PKM2對黑色素瘤細胞侵襲與遷移及巨噬細胞M2轉變的影響

任曉朦,劉清霞,趙培慶

1.濱州醫學院第一臨床醫學院,山東煙臺 264003;2.山東省淄博市中心血站中心實驗室,山東淄博 255033;3.山東省淄博市張店區房鎮鎮衛生院婦幼保健科,山東淄博 255030;4.山東省淄博市中心醫院轉化醫學中心,山東淄博 255036

黑色素瘤特別是晚期患者病死率極高,目前仍是世界范圍內最難治的惡性腫瘤之一[1]。乳酸是糖酵解過程中的主要代謝產物,有研究表明黑色素瘤細胞可通過攝取乳酸來抵御氧化應激壓力,從而獲得更強的轉移能力[2]。丙酮酸激酶M2(PKM2)作為糖酵解途徑最主要限速酶之一,通過影響腫瘤微環境在多種類型腫瘤中促進疾病進展[3]。然而,PKM2在黑色素瘤患者轉移及預后中的相關研究尚不清楚。基于以上理論基礎,本研究旨在探索PKM2影響黑色素瘤轉移的潛在機制,進一步闡明PKM2如何影響腫瘤微環境(TME)中巨噬細胞M1/M2轉變過程。現報道如下。

1 材料與方法

1.1基于TCGA數據庫分析黑色素瘤中PKM2表達水平及與生存期的關系 利用來源于TCGA數據庫[GEPIA 2 (cancer-pku.cn)]的461例黑色素瘤患者及558例健康研究對象分析PKM2在黑色素瘤組織及正常組織中的表達差異、PKM2與生存期相關性及PKM2在不同臨床分期黑色素瘤中的表達情況。其中80例有隨訪生存期數據的黑色素瘤患者用于比較PKM2基因高表達組(20例)與PKM2基因低/中表達組(60例)的總體生存時間;79例有臨床分期數據的黑色素瘤患者用于比較PKM2基因在不同臨床分期患者中的表達差異,其中臨床分期包括2期39例,3期36例,4期4例。

1.2細胞來源、細胞培養與載體構建 人A375黑色素瘤細胞系和小鼠RAW264.7巨噬細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所,置于37℃、5% CO2環境下含10%胎牛血清 (FBS,Gibco) 的改良Eagle’s培養基 (DMEM、Gibco) 進行培養。課題組利用基因敲低技術對PKM2表達水平進行敲低并驗證敲低效率,PKM2過表達(過表達組,n=3)及基因敲低慢病毒載體(敲低組,n=3)及其對照慢病毒載體(對照組)均由上海GeneChem公司構建,病毒加入量按照公司提供的感染復數值進行轉染。

1.3黑色素瘤細胞胞外酸化率(ECAR)及乳酸水平檢測 ECAR采用美國Agilent公司的SeaHorse XF細胞外通量分析儀進行測定。分析前需在特定的時間點處理細胞：葡萄糖 (10 mmol/L),然后是寡霉素 (1 μmol/L)和2-DG (50 mmol/L)。最后用SeaHorse XF軟件測量ECAR值。其中加入葡萄糖之前測定的ECAR值為“基礎期”,加入葡萄糖之后與加寡霉素之前測定的ECAR值為“糖酵解能力”,加入寡霉素之后與加2-DG之前測定的ECAR值為“糖酵解容量”,加入2-DG之后測定的ECAR值為“恢復期”。采用乳酸測定試劑盒(南京建成科技有限公司,A019-2-1)檢測干擾PKM2后細胞乳酸產量。

1.4定量聚合酶鏈反應(qPCR) qPCR檢測巨噬細胞M1/M2相關指標水平,其中代表M1極化的指標包括腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶 (iNOS),代表M2極化的指標包括甘露糖受體 (CD206)、血紅蛋白清道夫受體 (CD163)。操作按廠家說明書,用Prime Scrip RT試劑盒 (Takara) 提取總信使RNA(mRNAs),合成互補DNA (cDNA)。qPCR反應在ABI PRISM7500儀器 (ThermoFisher Scientific) 上進行測量,qPCR采用的Real SYBR Mix 由青島擎科生物科技股份有限公司生產。qPCR所用引物序列見表1,反應條件如下：94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s,40個循環,最后72 ℃延伸2 min。

表1 引物序列表

1.5蛋白免疫印跡法 首先用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白產物,并將其轉移到PVDF膜 (Bio-Rad) 上。然后用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h,并在4 ℃下與PKM2一抗 (abcam,ab85555) 孵育過夜;洗膜3次后于室溫下與二抗共同孵育2 h,最后使用Tanon 5200凝膠成像儀進行顯影,對敲低PKM2后的表達量進行檢測。

1.6免疫組化染色 黑色素瘤組織收集淄博市中心醫院2010年5月至今經病理診斷確診為黑色素瘤患者,排除患者患有其他類型腫瘤、代謝性疾病、炎癥性疾病等可能影響結果的疾病,共計20例,其中轉移組7例(已發生淋巴結轉移或遠端轉移的黑色素瘤患者),非轉移組13例(未發生淋巴結轉移的黑色素瘤患者)。轉移組男4例、女3例,平均年齡(64.71±12.26)歲,非轉移組男7例、女6例,平均(59.62±11.80)歲。兩組性別、年齡比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。免疫組化結果采用半定量評分標準對標本組織中的PKM2表達量進行分析,染色指數值(0～12)定義為染色強度與陽性區域得分的乘積。對染色強度評分如下：0分=無染色;1分=弱染色;2分=中等染色;3分=強染色。陽性區域定義如下：<5%染色=0分;5%～25%染色=1分;>25%～50%染色=2分;>50%～75%染色=3分;>75%染色=4分[4]。所有研究對象均自愿參與本研究,并簽署知情同意書,本研究經淄博市中心醫院醫學倫理委員會審核通過(批號：2020-1-045)。

1.7流式細胞術 CD206流式熒光抗體購自BD公司,抗體與細胞室溫孵育30 min后,用PBS洗滌3次,然后用BD FACS流式細胞儀 (Aria Ⅱ,USA) 對CD206的表達水平進行分析。

1.8細胞劃痕實驗及Transwell實驗 敲低黑色素瘤細胞中PKM2表達后,進行腫瘤細胞遷移實驗。黑色素瘤細胞系A375種板于六孔板中,分為對照組、PKM2敲低組、PKM2敲低+乳酸組,待細胞貼壁后用200 μL槍頭于孔中間劃痕,然后細胞進行換液以去除漂浮細胞,顯微鏡下拍照并測量原始劃痕寬度;24 h后置于顯微鏡下測量劃痕愈合寬度,與原始劃痕寬度比較,得到愈合比例。黑色素瘤細胞系A375接種于Transwell小室中,分為對照組、PKM2敲低組、PKM2敲低+乳酸組,血清濃度為1%,下室血清濃度為10%,形成濃度梯度;24 h后取出Transwell小室,用棉棒小心擦去小室內殘留細胞,小室經過固定、結晶紫染色、沖洗后,置于顯微鏡下拍照并計數。

2 結 果

2.1PKM2在黑色素瘤組織中表達情況 TCGA數據庫顯示,與正常組織(8.66±1.19)相比,PKM2 mRNA水平在黑色素瘤組織中(10.97±1.78)明顯升高(P<0.05),且PKM2高表達水平患者的生存率低于低/中表達患者(P=0.001 8),見圖1A、1B;PKM2在臨床2期黑色素瘤患者中的表達水平為4.63±1.78,在3期黑色素瘤患者中的表達水平為6.25±1.55,在4期黑色素瘤患者中的表達水平為8.71±0.13,不同臨床分期黑色素瘤患者的PKM2表達水平比較,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1C。免疫組化染色結果發現,轉移組PKM2表達評分為(8.00±2.52)分,明顯高于非轉移組的(4.54±1.32)分,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1D、1E。

注：*P<0.05;A為TCGA數據庫中PKM2在黑色素瘤組織中的表達;B為TCGA數據庫中不同PKM2表達患者生存曲線;C為TCGA數據庫中PKM2在不同臨床分期黑色素瘤晚期患者中的表達;D為PKM2在未發生轉移的黑色素瘤患者中的免疫組化染色情況(×200);E為PKM2在發生轉移的黑色素瘤患者中的免疫組化染色情況(×200)。

2.2敲低PKM2后黑色素瘤細胞糖酵解水平變化 敲低PKM2表達水平后,PKM2 mRNA水平下降了61%(對照組相對表達量為1.0,PKM2敲低組相對表達量為0.39),蛋白水平也明顯下調,見圖2;敲低組黑色素瘤細胞糖酵解能力和糖酵解容量均低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。另外,PKM2敲低組乳酸水平[(4.93±0.87) mmol/L]明顯低于對照組[(12.33±1.55) mmol/L],差異有統計學意義(t=40.99,P<0.001)。

圖2 敲低PKM2后蛋白表達水平變化

表2 敲低PKM2后黑色素瘤細胞糖酵解水平的變化

2.3敲低PKM2后黑色素瘤細胞侵襲與遷移能力的變化 細胞劃痕實驗顯示,對照組愈合率為25%,PKM2敲低組為75%,PKM2敲低組加入乳酸后為50%;Transwell實驗結果顯示,對照組穿過細胞數為(58±7.21)個/LP(低倍視野),PKM2敲低組細胞數為(26±3.21)個/LP,PKM2敲低組加入乳酸后細胞數為(50±4.58)個/LP。細胞遷移實驗結果顯示,敲低PKM2表達后,黑色素瘤細胞的遷移和侵襲能力均明顯降低,加入乳酸后,可部分逆轉該現象,見圖3。

注：A為敲低PKM2后黑色素瘤細胞遷移能力的變化;B為敲低PKM2后黑色素瘤細胞侵襲能力的變化。

2.4qPCR檢測巨噬細胞M1/M2相關指標水平情況 qPCR檢測結果顯示,過表達組TNF-α和iNOS水平低于對照組,而CD206和CD163水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3;敲低組TNF-α和iNOS水平高于對照組,而CD206和CD163水平低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表4。流式細胞實驗結果顯示,敲低PKM2后巨噬細胞M2標志物CD206表達受到抑制,對照組平均熒光強度(MFI)為32.5±4.27,敲低組MFI值24.6±2.17;過表達PKM2后則M2標志物CD206表達明顯增多,對照組MFI值為23.6±1.64,過表達組MFI值為48.9±3.05。

表3 過表達組與對照組巨噬細胞M1/M2相關指標水平比較

表4 敲低組和對照組巨噬細胞M1/M2相關指標水平比較

3 討 論

糖酵解是腫瘤生長和轉移的主要能量來源[5]。腫瘤代謝從線粒體氧化磷酸化到有氧糖酵解的轉變被稱為瓦氏效應,由于有氧糖酵解導致的腫瘤進展通常與癌基因的激活或腫瘤抑制基因的喪失有關。因此,抑制糖酵解是腫瘤治療的重要策略之一[6]。PKM2是一種糖酵解限速酶,有報道稱其在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結直腸癌和肝癌中過表達并促進腫瘤進展[7-9]。然而PKM2在黑色素瘤中的表達情況及相關生物學機制尚不清楚。筆者利用TCGA數據庫發現,與正常組織相比,PKM2 mRNA水平在黑色素瘤組織中表達明顯升高(P<0.05),且PKM2高表達水平患者的生存率低于低/中表達患者(P=0.001 8);對黑色素瘤患者分組后分析發現,PKM2在臨床中晚期黑色素瘤患者中的表達水高于早期患者,差異有統計學意義(P<0.05)。免疫組化染色結果發現,轉移組PKM2表達評分為(8.00±2.52)分,明顯高于非轉移組的(4.54±3.55)分(P<0.05)。以上結果表達PKM2可能在黑色素瘤轉移中發揮重要的促進作用。

2022年,HANAHAN[10]的一項研究指出腫瘤的十二大特征,其中能量代謝重編程是腫瘤細胞主要特征之一,表明近年來腫瘤代謝正在成為腫瘤診療的重要靶點[11]。腫瘤細胞必須改變其能量代謝途徑,從而實現持續的細胞增殖能力、存活率,以及致命的遠端轉移能力。代謝重編程包括腫瘤細胞增加對葡萄糖的吸收率,這是提供給腫瘤細胞所需能量的主要途徑,這些大分子物質包括脂質、碳水化合物、氨基酸和核酸[12]。不過即使在充足的氧氣環境中糖酵解也被認為是腫瘤細胞利用能量的主要方式,因此近年來糖酵解增強也被認為是癌癥細胞的重要特征,它通過影響細胞代謝正向調控腫瘤的發生與發展[13]。與正常細胞不同,腫瘤細胞優先傾向于將葡萄糖轉化為丙酮酸鹽,然后通過乳酸脫氫酶(LDH)將其代謝為乳酸。然而,在常氧條件下,丙酮酸通過丙酮酸脫氫酶(PDH)轉化為乙酰輔酶A。最初的研究認為線粒體功能障礙導致氧化磷酸化途徑由有氧糖酵解替代,但進一步的研究表明腫瘤細胞的線粒體功能和氧化磷酸化(OXPHOS)途徑與正常細胞不同,腫瘤細胞維持高水平的乙二醇分解率和氧化磷酸化能力以滿足腫瘤細胞的高能量需求。在腫瘤細胞中,糖酵解逐漸增加,而OXPHOS逐漸減少,隨著糖酵解的增加,乳酸在腫瘤細胞周圍增多,從而形成特定的腫瘤酸性微環境。乳酸,作為一種代謝調節因子,通過增加酸度和血管生成、減少血管通透性和改變免疫反應來促進癌癥轉移[14]。基于上述理論以及PKM2在黑色素瘤中高表達現象,筆者檢測了敲低PKM2后黑色素瘤細胞糖酵解相關指標,敲低PKM2表達水平后,PKM2 mRNA水平下降了61%(對照組相對表達量為1.0,PKM2敲低組相對表達量為0.39),蛋白水平也明顯下調,且敲低組黑色素瘤細胞糖酵解能力和糖酵解容量均低于對照組(P<0.05),另外,敲低組乳酸水平明顯低于對照組,差異有統計學意義(t=40.99,P<0.001),與相關研究結果一致。上述結果提示PKM2促進了黑色素瘤中乳酸的分泌水平。有研究發現乳酸可促進黑色素瘤細胞侵襲與遷移能力[15],因此本研究敲低黑色素瘤細胞中PKM2表達后,進行腫瘤細胞遷移實驗,結果發現敲低PKM2表達后,黑色素瘤細胞的遷移和侵襲能力均明顯降低,加入乳酸后,可部分逆轉該現象,提示PKM2以乳酸依賴方式促進黑色素瘤細胞侵襲與遷移能力。

LIN等[16]研究發現腫瘤微環境中乳酸水平可促進巨噬細胞M1/M2轉變。TME涉及腫瘤基質、增殖的腫瘤細胞、炎癥細胞,以及各種相關的組織細胞。腫瘤的發展是由癌癥細胞和其他細胞之間的互相串擾,進而控制TME中的免疫細胞數量與活性。腫瘤的代謝特征之一是有氧糖酵解代謝產物乳酸的大量積聚。腫瘤細胞引起大量乳酸積聚,這是TME的顯著特征。研究表明乳酸不僅是代謝重新編程的副產品,而且是一種關鍵的TME信號分子。TME中乳酸的含量與腫瘤轉移和腫瘤免疫逃逸密切關聯[17]。腫瘤由此導致免疫抑制,從而促進腫瘤的進展。因此,酸性TME微環境對腫瘤的影響已成為腫瘤研究熱點。研究證實,在腫瘤組織中,乳酸鹽通過PGC-1α介導的氧化磷酸化調控腫瘤增殖[18]。此外,乳酸通過調節腫瘤細胞生長、轉移和維持乳腺癌特異性能量代謝的HCAR1途徑促進腫瘤進展[19]。此外,CD147-K234是一種糖蛋白,通過提高乳酸產量,控制細胞代謝和促進非小細胞肺癌(NSCLC)進展[20]。有研究表明,乳酸參與子宮內膜癌TME形成,以及參與腫瘤生長和血管生成[21]。高乳酸水平與高子宮內膜癌復發率密切相關。然而乳酸在子宮內膜癌TME中的調節機制有待深入調查。本研究結果顯示,巨噬細胞過表達組TNF-α和iNOS水平低于對照組,而CD206和CD163水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),且敲低組TNF-α和iNOS水平高于對照組,而CD206和CD163水低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。筆者進一步探究PKM2是否也參與了乳酸調控TME過程,首先把過表達或敲低PKM2的黑色素瘤細胞與巨噬細胞共培養,結果發現過表達組TNF-α和iNOS水平低于對照組,而CD206和CD163水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),提示PKM2可顯著促進巨噬細胞M2轉變;敲低組TNF-α和iNOS水平高于對照組,而CD206和CD163水低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),提示敲低PKM2后巨噬細胞M2標志物CD206表達受到抑制;流式細胞實驗結果顯示,敲低PKM2后巨噬細胞M2標志物CD206表達受到抑制,對照組平均熒光強度(MFI)為32.5,敲低組MFI值24.6;過表達PKM2后則M2標志物CD206表達明顯增多,對照組MFI值為23.6,過表達組MFI值為48.9。以上結果提示PKM2介導了巨噬細胞M1/M2轉變進程,可能通過影響TME促進了黑色素瘤進展。

總之,本研究發現PKM2在黑色素瘤發生轉移組中表達上調,在黑色素瘤轉移中發揮重要的促進作用。進一步研究發現PKM2以乳酸依賴方式促進黑色素瘤細胞侵襲與遷移。更重要的是,PKM2介導了巨噬細胞M1/M2轉變進程,是重塑黑色素瘤TME重要參與分子之一。然而,本研究涉及的分子機制尚不深入,PKM2通過何種機制導致黑色素瘤侵襲與遷移能力的增加,以及如何調控巨噬細胞M1/M2轉變的深層分子機制等問題,均需要進行更深入的研究與探討。