛在的生物標(biāo)志物[8-9]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究強(qiáng)調(diào)了外泌體miRNAs可能成為OP的生物學(xué)標(biāo)志物,在OP患者早期診斷中發(fā)揮重要作用[10-12]。本研究從OP患者的血清中提取外泌體,檢測(cè)其中miRNA-21和miRNA-214的表達(dá)水平,進(jìn)一步分析二者在OP臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值,為OP的早期診斷提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年1月至2023年12月重慶市人民醫(yī)院收治的OP患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)骨密度測(cè)量結(jié)果顯示骨量減少;(2)具有特定類(lèi)型的骨折史;(3)常出現(xiàn)骨痛、身高減少和脊柱彎曲等癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)可能導(dǎo)致OP樣表現(xiàn)的其他骨病,如骨腫瘤、骨髓炎等;(2)使用可能導(dǎo)致OP的激素類(lèi)藥物;(3)合并其他可能與OP有關(guān)的疾病,如甲狀旁腺功能亢進(jìn)等。共納入OP組77例,其中男35例、女42例,平均年齡(71.08±10.54)歲。另選取同期在重慶市人民醫(yī)院體檢中心體檢的81例健康者為對(duì)照組,其中男38例、女43例,平均年齡(69.96±8.77)歲。兩組性別、年齡比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象均知曉本研究,并簽署知情同意書(shū)。本研究獲重慶市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：S2020-200-01;S2021-065-01)。

1.2儀器與試劑 外泌體提取試劑盒由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供;miRNA提取試劑盒由杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司提供;miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供;BlasTaq 2×qPCR MasterMix試劑由Applied Biological Materials提供;伯樂(lè)CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀;JEM-1200EX透射電子顯微鏡(BTEM技術(shù))購(gòu)自日本電子株式會(huì)社;PMX110納米顆粒跟蹤分析儀(NTA技術(shù))購(gòu)自德國(guó)Particle Metrix公司。

1.3方法

1.3.1血清外泌體提取及鑒定 收集所有研究對(duì)象的血清,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟提取血清外泌體,將得到的納米級(jí)囊泡復(fù)溶在300 μL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH值7.4)中,保存于-80 ℃環(huán)境中。所有樣品的處理和離心都在冰上進(jìn)行。采用生物透射電鏡和NTA技術(shù)表征外泌體的形態(tài)和大小[8,10],采用蛋白質(zhì)印跡法(WB)檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63的表達(dá)。

1.3.2血清外泌體miRNA-21和miRNA-214提取及檢測(cè) 按miRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū),從外泌體中提取miRNA,然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)。用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。隨后用BlasTaq 2× qPCR MasterMix試劑對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性,95 ℃ 1 s變性,60 ℃ 10 s退火延伸,40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)樣品重復(fù)3次。用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA-21和miRNA-214的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1血清外泌體的鑒定 采用BTEM和NTA技術(shù)表征OP患者血清外泌體。如圖1A和圖1B所示,外泌體的大小不一,呈現(xiàn)出類(lèi)似圓形或橢圓形的雙層脂質(zhì)膜囊泡,直徑為25～265 nm,中位粒徑為105 nm。采用WB鑒定血清外泌體特異性蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,血清外泌體中CD63標(biāo)志蛋白呈高表達(dá)(圖1C)。

注：A為BTEM表征外泌體的形態(tài);B為NTA技術(shù)追蹤外泌體大小;C為WB鑒別外泌體特征蛋白CD63的表達(dá)。

2.2兩組血清外泌體miRNA-21、miRNA-214表達(dá)水平比較 OP組血清外泌體miRNA-21和miRNA-214相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清外泌體miRNA-21、miRNA-214表達(dá)水平比較[M(P25,P75)]

2.3miRNA-21、miRNA-214影響OP發(fā)生的Logistic回歸分析 以是否患OP為因變量(賦值：是=1,否=0),以miRNA-21、miRNA-214的相對(duì)表達(dá)水平為自變量(賦值：均為原值輸入),進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示,miRNA-21、miRNA-214相對(duì)表達(dá)水平升高是導(dǎo)致OP發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miRNA-21、miRNA-214影響OP發(fā)生的Logistic回歸分析

2.4血清外泌體miRNA-21、miRNA-214單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OP的診斷效能分析 根據(jù)多因素Logistic回歸分析得到血清外泌體miRNA-21、miRNA-214聯(lián)合檢測(cè)診斷模型,即Y=-3.326+0.624×XmiRNA-21+ 0.756×XmiRNA-214。以對(duì)照組為陰性樣本,OP患者為陽(yáng)性樣本,繪制ROC曲線(xiàn)。結(jié)果顯示,血清外泌體miRNA-21、miRNA-214聯(lián)合檢測(cè)診斷OP的靈敏度為90.9%,特異度為84.0%,AUC為0.919,高于miRNA-21、miRNA-214單獨(dú)檢測(cè)的AUC(0.853、0.811),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.079,P<0.05;Z=-3.518,P<0.001)。見(jiàn)表3、圖2。

表3 血清外泌體miRNA-21、miRNA-214單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷OP的效能分析

圖2 血清外泌體miRNA-21、miRNA-214單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷OP的ROC曲線(xiàn)

3 討 論

OP在全球范圍內(nèi)分布廣泛,其發(fā)病率隨著人口老齡化趨勢(shì)的加劇而上升。流行病學(xué)研究表明,OP對(duì)中老年人(特別是女性)的身體健康影響較大。女性絕經(jīng)期后由于雌激素水平降低,患OP的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[1,13]。此外,一些慢性疾病、遺傳因素、不良生活方式和營(yíng)養(yǎng)不良也與OP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。OP使骨骼(特別是脊椎、髖部和腕部)易發(fā)生骨折,不僅會(huì)導(dǎo)致疼痛和功能障礙,還可能引發(fā)殘疾等嚴(yán)重的健康問(wèn)題,導(dǎo)致生活質(zhì)量下降[2-3]。總體而言,對(duì)患者的健康和生活質(zhì)量造成重大影響的OP是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。預(yù)防、早期診斷和綜合治療是控制OP的關(guān)鍵策略,可以減少骨折風(fēng)險(xiǎn)并提高患者的生活質(zhì)量[4]。

目前,OP的診斷多以影像學(xué)檢查并輔以實(shí)驗(yàn)室檢查而確診,然而,實(shí)驗(yàn)室診斷缺乏早期診斷指標(biāo),且特異度不高、靈敏度也較低,影像學(xué)診斷在出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變時(shí)才能發(fā)現(xiàn),這些改變往往不可逆,不利于患者的預(yù)后[14]。

miRNAs是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子(長(zhǎng)度通常為19～25個(gè)核苷酸)單鏈RNA,廣泛存在于真核生物中,高度保守,通過(guò)與靶基因mRNA的互補(bǔ)序列(3′非翻譯區(qū)、5′非翻譯區(qū)、編碼區(qū))結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[15]。miRNAs參與疾病的起源和發(fā)展,并具有病理特異性,因此可作為疾病早期檢測(cè)的生物標(biāo)志物[16]。

外泌體是一種細(xì)胞主動(dòng)分泌的納米囊泡(直徑30～150 nm),具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu),內(nèi)含多種核苷酸(如DNA、miRNA、LncRNA等)、特異性蛋白和脂類(lèi)等遺傳物質(zhì)[17]。研究表明,外泌體可作為遺傳信息的傳遞者參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展,通過(guò)攜帶和傳遞信號(hào)分子到細(xì)胞,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的病理和生理狀態(tài)[17-18]。在許多生物過(guò)程中,細(xì)胞將miRNAs包裹在外泌體內(nèi),通過(guò)外泌體釋放到外周循環(huán),從而靶向調(diào)控受體細(xì)胞中靶mRNA的翻譯。研究發(fā)現(xiàn),外泌體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)可使其包裹的物質(zhì)免受RNA酶及蛋白酶等的降解[19-20]。循環(huán)miRNAs被外泌體包裹后具有高度生物學(xué)穩(wěn)定性,如血漿外泌體miRNA在4 ℃儲(chǔ)存96 h或在-70 ℃下儲(chǔ)存4周后,其表達(dá)譜仍無(wú)明顯變化,且在-20 ℃以下保存5年仍能保持其數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定,甚至在經(jīng)過(guò)2次反復(fù)凍融后仍未受到明顯影響[21]。因此,除生物學(xué)特性及靶向特異性外,外泌體的膜結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)miRNAs的穩(wěn)定性,提高其作為OP早期診斷生物標(biāo)志物的能力。

研究發(fā)現(xiàn),在OP的發(fā)病機(jī)制中,外泌體miRNAs發(fā)揮了重要作用。SUN等[10]研究發(fā)現(xiàn),破骨細(xì)胞能夠分泌非常豐富的外泌體源性miRNAs,并驗(yàn)證了其在血液循環(huán)中不僅可以作為骨量丟失的生物標(biāo)志物,還可選擇性地調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能。LI等[8]研究發(fā)現(xiàn),血清外泌體miR-214-3p水平升高與老年女性的骨折及去卵巢小鼠的骨形成減少密切相關(guān),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化可被破骨細(xì)胞分泌的含有miR-214的外泌體囊泡抑制。MENG等[12]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-21通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路和基因表達(dá),參與調(diào)節(jié)骨細(xì)胞增殖、分化和骨重建等過(guò)程,可抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成,從而對(duì)OP的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響。miRNA-21和miRNA-214的異常表達(dá)可能導(dǎo)致骨細(xì)胞功能紊亂,破壞骨吸收與骨重建的平衡,從而導(dǎo)致OP的發(fā)生。說(shuō)明骨組織細(xì)胞來(lái)源的外泌體miRNA-21和miRNA-214可能作為早期診斷的生物標(biāo)志物,在OP的早期篩查及診療過(guò)程中蘊(yùn)含巨大潛力和價(jià)值,臨床應(yīng)用前景廣闊。

本研究結(jié)果表明,OP組血清外泌體miRNA-21和miRNA-214表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。除此之外,本研究還評(píng)估了miRNA-21和miRNA-214檢測(cè)在OP診斷中的應(yīng)用價(jià)值,結(jié)果顯示,血清外泌體miRNA-21、miRNA-214聯(lián)合檢測(cè)診斷OP的靈敏度(90.9%)和特異度(84.0%)均較高,且二者聯(lián)合診斷OP的AUC為0.919,高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)的AUC。表明血清外泌體miRNA-21和miRNA-214聯(lián)合檢測(cè)對(duì)OP患者和健康人群的識(shí)別更準(zhǔn)確,可提高OP早期發(fā)現(xiàn)率。

綜上所述,血清外泌體miRNA-21和miRNA-214表達(dá)水平升高是導(dǎo)致OP發(fā)生的危險(xiǎn)因素,miRNA-21和miRNA-214單獨(dú)檢測(cè)對(duì)OP的診斷具有一定的價(jià)值,且二者聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷的精確性。通過(guò)外泌體來(lái)源的miRNAs診斷OP,具有準(zhǔn)確、快捷和無(wú)創(chuàng)等特點(diǎn)。但本研究樣本量較少,可能會(huì)造成某種程度上研究結(jié)果的偏倚,因此存在一定的局限性。在本研究基礎(chǔ)上,未來(lái)需要加大樣本量,并開(kāi)展多中心前瞻性研究,進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論,從而為OP患者的早期診斷提供理論基礎(chǔ)。