荊防顆粒對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的保護作用

劉冬光，趙文學#，徐 燕*，姚 茹，孟 雪，姚景春，劉 忠*

荊防顆粒對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的保護作用

劉冬光1, 2, 3，趙文學1, 2, 3#，徐 燕1, 2, 3*，姚 茹1, 2, 3，孟 雪1, 2, 3，姚景春1, 2, 3，劉 忠1, 2, 3*

1. 魯南制藥集團股份有限公司 新藥藥理中心，山東 臨沂 276006 2. 經(jīng)方與現(xiàn)代中藥融合創(chuàng)新全國重點實驗室，山東 臨沂 276006 3. 臨沂市天然藥物免疫藥理毒理重點實驗室，山東 臨沂 276006

探討荊防顆粒對db/db小鼠血糖代謝的調(diào)控作用及對其視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopaphy，DR）的保護作用。將60只雄性db/db小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍（120 mg/kg）組及荊防顆粒（1、2 g/kg）組，每組15只，另取15只雄性db/m小鼠作為對照組，每周檢測小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、攝食量及飲水量等基礎指標，并在實驗結(jié)束后進行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）；采用ELISA檢測小鼠視網(wǎng)膜組織白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用PAS染色檢測視網(wǎng)膜組織病理變化；采用Western blotting檢測視網(wǎng)膜組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、緊密連接跨膜蛋白（Claudin-1）、胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）、磷酸化IRS1（phosphorylated IRS1，p-IRS1）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）蛋白表達。與對照組比較，模型組小鼠空腹血糖、攝食量、飲水量明顯升高（＜0.01），OGTT中曲線下面積（AUC）顯著升高（＜0.01）；視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量顯著升高（＜0.01），CAT、SOD活性顯著下降（＜0.01）；視網(wǎng)膜組織周細胞降低，新生血管增多（＜0.01），并且視網(wǎng)膜組織中Claudin-1、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白表達下調(diào)（＜0.01），VEGF、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達上調(diào)（＜0.01）。與模型組比較，荊防顆粒組小鼠體質(zhì)量明顯升高（＜0.05、0.01），空腹血糖、攝食量、飲水量均有不同程度下降（＜0.05、0.01）；視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA含量顯著下降（＜0.05、0.01），CAT、SOD活性顯著上升（＜0.05、0.01）；視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)有所改善，視網(wǎng)膜組織中Claudin-1、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白表達顯著上調(diào)（＜0.05、0.01），VEGF、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達顯著下調(diào)（＜0.05、0.01）。荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜病變具有一定的改善作用，其作用機制可能為調(diào)節(jié)小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF及Claudin-1蛋白表達，進而激活胰島素受體IRS-1/PI3K/Akt信號通路，啟動Caspase級聯(lián)反應，抑制視網(wǎng)膜上皮細胞的凋亡，從而對視網(wǎng)膜病變起到一定的保護作用。

荊防顆粒；糖尿病；視網(wǎng)膜；氧化應激；凋亡；IRS-1/PI3K/Akt通路

伴隨著人們生活質(zhì)量的提高，糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，糖尿病主要表現(xiàn)為血糖過高及一系列相關(guān)癥狀，是血糖自平衡失調(diào)而引起的慢性代謝性綜合征[1]，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopaphy，DR）是糖尿病微血管病變中最常見的表現(xiàn)，是一種具有特異性改變的眼底病變。DR是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計，我國糖尿病人群中DR的患病率為20.86%，因DR臨床癥狀較少而不被人們重視，但隨著DR能夠嚴重影響患者視力，甚至存在致盲的風險，現(xiàn)已逐漸進入研究范疇[2-3]。

DR的發(fā)病機制尚不十分明確，推測其機制主要涉及氧化應激、炎癥反應、新血管生成及視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡等過程[4]。一方面，當機體的高糖不能通過正常途徑降解時，會激活細胞多元醇途徑，從而使細胞內(nèi)形成高滲透狀態(tài)，損傷視網(wǎng)膜的微循環(huán)。同時，視網(wǎng)膜內(nèi)的高糖環(huán)境會促進糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的形成，從而進一步激活活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號通路，促進周細胞和內(nèi)皮細胞的凋亡。另一方面，高血糖環(huán)境還能夠激活胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）途徑，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達，促進視網(wǎng)膜新生血管生成[5-6]。

目前臨床治療DR的方法主要包括使用各類控制代謝的藥物和激素、激光治療及玻璃體切割術(shù)等[7]。但由于DR發(fā)病機制的復雜性，藥物及手術(shù)治療都存在一定的局限性。傳統(tǒng)藥物治療DR并不能起到根治作用[8]，且藥物治療可能引發(fā)胃腸道反應、高熱等不良反應；而激光光凝術(shù)雖然能有效降低DR分期并提升臨床有效率[9]，但其不適用于嚴重玻璃體積血或視網(wǎng)膜前出血的患者，且可能造成患者永久性視網(wǎng)膜損傷及不同程度的視力下降[10]。因此，探尋不良反應低、療效好的藥物已成為糖尿病治療的首要問題，傳統(tǒng)中醫(yī)認為DR屬于“視瞻昏渺”“云霧移睛”等范疇，稱其為“消渴內(nèi)障”，中醫(yī)的基本治則是“益氣養(yǎng)陰，活血化瘀通絡”。越來越多的研究表明，中藥單體、組方以及中成藥可通過多種機制共同作用于DR，有效改善其臨床癥狀。陳晶等[11]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達，從而抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變；桃紅四物湯聯(lián)合激光治療能夠增加患者血清中一氧化氮合酶水平，降低血清中VEGF和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平[12]；荊防顆粒由荊芥、防風、羌活、獨活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草等組成，可通過影響谷氨酸代謝、能量代謝、葡萄糖代謝等通路調(diào)節(jié)蕁麻疹誘導的免疫系統(tǒng)紊亂，且藥理學實驗證實其能通過調(diào)節(jié)機體免疫功能，干預免疫性炎癥反應等作用發(fā)揮抗炎作用[13-16]。因此本研究基于DR的發(fā)病機制，對荊防顆粒治療DR的療效及作用機制進行研究，旨在為中藥治療DR提供研究證據(jù)和思路。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性db/db小鼠（8～12周、體質(zhì)量40～42 g），SPF級雄性db/m小鼠（8～12周，體質(zhì)量25～27 g），均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011。小鼠飼養(yǎng)于魯南制藥集團股份有限公司新藥安評中心（GLP）屏障區(qū)大、小鼠實驗室，動物使用許可證號SYXK（魯）2018-0008。飼養(yǎng)條件為室溫20～26 ℃，日溫差≤4 ℃；相對濕度40%～70%；人工照明，12 h/12 h明暗交替；換氣次數(shù)≥15次/ h；飼喂SPF大小鼠生長繁殖飼料，自由飲水和飲食。動物實驗經(jīng)魯南制藥集團股份有限公司實驗動物管理與使用委員會批準（批準號AN-IACUC-2020-034）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（批號802230115）由魯南制藥集團股份有限公司提供；鹽酸二甲雙胍腸溶片（批號H52020955）購自貴州圣濟堂制藥有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（批號P0010S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號2118S）、p-IRS1抗體（批號2385S）、IRS-1抗體（批號3089S）、PI3K抗體（批號4255S）、p-PI3K抗體（批號17366S）、Akt抗體（批號9272S）、p-Akt抗體（批號4060S）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號3498S）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號2772S）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號9661S）均購自美國CST公司；VEGF抗體（批號MA5-13182）、Claudin-1抗體（批號PA1-37465）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號A0208）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號A0216）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號ml003057）、小鼠IL-6試劑盒（批號ml102828）、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號ml002859）、小鼠過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號ml037079）、小鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號ml059387）、小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號ml077384）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 儀器

EVOS FL型顯微鏡、Multiskan FC酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ONETOUCH強生-穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀[強生（中國）醫(yī)療器材有限公司]；WP-UP-1840型超純水機（沃特浦）；1645050型電泳儀[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司]；FL1000型蛋白成像系統(tǒng)（上海哈靈生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

動物適應性飼養(yǎng)1周后，以db/m小鼠作為對照組，db/db小鼠按血糖值隨機分為模型組、二甲雙胍（120 mg/kg）組和荊防顆粒（1、2 g/kg，分別相當于臨床等效劑量的1、2倍）組，每組15只。各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水（10 mL/kg），1次/d，連續(xù)6周。

2.2 基礎指標檢測

每周定時禁食6 h后，對各組小鼠的體質(zhì)量、血糖值、攝食量及飲水量進行檢測。

2.3 口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）

末次給藥前禁食6 h，并在給藥1 h后ig 4 g/kg的葡萄糖溶液，檢測各組小鼠在0、30、60、90、120 min后的血糖值變化[17]。

2.4 視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平及CAT、SOD活力的檢測

于實驗結(jié)束后，各組小鼠腹主動脈取血后，取各組小鼠視網(wǎng)膜組織制備勻漿液，3 200×離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書測定視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平及CAT、SOD活力[18-21]。

2.5 PAS染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)學變化

實驗結(jié)束后，取各組小鼠眼組織，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，流水輕輕沖洗5 min，從睫狀體后部經(jīng)鋸齒緣環(huán)形剪開鞏膜，去除眼前節(jié)部分，隨后將后眼杯以視乳頭為中心切3瓣，輕輕分離出視網(wǎng)膜，將分離出的視網(wǎng)膜用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）輕輕漂洗10 min，加入3%胰蛋白酶于37 ℃恒溫箱消化2 h，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）漂洗，當僅剩下一層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)時，將其取出并平鋪于載玻片上，置于37 ℃展片器上5 min，以利于血管網(wǎng)展開[22]。用流水輕輕沖洗視網(wǎng)膜消化鋪片5 min，隨后加入PAS氧化劑處理5 min，流水輕輕沖洗5 min，以除去殘留的氧化劑，擦干載玻片上多余的水分后滴加Schiff染液，染色10 min，流水沖洗5 min，隨后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)[23]。

2.6 Western blotting檢測視網(wǎng)膜組織中VEGF、Claudin-1、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達

實驗結(jié)束后，取各組小鼠眼組織并迅速分離出視網(wǎng)膜，按1∶6的比例加入RIPA裂解液，于組織研磨儀以4 ℃、1 200 r/min研磨10 min，隨后以4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，次日PBST洗膜后，加入二抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜后，加適量的ECL發(fā)光液顯影，并分析蛋白條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 荊防顆粒對db/db小鼠體質(zhì)量和血糖的影響

如圖1-A所示，對照組小鼠體質(zhì)量呈平緩上升趨勢，db/db小鼠在實驗初期（0～3周）體質(zhì)量均有所增加，但各組之間無顯著性差異。與模型組比較，第4周荊防顆粒（2 g/kg）組及二甲雙胍組小鼠體質(zhì)量顯著升高（＜0.05），第5～6周各給藥組小鼠體質(zhì)量均顯著升高（＜0.05、0.01）。

如圖1-B所示，與對照組比較，模型組小鼠各時間點空腹血糖均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，給予二甲雙胍干預2周后，小鼠空腹血糖顯著下降（＜0.05、0.01）；給予荊防顆粒干預3周后，小鼠空腹血糖顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.2 荊防顆粒對db/db小鼠攝食量和飲水量的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠攝食量及飲水量明顯增多（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠在給藥3周后攝食量及飲水量均有不同程度的減少（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同。

圖2 荊防顆粒對db/db小鼠攝食量和飲水量的影響(, n = 15)

3.3 荊防顆粒對db/db小鼠OGTT的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠各時間點血糖值均顯著升高（＜0.01），曲線下面積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，荊防顆粒（1 g/kg）組小鼠在0、60、90、120 min時血糖值均顯著下降（＜0.05），荊防顆粒（2 g/kg）組和二甲雙胍組小鼠各時間點血糖值均顯著下降（＜0.05、0.01），各給藥組曲線下面積均顯著下降（＜0.05、0.01）。

3.4 荊防顆粒對視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平及CAT、SOD活力的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平均顯著降低（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒對糖尿病引起的視網(wǎng)膜炎性反應具有明顯的改善作用。

圖3 荊防顆粒對db/db小鼠OGTT的影響(, n = 15)

圖4 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響(, n = 7)

如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中MDA含量明顯升高（＜0.01），CAT、SOD活性均顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組MDA含量明顯下降（＜0.05、0.01），CAT、SOD活性均明顯升高（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能夠增強db/db小鼠視網(wǎng)膜組織的抗氧化能力，減輕機體氧化應激損傷。

3.5 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)的影響

如圖6所示，對照組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)無異常改變；與對照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)微動脈瘤、非細胞毛細血管增多、內(nèi)皮細胞增生以及周細胞選擇性丟失（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜未見微動脈瘤組織，并且非細胞毛細血管減少，內(nèi)皮細胞增生減少及周細胞丟失率明顯下降（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜并發(fā)癥具有良好的改善作用。

3.6 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、Claudin-1蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），Claudin-1蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01），Claudin-1蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.7 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達的影響

如圖8所示，與對照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜組織中p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖5 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織MDA含量及CAT、SOD活力的影響(, n = 7)

圖7 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、Claudin-1蛋白表達的影響(, n = 15)

圖8 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達的影響(, n = 15)

3.8 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

如圖9所示，與對照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），Bcl-2/Bax值顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），Bcl-2/ Bax值顯著升高（＜0.05、0.01）。

4 討論

隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，DR是一種常見和特殊的糖尿病微血管并發(fā)癥，是導致患者視網(wǎng)膜出現(xiàn)慢性損傷，最終導致患者視力模糊，甚至失明的主要原因[24]，因此糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥已逐漸成為日益突出的社會健康問題，其病因復雜，患者由于體內(nèi)長期的高糖反應，導致機體視網(wǎng)膜等多種器官出現(xiàn)炎癥反應[25]，因此開展糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥的研究有著重大的意義[26-29]。

隨著近幾年的研究發(fā)展，DR已被認為是一種長期低炎癥導致的微血管疾病，可導致糖尿病視網(wǎng)膜缺血、血管通透性增加、視網(wǎng)膜新生血管增生及糖尿病黃斑水腫等表現(xiàn)[30]，其中細胞內(nèi)發(fā)生炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡是導致DR發(fā)生及發(fā)展的主要元兇，炎癥因子水平上調(diào)能夠激活VEGF/ Claudin-1、IRS-1/PI3K/Akt、Caspase-3等通路，從而引起視網(wǎng)膜內(nèi)新生血管增加，毛細血管通透性增加，進而發(fā)生BRB滲漏，最終導致患者失明[31]，本研究通過db/db小鼠模型探討荊防顆粒對小鼠DR的早期保護作用。

圖9 荊防顆粒對db/db小鼠視網(wǎng)膜組織Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達的影響(, n = 15)

據(jù)報道，VEGF是最有效的促血管生長因子，在高血糖狀態(tài)下可改變視網(wǎng)膜微環(huán)境，導致缺氧引起內(nèi)皮細胞功能異常，從而上調(diào)VEGF的表達，VEGF上調(diào)可誘導視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞通透性增加，下調(diào)內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白Claudin-1的表達，進而導致視網(wǎng)膜新生血管生成[32]。Zhang等[33]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制VEGF的表達，可阻止血管的生成，改善DR。也有文獻報道IL-6可促進內(nèi)皮細胞通透性增加，與VEGF等產(chǎn)生協(xié)同作用，最終導致新生血管形成及微導管閉塞，加快DR的進展[34]。TNF-α也可引起VEGF水平的提高，使視網(wǎng)膜通透性有所增加，同時誘發(fā)新生血管[34]。SOD是維護內(nèi)皮細胞和血管功能的關(guān)鍵酶，也是主要的自由基清除劑，在胰島β細胞內(nèi)高度集中，維持β細胞在體內(nèi)的平衡[35]。MDA是膜脂過氧化的一種重要產(chǎn)物，可以使視網(wǎng)膜細胞通透性和流通性改變，最終導致其結(jié)構(gòu)的改變。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)中藥治療后糖尿病大鼠靜脈血清SOD、MDA值均有顯著性改變[36]，本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA含量升高，CAT、SOD活性下降，同時VEGF表達上調(diào)，Claudin-1表達下調(diào)，給予荊防顆粒處理可顯著改善上述異常指標。

IRS-1/PI3K/Akt作為胰島素抵抗的經(jīng)典信號通路，是其調(diào)節(jié)血糖平衡的重要信號通路之一[37-38]，IRS-1是胰島素受體激活后發(fā)生級聯(lián)反應的重要因子，也是參與胰島素等重要細胞因子信號轉(zhuǎn)導的磷酸化蛋白，參與調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導，同時也參與著細胞的生長代謝過程，當胰島素受體底物被激活，會促進IRS-1蛋白磷酸化，促使下游PI3K/Akt信號通路被激活[39]，活化的PI3K參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種功能，Akt作為PI3K信號通路的主要下游信號傳導物，活化后在胰島素傳導通路中也扮演著重要的降血糖功能，并且激活的IRS-1/PI3K/Akt信號通路可以增加體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移，促進糖原代謝，從而達到降血糖的目的[40]，本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中p-IRS1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達下調(diào)，給予荊防顆粒處理可顯著上調(diào)其表達水平。

有文獻表明，視網(wǎng)膜與視神經(jīng)中含有大量的線粒體，為視覺信號傳導和細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運提供三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）[41]，細胞凋亡損傷視網(wǎng)膜細胞及血管功能，不可避免地引起DR的進展[42]。Caspase正常情況下以酶原形式位于細胞質(zhì)中，并無活性，當收到凋亡信號的刺激后，可被激活，裂解為有酶解活性的異二聚體，并通過裂解特異底物和激活內(nèi)源性核酸酶，進而引起細胞凋亡[43]。細胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，是線粒體凋亡通路激活的標志[44]。在正常情況下，Cyt-C主要存在于線粒體內(nèi)外膜之間的腔隙內(nèi)，當線粒體損傷時，Cyt-C從線粒體膜間隙釋放到細胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）結(jié)合形成寡聚體復合物，進一步結(jié)合Caspase-9酶原形成凋亡體，Caspase-9活化后能激活下游Caspase-3，從而啟動細胞凋亡[45]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織中Bax、cleaved Caspase-3表達上調(diào)、Bcl-2表達下調(diào)，給予荊防顆粒處理可顯著下調(diào)Bax、cleaved Caspase-3的表達水平，上調(diào)Bcl-2的表達水平，由此推測，荊防顆粒可通過激活VEGF/Claudin-1、IRS1/PI3K/Akt、Caspase-3等信號通路，發(fā)揮視網(wǎng)膜的保護作用。

綜上，荊防顆粒緩解DR的機制已初步明確，前期亦有文獻表明，防風通圣散聯(lián)合二甲雙胍片可治療腹型肥胖2型糖尿病[46]，桂枝茯苓丸對于治療DR也具有很好的療效，可有效改善糖尿病大鼠眼底病變[47]，同時，丹參川芎嗪注射液可用于治療2型糖尿病血管病變的臨床觀察，并且能有效降低血糖、血脂、糖化血紅蛋白及血液流變學等指標[48]，由此推測荊防顆粒發(fā)揮抗DR藥效的成分主要為防風、羌活、川芎、茯苓等，但其具體的作用靶點還需進一步深入研究，為DR的臨床治療提供更多的科學依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect of Jingfang Granules on retina of diabetic mice

LIU Dongguang1, 2, 3, ZHAO Wenxue1, 2, 3, XU Yan1, 2, 3, YAO Ru1, 2, 3, MENG Xue1, 2, 3, YAO Jingchun1, 2, 3, LIU Zhong1, 2, 3

1. New Drug Pharmacology Center of Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 2. State Key Laboratory of Integration and Innovation of Classic Formula and Modern Chinese Medicine, Linyi 276006, China 3. Linyi Key Laboratory of Immunopharmacology and Toxicology of Natural Drugs, Linyi 276006, China

To investigate the regulation of Jingfang Granules (荊防顆粒) on blood glucose metabolism and protective effect of diabetic retinopaphy (DR) in db/db mice.A total of 60 male db/db mice were randomly divided into model group, metformin (120 mg/kg) group, Jingfang Granules (10, 20 mg/kg) groups, with 15 mice in each group, and 15 male db/m mice were selected as control group. The basic indexes such as body weight, fasting blood glucose, food intake and water intake of mice were detected weekly. After the experiment, oral glucose tolerance test (OGTT) was detected; The levels of interleukin-1β (IL-1β), IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α), malondialdehyde (MDA) and the activities of catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in mouse retinal tissue were detected by ELISA; PAS staining was used to detect the pathological changes of retinal tissue; Western blotting was used to detect the protein expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF), tight junction transmembrane protein (Claudin-1), insulin receptor substrate 1 (IRS1), phosphorylated IRS1 (p-IRS1), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phosphorylated PI3K (p-PI3K), protein kinase B (Akt), phosphorylated Akt (p-Akt), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 associated X protein (Bax), and cleaved cystein-asparate protease-3 (cleaved Caspase-3) in retinal tissue.Compared with control group, fasting blood glucose, food intake and water intake of mice in model group were significantly increased (< 0.01), AUC in OGTT was significantly increased (< 0.01); The levels of IL-1β, IL-6, TNF-α, MDA in retinal tissue were increased (< 0.01). CAT and SOD activities were decreased (< 0.01); The number of peripheral cells in retinal tissue was decreased and the number of new blood vessels was increased (< 0.01), protein expressions of Claudin-1, p-IRS1/IRS1, p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt and Bcl-2 were down-regulated (< 0.01), VEGF, Bax and cleaved Caspase-3 protein expressions were up-regulated (< 0.01). Compared with model group, body weight of mice in Jingfang Granules group was significantly increased (< 0.05, 0.01), fasting blood glucose, food intake and water intake were decreased to varying degrees (< 0.05, 0.01); The levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and MDA in retinal tissue were decreased (< 0.05, 0.01). CAT and SOD activities were increased (< 0.05, 0.01); The histopathologic morphology of retina was improved, and the protein expressions of Claudin-1, p-IRS1/IRS1, p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt, Bcl-2 in retinal tissue were up-regulated (< 0.05, 0.01), VEGF, Bax and cleaved Caspase-3 protein expressions were down-regulated (< 0.05, 0.01).Jingfang Granules can improve retinopathy in db/db mice to a certain extent, and its mechanism may be related to regulating the expressions of VEGF and Claudin-1 protein in retinal tissue of mice, thus activating the insulin receptor IRS-1/PI3K/Akt signaling pathway, initiating the Caspase cascade reaction, and inhibiting the apoptosis of retinal epithelial cells. Thus, it has a certain protective effect on retinopathy.

Jingfang Granules; diabetes; retina; oxidative stress; apoptosis; IRS-1/PI3K/Akt pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 2996 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.014

2023-11-04

山東省重大科技創(chuàng)新工程（2020CXGC010505，2021CXG010508）

劉冬光（1986—），男，碩士，中藥新藥研發(fā)與安全性評價。E-mail: 15866975281@163.com

趙文學（1994—），男，碩士，中藥新藥研發(fā)與安全性評價。E-mail: zwx940108@163.com

通信作者：徐 燕（1982—），女，碩士，中藥新藥研發(fā)與安全性評價。E-mail: xuyan119716@163.com

劉 忠（1975—），男，研究員，中藥新藥研發(fā)與安全性評價。E-mail: clevertree@163.com

[責任編輯 李亞楠]