利多卡因通過抑制NETs改善阿霉素引起的心臟毒性

陳 鈴,孟 文,朱 霞,劉文濤,何學(xué)明

1.蚌埠醫(yī)科大學(xué)附屬連云港市東方醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,江蘇連云港 222042;2.江蘇省連云港市東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇連云港 222042;3.南京醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 211100;4.江蘇省連云港市東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,江蘇連云港 222042

癌癥一直是困擾人們的一大難題,其中由化療藥物引起的心臟毒性是癌癥患者死亡的重要原因之一,病死率僅次于復(fù)發(fā)性惡性腫瘤[1]。所有化療藥物包括靶向藥物都有潛在的心臟毒性,表現(xiàn)為亞臨床左室功能障礙、充血性心力衰竭、心肌缺血甚至心臟猝死等。在眾多化療藥物中,蒽環(huán)類是目前應(yīng)用最廣泛的一類化療藥物,其代表性藥物阿霉素的抗癌作用強(qiáng),化療指數(shù)高,臨床上用于治療各種實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤,但因其心臟毒性嚴(yán)重限制了臨床應(yīng)用[2]。因此,尋找阿霉素化療性心臟病新的治療方案極其迫切。

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)是中性粒細(xì)胞的一種不同于凋亡和壞死的新型死亡方式,也是一種新型的防御模式。NETs是從中性粒細(xì)胞排出的網(wǎng)狀復(fù)合物,由游離脫氧核糖核酸 (DNA)、組蛋白和中性粒細(xì)胞顆粒蛋白組成。中性粒細(xì)胞通過排出嵌入瓜氨酸組蛋白3(CitH3)、髓過氧化物酶DNA(MPO-DNA)和其他細(xì)胞內(nèi)分子的細(xì)胞外染色質(zhì)來產(chǎn)生NETs。NETs成分通常起抗菌作用,但過量的NETs是有害的,并可能導(dǎo)致炎癥和組織損傷[3]。NETs大量分泌,引起游離DNA(cf-DNA)和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)同時(shí)釋放,細(xì)胞cf-DNA 和組蛋白促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子釋放,導(dǎo)致嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)[4]。利多卡因?qū)儆诩?xì)胞鈉通道抑制劑,可用于局部麻醉及抗快速性心律失常。有研究發(fā)現(xiàn)利多卡因還具有抗腫瘤的作用[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)采用利多卡因麻醉的患者血液中NETs水平降低,提示利多卡因可能具有降低NETs生成的功能[6]。因此提出假說“利多卡因可能通過抑制NETs緩解阿霉素引起的心臟毒性”。本研究旨在探究利多卡因?qū)Π⒚顾卣T導(dǎo)的心臟毒性的保護(hù)作用機(jī)制,為臨床有效預(yù)防化療性心臟病提供新的思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 30只SPF級 C57BL/6小鼠購于河南斯克貝斯生物有限科技股份有限公司,體質(zhì)量16～20 g,6周齡,雌性,小鼠可以自由獲取食物和水,環(huán)境溫度21～25 ℃,相對適度50%～60%,每籠5～6只,籠子底部有柔軟的墊層。實(shí)驗(yàn)中小鼠飼養(yǎng)及取材均符合相關(guān)規(guī)定。

1.2主要試劑和儀器 鹽酸多柔比星(GLPBio,GC16994)、利多卡因粉劑(GLPBio,GC17608);重組Anti-Histone H3抗體 [RM1001](Abcam,ab281584);髓過氧化物酶(MPO)抗體(武漢三鷹,81610-1-RR);Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司);Centrifuge5810R多功能大容量高速離心機(jī)(美國Eppendorf公司);低速自動平衡離心機(jī)(美國Eppendorf公司);CitH3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(MM-13757H1)、MPO-DNA 復(fù)合物ELISA試劑盒(MM-2467H1)。

1.3方法

1.3.1小鼠心臟毒性模型的建立與分組 30只小鼠隨機(jī)分為對照組、阿霉素組(DOX組)和利多卡因+阿霉素組(LIDO+DOX組),每組10只。對照組：給予小鼠腹腔注射生理鹽水1 mL/100g;DOX組：予以20 mg/kg單次腹腔注射阿霉素制備急性心臟毒性模型,阿霉素給藥劑量參考文獻(xiàn)[7];LIDO+DOX組：予以小鼠尾靜脈注射利多卡因6 mg/kg,間隔30 min后腹腔注射阿霉素20 mg/kg。然后每24 h尾靜脈注射一次利多卡因,連續(xù)注射10 d。在第10天,用10%水合氯醛麻醉麻醉處死各組小鼠,手術(shù)剝離小鼠心臟組織,用福爾馬林固定液保存。眼眶取血留存待測。

1.3.2臨床標(biāo)本收集與處理 收集連云港市東方醫(yī)院10例未接受過阿霉素類化療藥物患者(未接受組)和10例接受過阿霉素類化療藥物患者(接受組)的外周血標(biāo)本,將外周血標(biāo)本離心(1 000 r/min,15 min),分離血清,置于-80 ℃條件下保存,用于后續(xù)研究。

1.3.3cfDNA、CitH3、MPO-DNA的檢測 采集各組小鼠血漿標(biāo)本,置于有肝素抗凝劑的試管內(nèi),3 000 r/min離心5 min,分離血漿,置于-80 ℃條件下保存待測;使用ELISA檢測血漿中cf-DNA、CitH3、MPO-DNA水平。所有程序均嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,顯色后在酶標(biāo)儀450 nm 波長下測定吸光度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品MPO-DNA、CitH3、cf-DNA水平。使用人專用ELISA試劑盒檢測患者血清MPO-DNA、CitH3、cf-DNA水平。

1.3.4免疫熒光(IF)檢測各組小鼠心臟組織中NETs相關(guān)標(biāo)志物中MPO、CitH3的表達(dá)量 脫蠟水化后將小鼠心臟組織切片浸入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中行抗原修復(fù)。3%H2O2溶液中浸泡15 min后,PBS沖洗3次,每次5 min。加入一抗4 ℃孵育過夜。加入二抗,放入濕盒中,37 ℃放置20 min,PBS沖洗。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)工作液顯色,蘇木精-伊紅復(fù)染,然后進(jìn)行1%鹽酸分化、脫水、透明、中性樹脂封片。脒基苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞核用奧林巴斯顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.5各組小鼠心肌細(xì)胞損傷評估 通過全自動分析儀檢測各組小鼠血清中磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。

2 結(jié) 果

2.1未接受組和接受組患者血清cf-DNA、MPO-DNA、CitH3的水平比較 接受組患者血清中cf-DNA、MPO-DNA和CitH3水平均明顯高于未接受組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 未接受組和接受組患者血清cf-DNA、MPO-DNA、CitH3水平比較

2.2各組小鼠血清CK、CK-MB水平比較 DOX組小鼠血清CK、CK-MB水平明顯高于對照組和LIDO+DOX組小鼠(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清CK、CK-MB水平比較

2.3各組小鼠血漿cf-DNA、MPO-DNA、CitH3水平比較 DOX組與LIDO+DOX組小鼠血漿MPO-DNA、CitH3和cf-DNA水平明顯高于對照組(P<0.05),但LIDO+DOX組小鼠血漿MPO-DNA、CitH3和cf-DNA水平明顯低于DOX組(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血漿cf-DNA、MPO-DNA、CitH3水平比較

2.4各組小鼠心肌組織中MPO、CitH3表達(dá)量比較 DOX組小鼠心肌組織中MPO和CitH3表達(dá)量明顯高于對照組和LIDO+DOX組小鼠(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠心肌組織中MPO、CitH3表達(dá)量比較

3 討 論

阿霉素的化療雖是癌癥治療的基石,但其臨床應(yīng)用和治療價(jià)值卻受到嚴(yán)重心臟毒性的阻礙,其結(jié)果甚至導(dǎo)致左心室功能障礙和充血性心力衰竭[8]。阿霉素引起的心臟毒性特別是急性心臟毒性引起的各種心律失常,包括室速、室顫、室緩等,均是癌癥患者猝死的主要臨床表現(xiàn)。但在如今的大部分癌癥化療中,用于治療乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其他各種癌癥時(shí),阿霉素都有一定療效。其主要機(jī)制為藥物本身抑制DNA合成的毒性作用、氧自由基(ROS)導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和心肌細(xì)胞線粒體DNA的損傷作用及心臟轉(zhuǎn)錄因子的失調(diào)[9],這也是引起細(xì)胞衰老的主要機(jī)制。有研究表明細(xì)胞衰老在介導(dǎo)化療性心臟病方面起著核心作用[10],明確細(xì)胞衰老機(jī)制會打開化療性心臟病新型預(yù)防方法的大門。

BINET等[11]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞會生成一種特殊的形態(tài)NETs,NETs不僅可以介導(dǎo)缺氧、無菌性炎癥和氧化應(yīng)激等多種損傷,而且與衰老的病理性血管密切相關(guān)。NETs在中性粒細(xì)胞受到強(qiáng)烈刺激后,被主動快速釋放到細(xì)胞外來包裹及殺傷外來入侵的病原體。雖然具有消除病原體作用,但NETs對宿主組織的損傷也是不能忽略的：通過促進(jìn)自身免疫的發(fā)展并導(dǎo)致其他功能失調(diào),包括細(xì)胞轉(zhuǎn)移、血栓形成和不適當(dāng)凝血[12]。尤其是血栓和不適當(dāng)凝血造成的缺血缺氧,最終引起大量ROS和炎癥因子的產(chǎn)生,又會進(jìn)一步加劇NETs的形成,這一種惡性循環(huán)的病理過程在新型冠狀病毒感染、腫瘤、糖尿病、關(guān)節(jié)炎等多種疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在新型冠狀病毒感染中,血管內(nèi)NETs的釋放可能引發(fā)微血栓形成,其中cf-DNA水平的升高與MPO和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的其他特異性標(biāo)志物有關(guān)[13]。在心血管疾病中,已經(jīng)明確NETs促進(jìn)動脈粥樣硬化、心肌梗死及缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展[14]。本研究中,通過收集未接受DOX化療和接受過阿奇霉素化療患者的血清并檢測NETs相關(guān)標(biāo)志物MPO-DNA、CitH3和cf-DNA的水平,發(fā)現(xiàn)接受阿奇霉素化療后的患者血清中MPO-DNA、CitH3和cf-DNA水平明顯升高。在此之前,TODOROVA等[15]研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性的乳腺癌患者血中Nets水平升高。而后筆者檢測到阿奇霉素建模小鼠血漿NETs水平的升高同樣驗(yàn)證了這個觀點(diǎn)。

本研究檢測了利多卡因預(yù)處理后使用DOX干預(yù)的小鼠血清中CK及CK-MB的水平,與DOX組比較,利多卡因預(yù)處理后的小鼠心肌損傷明顯減輕。LI等[16]研究提出白細(xì)胞介素-37通過抑制中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱的形成來減輕柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的心肌損傷;REN等[17]在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在圍術(shù)期用利多卡因和右美托咪定靜脈輸注可降低肺癌患者NETs和腫瘤轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物的血清水平。這與本研究在利多卡因預(yù)處理后加入DOX相比僅用阿奇霉素處理后的小鼠心臟組織中的MPO-DNA、CitH3和cf-DNA表達(dá)量降低相一致。進(jìn)一步支持了利多卡因抑制NETs生成可緩解心肌損傷的結(jié)論。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利多卡因可通過激活A(yù)MPK-SOCS3信號通路,通過抑制組織因子和改善循環(huán)而緩解急性肺損傷[18]。有報(bào)道提出利多卡因通過AMPK-SOCS3抑制神經(jīng)炎癥從而緩解嗎啡耐受[19];利多卡因與腺苷配合能增加失血性休克的存活率,其中p-AMPK的水平增加[20]。利多卡因又可以通過激活A(yù)MPK增加SOCS3的表達(dá),最終抑制ASK1、組織因子和基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(MMP-2/9)表達(dá),達(dá)到緩解膿毒癥引起的急性肺損傷的目的[18]。劉海波等[21]還發(fā)現(xiàn)利多卡因預(yù)處理可以明顯改善心肌損傷小鼠死亡率。但是利多卡因如何通過調(diào)控AMPK-SOCS3信號通路來影響NETs,其具體機(jī)制仍不明確。本研究已初步證實(shí)了利多卡因?qū)Π⒚顾匾鸬男呐K毒性具有緩解作用,為化療患者的心臟保護(hù)用藥提供了新思路,具有重要的臨床意義。

綜上所述,本研究推測NETs的表達(dá)影響阿霉素心臟毒性,并且證實(shí)利多卡因可以通過抑制NETs的表達(dá)顯著降低小鼠心臟毒性。利多卡因影響NETs生成的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。